BÁO CÁO KHOA HỌC: "BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ĐẶC TRƯNG CÁ THỂ NGƯỜI QUA LOCUT D5S818 BẰNG KỸ THUẬT PCR" docx

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ĐẶC TRƯNG CÁ THỂ
NGƯỜI QUA LOCUT D5S818 BẰNG KỸ THUẬT
PCR

Nghiêm Xuân Dũng, Trần Minh Đôn, Lương Thị Yến,
Lê Bích Trâm
Cục kỹ thuật Hoá Sinh và Tài liệu TCVI BCA
Ngô Thị Kim, Quyền Đình Thi, Đào Thị Tuyết
Viện Công nghệ Sinh học

MỞ ĐẦU

Sự ra đời của sinh học phân tử và công nghệ gen đã giúp
cho khoa học hình sự, lập chứng minh thư ADN, truy tìm
thủ phạm được xác định nhanh chóng và chính xác.
Trong hệ gen của con người tồn tại các locut di truyền có
chứa các đoạn ADN lặp lại (4 đôi bazơ) khác nhau và được
phát hiện bằng phương pháp PCR / 1,2,3,4 /. Trên thế giới
đã có hơn 12 locut được sử dụng rộng rãi trong y học hình
sự / 5,6 /. Ở Việt Nam, Viện Khoa học hình sự đã áp dụng
kỹ thuật phân tử trong điều tra phá án , song các kỹ thuật
trên được sử dụng toàn bộ chương trình và kit của nuớc
ngoài. Để đáp ứng yêu cầu áp dụng kỹ thuật phân tích
ADN của người Việt Nam đề tài sẽ dần khảo sát các đoạn
gen phù hợp. Trong bài này , chúng tôi xin được phép trình
bày phương pháp khảo sát và đặc trưng cá thể người qua
locut D5S818.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

1. Đối tượng

Mẫu máu được lấy từ tĩnh mạch người khoẻ mạnh, tình
nguyện và chống đông bằng EDTA.
Các hoá chất dùng cho tách chiết và làm sạch ADN là hoá
chất tinh khiết dùng cho phân tích được mua của Biorad ,
Sigma.

2. Phương pháp

ADN được tách chiết từ máu toàn phần theo phương pháp
chuẩn dùng phenol và cloroform. ADN sau tách chiết được
xác định độ sạch và hàm lượng bằng điện di trên gel
agaroza 2 %, mật độ quang học ở bước sóng 260 / 280 nm
và tỉ lệ giữa hai mật độ quang này là 1,7 – 2,2.
Phản ứng PCR được tiến hành với tỉ lệ thích hợp các chất
và cặp mồi D5 S818 ( xin phép chưa công bố trình tự mồi ).

Trình tự của phản ứng PCR như sau :
a.95
o
C - 5 phút
b.94
o
C - 45 giây
c.57
o
C - 75 giây
d.72
o
C - 1 phút

Quá trình từ b đến d được lặp lại 30 chu kỳ.
e.72
o
C - 6 phút
g.4
o
C - 10 phút

Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra bằng phương
pháp điện di trên gel agaroza 2 % và gel polyacrylamid 5 %
có biến tính. Kích thước của sản phẩm khuếch đại sẽ gồm 8
alen theo thứ tự tương ứng :

- Alen số 7 có kích thước là 141 bp
- Alen số 8 - 145 bp
- Alen số 9 - 149 bp
- Alen số 10 - 153 bp
- Alen số 11 - 157 bp
- Alen số 12 - 161 bp
- Alen số 13 - 165 bp
- Alen số 14 - 169 bp

Mỗi một mẫu máu chỉ cho kết quả 2 alen ( dị hợp tử ) hoặc
1 alen ( đồng hợp tử ) trong số các alen kể trên.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1. Xây dựng phương pháp

Chúng tôi đã tiến hành phân tích tổng số 56 mẫu máu trên
cơ sở mẫu đối chứng mẫu. Có nghĩa là bản gel
polyacrylamid đầu tiên gồm 12 mẫu ( như sơ đồ bản điện di
N1 ) có chứa 5 kiểu alen khác nhau. Ta tạm gọi các alen có
được theo thứ tự kề nhau từ thấp lên cao là: 1, 2, 3, 4, 5

