BÁO CÁO KHOA HỌC: "NGHIÊN CỨU TẠO CÁC DẠNG TỨ BỘI THỂ Ở CÁC GIỐNG CÂY ĂN QUẢ CÓ MÚI ĐỊA PHƯƠNG" pdf

NGHIÊN CỨU TẠO CÁC DẠNG TỨ BỘI THỂ Ở
CÁC GIỐNG CÂY ĂN QUẢ CÓ MÚI ĐỊA PHƯƠNG

Hà Thị Thúy, Trần Ngọc Thanh, Đỗ Năng Vịnh
Viện Di truyền nông nghiệp
Vũ Văn Vụ
Đại Học quốc gia Hà nội


1. MỞ ĐẦU

Các giống được trồng phổ biến như cam Xã đoài, Sông
con, Vân du, Cam sành, Quýt chum, bưởi Phúc trạch là
các giống ưu việt, thích hợp với sản xuất ở nước ta, nhưng
có nhược điểm chung là nhiều hạt. Tính trạng có hạt làm
giảm giá trị thương mại của công nghiệp quả có múi. Do
vậy tạo giống citrus không hạt là mục tiêu quan trọng của
công tác giống.Một chiến lược tạo giống không hạt quan
trọng là tạo ra và tuyển chọn các giống tam bội thể từ các
phép lai giữa các giống tứ bội thể với các giống nhị bội
(Soost and Cameron, 1975; Starrantino and Reforgeiato-
Rucupero, 1981). Thí dụ thành công điển hình trong tạo
giống tam bội thể bằng phương pháp lai giữa các mức bội
thể là 2 giống bưởi chùm tam bội Oroblanco và Melogold
(Soost and Camerron, 1980, 1985). Nhưng tạo giống tam
bội không hạt có chất lượng cao gặp nhiều khó khăn do
thiếu nguồn gen tứ bội thể thích hợp.

Chọn tạo dòng tứ bội có thể thực hiện bằng nhiều phương
pháp khác nhau. Các dạng tứ bội xuất hiện tự nhiên với tần
số khá cao ở citrus. Cameron và Frost (1968) đã nhận được

2,5% số cây tứ bội thể trong tổng số 3600 cây từ phôi tâm ở
các giống khác nhau. Tachikawa và cộng sự (1961) đã sử
dụng colchicine để tạo cây quýt tứ bội thể và sau đó lai cây
tứ bội với cây nhị bội để tạo giống quýt tam bội không hạt.
Gần đây, các dạng tứ bội thuần (autotetraploid) đã được tạo
ra bằng xử lý colchicine in vitro (Gmitter and ling, 1991;
Gmitter et al., 1991). Các dạng dị tứ bội (allotetraploid) đã
được tạo ra thông qua lai tế bào trần (Grosser and Gmitter,
1990; Grosser et al., 1992b). Nhờ vậy các nhà tạo giống đã
có thêm số lượng lớn nguồn vật liệu di truyền bổ sung cho
tạo giống tam bội.

Mục tiêu nghiên cứu của Chúng tôi là tạo ra các dạng tứ bội
thể từ các giống cây ăn quả có múi địa phương nhằm làm
vật liệu cho tạo giống tam bội không hạt.

2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. Vật liệu nghiên cứu

Các giống citrus bản địa ưu việt đã được lựa chọn để xử lý:
Cam Vân du, Cam Sông con ( Citrus sinensis), Cam Sành (
C. nobilis), Quýt Chum ( C. Reticulata) và Bưởi Phúc trạch
(C. grandis). Chuẩn bị mỗi giống 400 cây loại 2 năm tuổi x
5 giống = 2000 cây. Các cây khoẻ, sức sống tốt, được trồng
dày cây cách cây 30cm x 50 cm, đã được dùng làm đối
tượng xử lý.

Chọn cành bánh tẻ, cắt hết lá và chồi ngọn, rửa sạch cành
trước khi xử lý từ 6 giờ; 12 giờ;1 ngày; 2 ngày; 3 ngày; 5

ngày đến 7 ngày nhằm mục đích phá ngủ chồi.

2.2 Phương pháp nghiên cứu

- Xử lý tạo ra sự đồng nhất trong phân chia tế bào ở chồi
ngủ trước khi xử lý cành bằng colchicin: a/Làm đứt rễ để
kích thích ra rễ đồng nhất và kết quả là gây bật chồi mới
đồng nhất. b/ Cắt toàn bộ lá và chồi ngọn của các cành cây
trước xử lý nhằm kích thích quá trình phân bào và bật chồi
ở chồi ngủ.

