BÁO CÁO KHOA HỌC: "PHÂN LẬP VÀ BIỂU HIỆN GEN GM1 MÃ HOÁ CHO EPITOPE THUỘC KHÁNG NGUYÊN H: G,M CỦA SALMONELLA ENTERITIDIS ATCC13076" pdf

PHÂN LẬP VÀ BIỂU HIỆN GEN GM1 MÃ HOÁ
CHO EPITOPE THUỘC KHÁNG NGUYÊN H: G,M
CỦA SALMONELLA ENTERITIDIS ATCC13076

1
Đỗ Thị Huyền,
2
Nguyễn Thành Trung,
2
Nguyễn Thị
Thu Hằng,
1
Phạm Thuý Hồng,
3
Trương Văn Dung,
1
Trương Nam Hải,
2
Lê Đình Lương
1: Viện Công nghệ sinh học, 2: Đại học Quốc gia Hà Nội 3:
Viện Thú Y Trung Ương
MỞ ĐẦU
Salmonella là nguyên nhân chủ yếu gây nhiễm độc thức ăn
cho người trên toàn cầu. Theo số liệu thống kê của Pháp
năm 1995, trong số 7449 bệnh nhân bị nhiễm độc thức ăn
đã có tới 3131 bệnh nhân do Salmonella gây ra. Bệnh do
Salmonella tập trung chủ yếu ở các nước châu Âu, châu Mỹ
điển hình là Anh, Pháp, Mỹ, Hà Lan [1, 2]. S. enteritidis
hiện nay vẫn được xem là nguyên nhân gây bệnh quan
trọng nhất trong số các chủng Salmonella.
Ở nước ta, bệnh do Salmonella chiếm tỷ lệ ít hơn và chủng

gây bệnh chủ yếu là S. typhimurium, S. cholera sau đó đến
S. enteritidis. Thông thường bệnh không gây triệu chứng
nặng đối với người lớn nhưng lại gây triệu chứng nghiêm
trọng đối với người già, người yếu và trẻ em.

Người bị mắc bệnh là do ăn phải thức ăn có nguồn gốc từ
thịt động vật, gia cầm và trứng đã nhiễm Salmonella. Hiện
nay mỗi nước đều có chương trình an toàn thực phẩm và
khuyến cáo để phòng bệnh do Salmonella nhưng hầu như
vẫn chưa loại trừ được mầm bệnh một cách triệt để [1].
Một trong những phương pháp để hạn chế sự lây lan của
mầm bệnh là phải có phương pháp phát hiện nhanh, tiện
lợi, chính xác để phát hiện ra nguồn gia súc, gia cầm nhiễm
bệnh.

Hiện nay có nhiều phương pháp phát hiện Salmonella [1, 3,
4, 5, 6, 7, 8, 9]. Phương pháp được sử dụng rộng rãi là
phương pháp ELISA dùng kháng nguyên để phát hiện sự
tồn tại của kháng thể kháng Salmonella trong huyết thanh
[1, 4, 6, 7, 8]. Tuy nhiên, kháng nguyên sử dụng trong các
phương pháp này đều mới là kháng nguyên toàn vẹn được
tinh chế bằng phương pháp hoá học và lý học nên tính đặc
hiệu chưa cao. Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi mong
muốn tạo được epitope của kháng nguyên H:g,m có khả
năng phát hiện đặc hiệu S. enteritidis bằng công nghệ AND
tái tổ hợp.

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

1. Nguyên liệu

a, Chủng vi sinh vật

- Chủng S. enteritidis ATCC13076 là chủng vi khuẩn mang
nguồn gen gm1 do Viện Thú Y Trung Ương cung cấp.

- Chủng E. coli DH5 [end A1 rec A1 hsd R17 sup E44 gyp
A96 thi-1 relA1

lac U169 (

80 lacZM15)] được sử dụng
làm thể nhận trong thí nghiệm biến nạp, nhân và chọn dòng
các plasmit.

- Chủng E. coli BL21 [F-omp hsd SB (rBmB) gel dcm
(DE3) plysS (Caml)] được sử dụng làm chủng nhận trong
thí nghiệm biến nạp với vectơ biểu hiện pET22b(+) mang
gen gm1.

b, Plasmit

- Plasmit pCR2.1 mua của hãng Invitrogen được sử dụng
làm vectơ tách dòng gen.