Sơ đồ bản điện di gel polyacrylamid N1



Sau đó ta chọn hỗn hợp mẫu ( Mix1 ) có mặt đủ 5 alen.
Trong trường hợp này ta chọn mẫu 1 gồm alen số 1 và 2 ;
mẫu 4 gồm alen số 3 và 5 ; mẫu 9 gồm alen số 1 và 4. Bản
gel polyacrylamid tiếp theo ( N2 ) ngoài số mẫu cần phân
tích, còn có 2 giếng dành cho hỗn hợp mẫu ( Mix 1 ). Sơ đồ
bản điện di số 2 có chứa đủ 7 alen, trong đó có 5 alen tương
ứng với Mix 1và thêm 2 alen ở vị trí số 6 và vị trí - 2.

Sơ đồ bản điện di gel polyacrylamid N2



Từ đây ta có thể thấy được vị trí của 8 alen thuộc locut D5
S818. Đó là :

- Alen –2 tương ứng với alen số 7
- Alen –1 tương ứng với alen số 8 ( chưa quan sát được )
- Alen 1 tương ứng với alen số 9
- Alen 2 tương ứng với alen số 10
- Alen 3 tương ứng với alen số 11

- Alen 4 tương ứng với alen số 12
- Alen 5 tương ứng với alen số 13
- Alen 6 tương ứng với alen số 14

Với hỗn hợp mẫu ( Mix 2 ) có chứa 7 alen ta có thể khảo
sát được toàn bộ số mẫu cần phân tích. Hỗn hợp mẫu này
sẽ được nâng cấp thành thang alen chuẩn cho locut D5
S818. Điều này sẽ được báo cáo trong các nghiên cứu tiếp
theo của chúng tôi.

2. Đặc trưng cá thể.

Bước đầu khảo sát 56 mẫu máu người Việt Nam cho thấy
lucus D5 S818 có 8 alen khác nhau bao gồm các alen số 7,
8, 9, 10, 11, 12, 13, 14. Riêng alen số 8 chưa phát hiện
được, có thể do số lượng mẫu phân tích chưa đủ nhiều,
hoặc có thể có sự thiếu hụt alen này ở người Việt Nam. Tần
số các alen xuất hiện ở người Việt Nam qua phân tích là:

Alen số 7 chiếm 1,78 %
Alen số 8 chiếm 0 %
Alen số 9 chiếm 1,46 %
Alen số 10 chiếm 28,57 %
Alen số 11 chiếm 25,00 %
Alen số 12 chiếm 20,53 %
Alen số 13 chiếm 17,85 %
Alen số 14 chiếm 1,78 %

3. Kiểu gen.

Qua phân tích locut D5 S818 của 56 mẫu máu người
Việt Nam chúng tôi nhận thấy có 47 mẫu ( chiếm 83,92 % )
mang gen dị hợp tử bao gồm 12 kiểu gen và 9 mẫu ( chiếm
16,07 %) mang gen đồng hợp tử bao gồm 4 kiểu gen.


Tần số các kiểu gen của locut D5 S818


Số liệu khảo sát của chúng tôi chưa nhiều nhưng có thể
khẳng định phương pháp nghiên cứu này hợp lý và khoa
học để có thể triển khai khảo sát với số lượng mẫu lớn, đáp
ứng cho nghiên cứu tiếp theo của đề tài.

KẾT LUẬN

1. Bằng phương pháp phân tích mẫu đối mẫu của 8 alen
khác nhau, kế tiếp nhau, sai khác nhau 4 nucleotid ở locut
D5 S818, chúng tôi đã tìm được hỗn hợp mẫu có chứa đủ 8
alen dùng cho thang alen chuẩn của locut D5- S818.

2. Tần số phân bố alen 10 lớn nhất (28,57%), sau tới alen
11 (25,00%), alen 12 (20,53%) và 13 (17,85%). Các alen
khác (7, 9, 14) có tần số phân bố thấp. Đặc biệt alen số 8
chưa quan sát được.