- Xác định trạng thái và mức độ nảy mầm của mắt chồi ngủ
bằng soi kính hiển vi quang học.

- Cành đã được xử lý colchicin với các thời gian ( 0h;12;
24h; 48h; 72h) và 7 nồng độ khác nhau (0; 0.05%; 0.1%;
0.2%; 0.3%; 0.4%; 0.5%), tổng số 35 công thức thí nghiệm
ở mỗi giống. Mỗi lô thí nghiệm gồm 10 cây, mỗi cây xử lý
1 cành, mỗi cành có nhiều chồi nách được ngâm vào dung
dịch.

- Pha dung dịch mẹ: Hoà tan 0.5g colchicin vào trong 100
ml nước cất tạo dung dịch mẹ 0.5%. Dung dịch này để
trong tối. Từ dung dịch mẹ pha loãng ra các nồng độ cần
dùng: 0.05%; 0.1%; 0.2%; 0.3%; 0.4%; 0.5%. Dung dịch
hoạt động bề mặt Tween được bổ sung: 1 giọt Tween cho
50ml dung dịch colchicin.

- Dung dịch colchicin được chứa trong một ống nhựa
đen.Cành được uốn cong, nhúng ngập trong dung dịch, sau

đó dùng băng dính đen dán kín miệng ống nhựa để tránh
dung dịch bốc hơi. Sau thời gian thí nghiệm, cành được rút
ra khỏi ống nhựa và được rửa sạch bằng nước sạch ba lần.

- Cành sau khi xử lý đã được quan sát để xác định ảnh
hưởng của colchicin lên các chỉ số phát triển cành: số cành
bị chết, số cành sống sót, số cành bật chồi, thời gian từ xử
lý đến bật chồi, số chồi có biến động hình thái và số chồi đa
bội hoá.Các chồi bật từ các mắt xử lý được đánh giá sự
thay đổi hình thái bằng mắt hoặc soi kính hiển vi.

- Lá và chồi có thay đổi hình thái so với đối chứng được
kiểm tra mức đa bội thể bằng máy đo đa bội thể ( Flow
cytomertty analysis)

3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Ảnh hưởng của colchicin lên một số chỉ tiêu sinh
trưởng của cành sau khi xử lý :

Chúng tôi đã tiến hành xử lý colchicin hàng loạt cành với
các thời gian và nồng độ colchicin khác nhau như đã mô tả
kỹ trong phần phương pháp. Các kết quả quan sát cho thấy:

- Sức sống và mức độ biến đổi hình thái của chồi phụ thuộc
rất nhiều vào nồng độ và thời gian xử lý colchicin.

- Với thời gian xử lý 12h ở nồng độ 0.05% và 0.1%: Khả
năng bật mầm và hình thái mầm không bị ảnh hưởng ( so
với đối chứng).

- Colchicin bắt đầu có biểu hiện ức chế đối với sự bật mầm
của cây ở nồng độ 0.05% trong thời gian 48 giờ. Khi nồng
độ và thời gian xử lý tăng lên thì tác động của colchicin
tăng đối với mẫu xử lý (số cành bị chết tăng, số cành sống
sót và số mắt bật chồi giảm, thời gian từ xử lý đến bật chồi
tăng).Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 1 .

- Ở nồng độ 0,05 % colchicin hầu như không có ảnh hưởng
gì đến sức sống của chồi ngay khi thời gian xử lý kéo dài
đến 48 và 72 giờ. Khi tăng nồng độ colchicin lên gấp hai
lần ảnh hưởng của nó đã biểu hiện rõ ngay ở thời gian xử lý
24 giờ. Khi nồng độ colchicin tăng lên 0,2% tỷ lệ nảy mần
của các giống giảm rất mạnh,ở nồng độ này với thời gian
xử lý 24 giờ tỷ lệ sống và nẩy mần của chồi ngủ ở các
giống đều giảm xuống dưới 50%: Bưởi Phúc Trạch 33%,
Cam Sành 31%, Sông Con 30%, Vân Du 21%, Quýt chum
22%.

- Liều lượng gây chết 100% có khác nhau đối với các giống
khác nhau: đối với Quýt Chum 100% mẫu xử lý chết ở
nồng độ 0.3%, thời gian xử lý từ 24 đến 72h. Đối với Cam
Vân du, Sông Con, Cam Sành, Bưởi Phúc trạch nồng độ
gây chết 100% là 0.3%, thời gian xử lý từ 48 h.