- Plasmit pET22b(+) được sử dụng làm vectơ biểu hiện
trong tế bào E. coli BL21

2. Phương pháp

a, Phương pháp biến nạp

Tế bào E. coli được biến nạp theo phương pháp tạo tế bào
khả biến bằng muối CaCl
2
của Seidman C. E. và cộng sự
[10]

b, Các phản ứng cắt, nối ghép các đoạn ADN, điện di trên
gel agaroza được tiến hành theo Sambrook và cộng sự [11]

c, Phản ứng PCR

Phản ứng làm biến tính ADN khuôn diễn ra ở 94
0
C trong 2
phút sau đó được tiếp theo với 30 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm
ba bước: bước 1: biến tính sợi ADN khuôn ở 94
0
C trong 1
phút; bước 2: mồi kết cặp bổ sung với đoạn gen tương đồng
trên sợi khuôn ở 49
0
C trong 1 phút; bước 3: tổng hợp, kéo
dài chuỗi ở 72
0
C trong 40 giây. Phản ứng kết thúc ở 72
0
C
trong 5 phút và ủ mẫu ở 4

0
C.

Hai đoạn mồi dùng để nhân gen do hãng Amersham
Pharmacia Biotech tổng hợp có trình tự như sau:

gm1f: TCCATggATgAAgCCAAAgCgATAgCTggT
NcoI
gm1r: ACTCgAggTTTTTggTTTTATCATCAAA
XhoI



Hình 1: Phân tích ADN hệ gen S. enteritidis ATCC13076
trên gel agaroza 0,8%
Đường chạy 1: Hệ gen S. enteritidis ATCC13076
Đường chạy 2: Thang ADN chuẩn

d, Tách ADN hệ gen của S. enteritidis


Một khuẩn lạc của S. enteritidis được nuôi cấy lắc trong 10
ml môi trường LB ở 37
0
C qua đêm. Sau đó tế bào được thu
lại bằng ly tâm và được hoà tan vào 567 l TE (10 mM
Tris, 1 mM EDTA, pH8). Mẫu tế bào được bổ sung thêm
30 l SDS 10%, 3 l proteaza K 1% và ủ ở 37
0
C trong 1

giờ sau được bổ sung thêm 180 l NaCl 5 M và ủ ở 65
0
C
trong 10 phút. Protein của tế bào được loại bỏ bằng
Chloroform. ADN hệ gen nằm ở pha trên được tủa lại bằng
cồn và được hoà vào 40 l TE có bổ sung 0,4 l
ARNaza1%. ADN hệ gen được bảo quản ở 4
0
C.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1. Nhân gen gm1 bằng kỹ thuật PCR

S. enteritidis có 3 kháng nguyên quan trọng được sử dụng
để phát hiện sự có mặt của chúng trong huyết thanh là
kháng nguyên O, H và kháng nguyên lông. Trong số các
kháng nguyên này, kháng nguyên H và kháng nguyên lông
là đặc hiệu hơn cho S. enteritidis. Kháng nguyên H của S.
enteritidis chỉ có một tính đặc hiệu là H:g,m được mã hoá
bởi gen fliC. Kháng nguyên H được biểu hiện thường
xuyên giúp cho Salmonella vận động và kết dính vào thành
ruột tạo điều kiện cho sự định khu, nhân bệnh và gây bệnh.
Năm 1995, Van Asten A. J. A. M và cộng sự đã xác định
được vùng gen mã hoá cho epitope của kháng nguyên H
đặc hiệu cho S. enteritidis. Epitope này là chuỗi polypeptid
ngắn có trình tự axit amin từ 246-382 [2]. Trong thí nghiệm
của mình, chúng tôi đặt tên cho gen mã hoá epitope đó là
gm1.

Để có được nguồn gen gm1, chúng tôi đã tách chiết ADN
hệ gen của S. enteritidis theo như quy trình đã được mô tả ở
phần nguyên liệu và phương pháp. ADN hệ gen sau khi
tách chiết được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose
0,8%. Kết quả điện di sản phẩm ADN được trình bày trên
hình 1 cho thấy ADN hệ gen là băng sáng, kích thước lớn,
không bị đứt gãy. Sau đó ADN hệ gen được pha loãng ra
200 lần để làm sợi khuôn nhân gen gm1.
Cặp mồi dùng để nhân gen được thiết kế dựa trên trình tự
gen fliC mã số M 84980 trên ngân hàng gen quốc tế. Với
mục đích tạo được epitope của kháng nguyên tái tổ hợp
hoàn chỉnh, không bị lẫn một số axit amin nằm trong vùng
đa nối của vectơ pET-22b(+), chúng tôi đã thiết kế mồi đầu
5’ và 3’ có chứa thêm trình tự của enzyme hạn chế NcoI và
XhoI tương ứng. Protein tái tổ hợp sẽ được tiết ra khoang
chu chất của tế bào nhờ tín hiệu dẫn pelB và sẽ được tinh
sạch dễ dàng nhờ 6 axit amin Histidin ở tận cùng đầu C đã
được thiết kế sẵn trên vectơ pET-22b(+).Gen gm1 được
nhân lên bằng PCR theo chu trình đã được mô tả ở phần
nguyên liệu và phương pháp. Sản phẩm của phản ứng được
phát hiện bằng điện di trên gel agaroza 0,8%. Kích thước
gen gm1 theo tính toán dài khoảng 0,3 kb (Hình 2).