3. Qua 56 mẫu máu được phân tích, locut D5 S818 cho 8
alen với 12 kiểu gen dị hợp tử (83,92%) và 4 kiểu gen đồng
hợp tử (16,07%).

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Edwards A. et al , 1991
ADN typing with trimeric and tetrameric tandem repeats :
polymorphic loci, detection systems, and population
genetic. In : The Second International Symposium on
Human Identification 1991, Promega Corporation, 31
2. Edwards A. et al , 1991
ADN typing and genetic mapping with trimeric and
tetrameric tandem repeats. Am. J.
Hum. Genet. 49, 746
3. Ausubel, F. M. et al , 1993
Unit 15 : the polymerase chain reaction. In : Current
Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing
Associates and Wiley-Interscience, NY
4. Warn, D. et al , 1991
Tetranucleotide repeat polymorphism at the human beta-
actin related pseudogene 2
( ACTBP2) detected using the polymerase chain reaction.
Nucl. Acids Res. 19, 6980
5. Fueredi, S. et al , 1996
Hungarian population data on six STR Loci-
HUMVWFA31, HUMTHO1, HUMCSF1PO, HUMFES-
FPS, HUMTPOX, and HUMPRTB-derived using multiplex
PCR amplification and manual typing. Int. J. Leg. Med.
109, 100
6. Santos, S. M. et al, 1996
Portuguese population data on six short tandem repeat loci
– CSF1PO, TPOX, THO1, D3S1358, vWA and FGA.
Forensic Sci. Int. 83, 229.

SUMMARY

Using pcr technique to specify D5 S818 Locut in human
genome


The fast technical development in DNA technology and the
increasing knowledge of the polymorphisms in the human
genome has opened a new dimension, particularly in
forensic biology. Identity testing by DNA analysis offers a
new level of confidence for forensic scientists because of
the powerful discrimination among individuals and
potential to identify criminal suspects from a minute
amount of biological specimen. Short tandem repeat (STR)
loci are becoming widely used in numerous application,
including forensics and paternity, for many reasons. First,
amplification of STRs require minimal amounts of DNA
and many rapid DNA purification methods are compatible
with amplification. STR loci have discrete and easily
assigned alleles. The small, defined size ranges allow for
the development of multiplexes. Allelic ladders can be used
for quick, accurate sizing of alleles. And lastly, the
detection format is non-radioactive.

About 12 STR loci which have short repeated units of 4bp
are widely used for identification purpose including
D5S818. The polymorphism of this locut was analyzed by
PCR technique. However, it’s impossible to detect each

allele of this locut with its exact size by commercial DNA
marker. The number of nucleotide A and T is much higher
than G and C in alleles of this locut, this will greatly affect
to the movement of DNA bands in polyacrylamide gel:
usually fragment with higher AT will move slower than
fragment which is rich of GC. To solve the problem in
alleles detection, we use the method of mixing PCR
products.
This paper showed the results of allelic frequencies and
genotypes which regulated by D5 S818 locut among 56
collected samples. DNA was isolated from peripheral white
blood cells by phenol/chloroform extraction/ ethanol
precipitation method. The repeated 4 nucleotides ADN
sequence was found using PCR technique. PCR was
performed for 30 cycles at the temperatures of 95
o
C-5 min.;
94
o
C-45s.; 57
o
C-75s. and 72
o
C-1min. DNA fragments from
PCR products were separated by 5% denaturing
polyacrylamide gel and visualized by silver staining.

Based on sample to sample method, an allelic marker
containing 8 alleles of D5S818 which has 4 nucleotides
positions in deferent was constructed. A highest frequency

of allele n0 10 was found at 28,57%, and the values 25%,
20,53%, 17,85% of alleles 11, 12, 13 respectively. The
lower frequencies were found in alleles n0 7, 9, 10. The
frequency of alleles N0 8 hasn't been observed.

Analyzing of 56 blood samples showed that the DS5818
locut has 8 alleles. 83,92% and 16,07% of samples
harboring 12 heterozygotes and 4 homozygotes
respectively.

Người thẩm định nội dung khoa học: TS. Nguyễn Đức
Thành.