- Cây bắt đầu có hiện tượng dị dạng ở lá và mầm quan sát
thấy ở hầu hết các giống ở nồng độ từ 0.1%,thời gian xử lý
24 giờ.Hiện tượng cành có phiến lá dày hơn,bản lá rộng
hơn quan sát thấy nhiều nhất ở nồng độ colchicin 0,1%.
Bảng 1: Ảnh hưởng của thời gian và nồng độ xử lý

colchicin lên khả năng bật mầm và đa bội hoá của chồi sau
xử lý.




Ảnh 1: Cây cam Vân du tứ bội (phải) nhị bội (trái)


3.2. Cảm ứng khác nhau của các giống đối với các nồng
độ và thời gian xử lý colchicin khác nhau:

Phân tích số liệu trên bảng 1 và quan sát trực tiếp cây sau
xử lý trên đồng ruộng cho thấy các giống cây có múi khác
nhau có phản ứng khác nhau đối với nồng độ và thời gian
xử lý colchicin. Kết quả quan sát được ghi nhận trên bảng
2.
Bảng 2: So Sánh cảm ứng khác nhau của các giống đối với
colchicin.



Chúng tôi cũng đã tiến hành xử lý các chồi non và đỉnh
sinh trưởng của các giống trên đây bằng cách nhúng trực
tiếp chồi non vào colchicin trong thời gian 12 giờ; 24 giờ ở
nồng độ 0.05% và 0.1% nhưng không có hiệu quả vì các
chồi non cảm ứng rất mạnh với colchicin và đều bị chết. Vì
vậy phương pháp của chúng tôi chỉ tiến hành được đối với
các cành bánh tẻ chứa các mắt ngủ.

3.3. Xác định các cành tứ bôi thể sau khi xử lý colchicin:

Reuther và cộng sự (1968) đã mô tả các đặc trưng của các
dòng tứ bội thể tạo được từ các giống chanh, cam, quýt,
bưởi chùm và so sánh chúng với các giống nhị bội thể
tương ứng.Các đặc trưng khác biệt đó là:

- Số lượng nhiễm sắc thể của dòng tứ bội tăng gấp đôi ở
mỗi tế bào.

- Lá của dòng tứ bội có phiến lá rộng hơn, tỷ lệ rộng/ dài
lớn hơn so với giống nhị bội, phiến lá dày hơn,màu lá đậm
hơn.

- Số lượng hạt của cây tứ bội thường ít hơn so với cây nhị
bội.

Nghiên cứu của Frost (1926) mô tả các dạng tứ bội ở
chanh, Hamill và CS (1992) nghiên cứu ở chuối,
Chakraborti và CS, (1998) nghiên cứu ở dâu tằm cho thấy
các cây đa bội thường có trụ ngắn, xanh đậm, phiến lá dày
và rộng hơn ở các thể lưỡng bội tương ứng.
Căn cứ vào các kết quả nghiên cứu trên đây chúng tôi đã
tiến hành phân tích các biến đổi hình thái của các cây sau
xử lý. Các cành có lá dày hơn, phiến lá rộng hơn đã được
lấy mẫu lá để đo mức bội thể trên máy đo Flow Cytometry.
Kết quả đo mức bội thể cho thấy một số cây có lá dày,
phiến lá rộng ở 3 giống Bưởi Phúc Trạch, Cam Vân Du,
Cam sành là tứ bội thể. Tuy nhiên, nhiều tác giả cho biết
hiện tượng khảm mức bội thể ở cây sau xử lý colchicin là

rất thường gặp ( Reuther và CS,1968). Cây khảm mức bội
thể là cây có các mức bội thể khác nhau ở các tế bào, mô
hoặc cơ quan khác nhau trên cùng một cây. Qua quan sát
bằng mắt kết hợp với đo mức bội thể đã phát hiện thấy một
số các cành có phiến lá dày hơn,bản lá rộng hơn đã được đa
bội hoá ( tứ bội = 4n ) ở 3 giống Bưởi Phúc trạch, Cam Vân
du, Cam Sành. Tất cả các cây có biểu hiện đa bội hoá đều
nhận được ở nồng độ colchicin bằng 0,1%.Tổng số cây tứ
bội thể nhận được ở các giống thí nghiệm là19 cây.Trong
đó 13 cây ( 81,2%) thu được ở nồng độ colchicin 0,1% và
thời gian xử lý 24 giờ, 5 cây thu được ở thời gian xử lý 48
giờ và 1 cây ở 72 giờ, thời gian xử lý đạt hiệu quả cao nhất
là 24 giờ.Tuy nhiên 13 cây trong số 19 cây là các cây khảm
về mức bội thể,chỉ có 3 cây trong số đó là thuần tứ bội
(Hình 5).Hiện nay các cây này đang được tiếp tục chăm sóc
và theo dõi tính ổn định về mức bội thể.