Hình 2: Phân tích sản phẩm PCR nhân gen gm1 trên gel
agaroza 0,8%
Đường chạy 1: Sản phẩm PCR
Đường chạy2: Thang ADN chuẩn

Hình 3: Phân tích sản phẩm cắt các dòng pCRgm1 bằng
EcoRI trên gel agaroza 0,8%
Đường chạy 1-3: Các dòng pCRgm1 cắt bằng EcoRI
Đường chạy 4: Thang ADN chuẩn




Hình 4: Sơ đồ thiết kế vectơ biểu hiện pET22b(+) mang
gen gm1


2. Thiết kế vectơ biểu hiện pETgm1

Với mục đích thu được lượng lớn epitope của kháng
nguyên H:g,m tái tổ hợp để tạo kit ELISA phát hiện nhanh
S. enteritidis, chúng tôi đã chọn chủng biểu hiện là E. coli
BL21 vì E. coli và Salmonella có đặc điểm di truyền gần
giống nhau nên E. coli có thể tổng hợp được protein có cấu
trúc tương tự với cấu trúc nguyên thủy của nó trong
Salmonella.
Đoạn gen gm1 sau khi được nhân lên bằng PCR sử dụng
Taq polymerase sẽ được nối trực tiếp với vectơ tách dòng
pCR2.1. Sản phẩm lai được biến nạp vào E. coli DH5.
Plasmit trong thể biến nạp E. coli DH5 được tách và được
cắt kiểm tra bằng enzyme hạn chế EcoRI. Theo tính toán,
nếu vectơ pCR2.1 đã mang gen gm1 thì khi cắt bằng EcoRI

sẽ cho ra đoạn gen có kích thước 0,3 kb (Hình3). Các
plasmit này được đặt tên là pCRgm1.Để đưa gen gm1 vào
vectơ biểu hiện pET22b(+), chúng tôi đã tiến hành cắt
vectơ pCRgm1 bằng NcoI và XhoI. Đoạn gen có kích thước
0,3 kb được tinh sạch lại từ gel agarose 0,8% và được nối
vào vectơ pET-22b(+) bằng ADN ligaza. Sản phẩm nối
được biến nạp vào tế bào E. coli BL21. Sau khi kiểm tra
các dòng plasmit trong các thể biến nạp E. coli BL21,
chúng tôi đã chọn được các dòng pET22b(+) mang đoạn
gen gm1 như mong muốn. Plasmit này được đặt tên là
pETgm1. Toàn bộ sơ đồ thiết kế vectơ pETgm1 được trình
bày ở hình 4.

3. Biểu hiện gen gm1

Các dòng E. coli BL21 tái tổ hợp mang plasmit pETgm1
được nuôi cấy qua đêm ở 37
0
C trong 2ml môi trường LB
có chứa 100g/ml ampicilin. Sau đó tế bào được hoà loãng
vào môi trường LB có ampicillin đến OD
600
 0,1 và nuôi
cấy lắc ở cùng điều kiện trong khoảng thời gian 2 giờ để
OD
600
đạt 0,5 đến 0,8. Bổ sung IPTG đến nồng độ cuối
cùng là 1mM và chuyển sang cấy lắc ở 28
0
C để cảm ứng tế

bào tổng hợp protein tái tổ hợp. Đây là nhiệt độ thuận lợi
để E. coli hình thành cấu trúc đúng của protein. Sau 6 giờ
nuôi cấy cảm ứng, tế bào được thu lại và được phá bằng
đệm xử lý mẫu. Protein tổng số được kiểm tra trên gel
acrylamit 13,3%. Kết quả cho thấy tất cả thể biến nạp E.
coli BL21 đều tổng hợp băng protein lạ có kích thước
khoảng 10 kDa tương đương với kích thước của gm1 (Hình
5).