Ảnh 2: Biểu đồ phân tích đa bội thể trên máy đo đa bội thể
flow cytometry,đỉnh cao là cây nhị bội ( đối chứng),đỉnh
thấp là cây tứ bội.


TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Cameron. J.W and Reuther. H.B,(1968). Genetics,
Breeding, and Nucellar Embryony. In "The citrus Industry"
H.B. Reuther Edited: 325 - 370
2. Chakraborty S.P; Vijayan K; Roy B.N; Qadri S.M.H;
1998. In vitro induction of tetraploidy in mulberry (Morus
albal.). In: Plant cell Reports 17: 799-803.

3. Frost, H.B; 1926. Tetraploidy in Citrus. Proc.
Nat.Acad.Sci.USA, 11: 535 - 537.
4. Hamill S.D; Smith M.K; and Dodd W.A.(1992). In vitro
induction of banana autotetraploid by colchicine treatment
of micropropagated diploids. In: Aust.J. Bot.40: 887-96.
5. Gmitter, F.G.,Jr., X.B. Ling, and X.X. Deng.(1991).
Induction of triploid Citrus plants from endosperm calli in
vitro. Theor. Applied Genet. (In press).
6. Grosser, J.W. and Gmitter F.G (1990). Protoplast fusion
and citrus improvement. Plant Breed. Rev. 8: 339-374.
7. Grosser, J.W and F.G Gmitter, Jr., E.S. Louzada and J.L.
Chandler. 1992. Production of somatic hybrid and
autotetraploid breeding parents for seedless citrus
development. HortScience 27: 1125 -1127. (1992).
8. Reuther W., (1968). The citrus Industry. Vol. II, vol. III
University of California.
9. Soost, R.K. and J.W.Cameron.1975. Citrus, p. 507-540.
In: J.janick and J.N. Moore (eds.). Advances in fruit
breeding. Purdue Univ. Press, West Lafayette, Ind.
10. Soost, R.K. and J.W.Cameron.1980. 'Oroblanco', a
triploid pummelo-grapefruit hybrid. HortScience 15:667-
669.
11. Soost, R.K. and J.W.Cameron.1985. 'Melogold', a
triploid pummelo- grapefruit hybrid. HortScience 20:1134-
1135.
12. Starrantino and G.R. Recupero. 1981. Citrus hybrids
obtained in vitro from females pollinated by 4X males. Int.
Soc. Citriculture 1: 31-32.
13. Tachikawa,T., Tanaka,Y, and Hara,S., 1961.
Investigation on the breeding of citrus trees. In: Study on

the breeding of triploid citrus varieties. Bulletin Shizuoka
Citrus Expt. Sta. 4:33-44.


SUMMARY

Study on induction of tetraploid citrus plants derived
From local diploid cultivars

Vietnam is very rich in indigenous citrus cultivars, most of
local widely cultivated citrus cultivars are seedy. For
breeding of triploid seedless citrus varieties, it is necessary
to induce autotetralploid plants derived from diploid ones.

The elite clones selected from 5 different citrus cultivars
have been used for polyploidization experiments. There are
Two orange Cultivars: Van du and Song Con( Citrus
sinensis), King mandarin: Cam Sanh ( C. nobilis),
mandarin cultivar: Quyt Chum (Citrus reticulata) and
pummelos cultivar Buoi Phu trach. The method of
colchicine in vivo treatment on the axillary buds of two-
year old plants has been used for inducing tetraploids.
Different colchicine concentrations (0; 0.05; 0.1; 0.2; 0.3;
0.4 and 0.5 percentages) with different treatment times( 0h;
24h; 48h and 72h) have been applied. The percentage of
surviving and shooting axillary buds is strongely depended
on the colchicine concentration, treatment time and also
genotype. The low concentration (0.05%) has showed any
or very litlte effect on shooting of treated buds even the
treating duration is extended up-to 48 and 72 h. The higher

colchicine concentrations, starting from 0.2%, have showed
toxic effects at all the treated times. The most effective
treatment has been observed at colchicine concentration
0.1% with treating time 24h. Ploidy level variation of the
plants derived from treated buds have been verified by
Flow Cytometry. Total of 19 plants were polyploidized (
tetraploids),from which 16 plants are chimeras,only 3
plants are homogenous tetraploids. The homogenous
autotetraploids have been obtained from 3 local cultivars
Van du,Cam Sanh and pummelos cultivar Buoi Phu trach.
The colchicine treatment at concentration of 0.1% and
treating time 24h is most effective for tetraploid plant
induction.

Người thẩm định nội dung khoa học: TS. Đoàn Duy Thanh.