Hình 5: Phân tích protein của các thể biến nạp E. coli BL21
trên gel acrylamit 13,3%
Đường chạy 1-5: E. coli BL21 mang pETgm1 nuôi cấy
trong điều kiện cảm ứng bằng 1 mM IPTG
Đường chạy 6: Protein chuẩn
Đường chạy 7: E. coli BL21 mang pET22b(+) nuôi cấy
trong điều kiện cảm ứng bằng 1 mM IPTG
Đường chạy 8: E. coli BL21 mang pETgm1 nuôi cấy trong
điều kiện không cảm ứng



Hình 2: Phân tích sản phẩm PCR nhân gen gm1 trên gel
agaroza 0,8%
Đường chạy 1: Sản phẩm PCR
Đường chạy2: Thang ADN chuẩn

Hình 3: Phân tích sản phẩm cắt các dòng pCRgm1 bằng
EcoRI trên gel agaroza 0,8%
Đường chạy 1-3: Các dòng pCRgm1 cắt bằng EcoRI
Đường chạy 4: Thang ADN chuẩn




Hình 4: Sơ đồ thiết kế vectơ biểu hiện pET22b(+) mang
gen gm1


2. Thiết kế vectơ biểu hiện pETgm1

Với mục đích thu được lượng lớn epitope của kháng
nguyên H:g,m tái tổ hợp để tạo kit ELISA phát hiện nhanh
S. enteritidis, chúng tôi đã chọn chủng biểu hiện là E. coli
BL21 vì E. coli và Salmonella có đặc điểm di truyền gần
giống nhau nên E. coli có thể tổng hợp được protein có cấu
trúc tương tự với cấu trúc nguyên thủy của nó trong
Salmonella.
Đoạn gen gm1 sau khi được nhân lên bằng PCR sử dụng
Taq polymerase sẽ được nối trực tiếp với vectơ tách dòng
pCR2.1. Sản phẩm lai được biến nạp vào E. coli DH5.
Plasmit trong thể biến nạp E. coli DH5 được tách và được
cắt kiểm tra bằng enzyme hạn chế EcoRI. Theo tính toán,
nếu vectơ pCR2.1 đã mang gen gm1 thì khi cắt bằng EcoRI
sẽ cho ra đoạn gen có kích thước 0,3 kb (Hình3). Các
plasmit này được đặt tên là pCRgm1.Để đưa gen gm1 vào

vectơ biểu hiện pET22b(+), chúng tôi đã tiến hành cắt
vectơ pCRgm1 bằng NcoI và XhoI. Đoạn gen có kích thước
0,3 kb được tinh sạch lại từ gel agarose 0,8% và được nối
vào vectơ pET-22b(+) bằng ADN ligaza. Sản phẩm nối
được biến nạp vào tế bào E. coli BL21. Sau khi kiểm tra
các dòng plasmit trong các thể biến nạp E. coli BL21,
chúng tôi đã chọn được các dòng pET22b(+) mang đoạn
gen gm1 như mong muốn. Plasmit này được đặt tên là
pETgm1. Toàn bộ sơ đồ thiết kế vectơ pETgm1 được trình
bày ở hình 4.

3. Biểu hiện gen gm1

Các dòng E. coli BL21 tái tổ hợp mang plasmit pETgm1
được nuôi cấy qua đêm ở 37
0
C trong 2ml môi trường LB
có chứa 100g/ml ampicilin. Sau đó tế bào được hoà loãng
vào môi trường LB có ampicillin đến OD
600
 0,1 và nuôi
cấy lắc ở cùng điều kiện trong khoảng thời gian 2 giờ để
OD
600
đạt 0,5 đến 0,8. Bổ sung IPTG đến nồng độ cuối
cùng là 1mM và chuyển sang cấy lắc ở 28
0
C để cảm ứng tế
bào tổng hợp protein tái tổ hợp. Đây là nhiệt độ thuận lợi
để E. coli hình thành cấu trúc đúng của protein. Sau 6 giờ

nuôi cấy cảm ứng, tế bào được thu lại và được phá bằng
đệm xử lý mẫu. Protein tổng số được kiểm tra trên gel
acrylamit 13,3%. Kết quả cho thấy tất cả thể biến nạp E.
coli BL21 đều tổng hợp băng protein lạ có kích thước
khoảng 10 kDa tương đương với kích thước của gm1 (Hình
5).



Hình 5: Phân tích protein của các thể biến nạp E. coli BL21
trên gel acrylamit 13,3%
Đường chạy 1-5: E. coli BL21 mang pETgm1 nuôi cấy
trong điều kiện cảm ứng bằng 1 mM IPTG
Đường chạy 6: Protein chuẩn
Đường chạy 7: E. coli BL21 mang pET22b(+) nuôi cấy
trong điều kiện cảm ứng bằng 1 mM IPTG
Đường chạy 8: E. coli BL21 mang pETgm1 nuôi cấy trong
điều kiện không cảm ứng