BÁO CÁO KHOA HỌC: "VẤN ĐỀ NHIỄM ĐỘC TỐ TẢO CỦA ỐC NHỒI " doc

VẤN ĐỀ NHIỄM ĐỘC TỐ TẢO CỦA ỐC NHỒI
Trinh Tam Kiet, Duong Duc Tien,
H. Schubert, K. Reinhardt, J. Dahlmann, B. Luckas,

Ốc nhồi (Ampullariidae) phân bố rộng rãi ở vùng nhiệt
đới, là nguồn thực phẩm quý, vật nuôi trong bể cá để rọn
sạch tảo và một vài đại diện là vật gây hại mùa màng. Mặt
khác ốc nhồi cũng như các nhuyễn thể khác, trong quá trình
dinh dưỡng rất rễ bị nhiễm bởi các tảo độc trong chuỗi thức
ăn, đặc biệt là PSP (trong đó thường gặp nhất là Saxitoxin).
Nếu con người ăn phải nhuyễn thể có nhiễm độc tố PSP sẽ
dẫn đến tử vong do suy hô hấp. Vì vậy ở rất nhiều nước
nhập khẩu thuỷ sản, việc kiểm tra độc tố tảo (trước hết là
độc tố PSP) là điều bắt buộc. Từ nhiều năm trở lại đây, Việt
Nam là một nước xuất khẩu thuỷ sản lớn, trong đó đặc biệt
quan trọng là EU, Mỹ và Nhật Bản. Bởi vì giáp xác và
nhuyễn thể đã được chứng minh có hàm lượng độc tố đáng
kể nên việc kiểm tra chúng khi xuất sang thị trường trên là
cực kỳ quan trọng. ở đây, chúng tôi đã đề cập đến một ví
dụ hàng xuất khẩu ốc nhồi từ Việt Nam sang thị trường EU
để chứng tỏ công việc này quan trọng như thế nào.

Những nghiên cứu nhằm vào sản phẩm thịt ốc nhồi đông
lạnh sâu của cơ sở chế biến hải sản Phú Thành (Kiên
Giang) được xuất sang CHLB Đức qua Hà Lan. Nhằm mục
đích kiểm tra lượng độc tố PSP trong hàng nhập khẩu tháng
8-2003, kỹ thuật HPLC/FLD đã được đưa vào sử dụng.
Người ta đã thông báo một lượng PSP chứa trong sản phẩm
trên là 1029 µg/kg. Những phân tích này được lặp lại tại
Đại học Tổng hợp Jena (CHLB Đức). ở phương pháp
HPLC/FLD cũng quan sát thấy một đỉnh có thể cho là dc

STX. Tuy vậy, những nghiên cứu lặp lại ở các mẫu trên tại
Jena cho phép chứng minh đó là những chất độc tố chứa
bên trong của ốc, mà không có độc tính vốn có của PSP. Sự
kiểm tra an toàn thực phẩm và độc tố tại Jena được phối
hợp giữa phương pháp hoá - lý ( HPLC/FLD/MS ) và kiểm
tra sinh học (Maus- Bioassay) đều cho những kết quả
chứng minh rõ ràng là thịt ốc nhồi đông lạnh nhập khẩu từ
Việt Nam không có độc tố STX cũng như các độc tố PSP
khác. Các kết quả trên cho thấy trong khi kiểm tra chất
lượng hàng thuỷ sản xuất nhập khẩu phải sử dụng phương
pháp hoá - lý đã cải tiến kết hợp với kiểm tra sinh học trong
khi giám định.

Apfelschnecken (Ampullariidae) kommen weltweit in
tropischen Regionen vor. Dabei stellen manche Arten
hochwertige Lebensmittel dar, während andere für den
Aquarianer interessant sind, da sie gemeinsam mit Fischen
gehalten das Wasser „algenfrei“ machen.
Wegen dieses Fressverhaltens und weil sie sich sowohl im
Süßwasser als auch im Brackwasser schnell vermehren,
können Apfelschnecken aber auch als Schädlinge auftreten.
So führte z.B. das massenhafte Auftreten der gelben
Apfelschnecke in Vietnam zu großen Ernteverlusten.

Unabhängig davon ist bekannt, dass sogenannte
„Algenblüten“ zu einer Kontamination von Krusten- und
Schalentieren mit Algentoxinen führen können, wobei die
starke Vermehrung von toxischen Algen Harmful Algal
Blooms (HABs) genannt wird. Vor allem einige marine
Mikroalgen und bestimmte Cyanobakterien produzieren

Substanzen, die als Paralytic Shellfish Poisoning (PSP) –
Toxine bezeichnet werden, von denen Saxitoxin das
bekannteste PSP-Toxin darstellt. Diese Toxine können von
Muscheln und Schnecken aufgenommen werden, und
besonders HABs führen zu sehr hohen PSP-Belastungen.

Werden mit PSP-Toxinen kontaminierte Tiere verzehrt,
kommt es unmittelbar danach zu schweren Erkrankungen
des Konsumenten bis hin zum Tod durch Atemlähmung.
Deshalb wurden in verschiedenen Ländern
Qualitätssicherungssysteme verbunden mit einer
Importkontrolle, die auch die Prüfung von Seafood auf
Algentoxine (vor allem PSP-Toxine) einschließt,
aufgebaut.

Seit einigen Jahren exportiert Vietnam Seafood, und
darunter befinden sich neben Muscheln und Shrimps auch
Apfelschnecken. Weil vor allem Krusten- und Schalentiere
besonders hohe Toxin-Gehalte aufweisen können, wird der
Handel mit diesen Tieren besonders streng kontrolliert, und
immer erfolgt auch eine Überprüfung der PSP-Gehalte.
Nachfolgend soll am Beispiel des Exports von
Apfelschnecken aus Vietnam nach Europa deutlich
gemacht werden, wie wichtig eine Kontrolle von Seafood
auf eine mögliche Kontamination mit Algentoxinen bereits
vor Ort beim Erzeuger ist.

Apfelschnecken - eine interessante Tierart

Das attraktive Äußere und die relative Größe (5-15 cm)

trugen maßgeblich dazu bei, dass Apfelschnecken bei
Aquarianern und Gourmets immer beliebter wurden.
Allerdings gibt es auch viele missverständliche
Informationen hinsichtlich dieser Tiere. So werden sie in
den bekanntesten Aquaristik-Büchern als Ampullaria gigas
oder Ampullaria cuprina bezeichnet, obwohl diese Namen
falsch und veraltet sind. In der gegenwärtig verwendeten
Nomenklatur werden Apfelschnecken in sieben Gattungen
unterteilt: Asolene, Felipponea und Marisa sind die
Gattungen der Neuen Welt (Südamerika, Zentralamerika
und der Süden der USA), während Afropomus, Lanistes
und Saulea in Afrika heimisch sind. Die Gattung Pila
kommt sowohl in Afrika als auch in Asien vor.

Apfelschnecken bewohnen Sümpfe, Bäche, Teiche, große
Seen und Flüsse. Dabei werden stehende Gewässer
bevorzugt, und nur wenige Arten passen sich an fließende
Gewässer mit starker Strömung an. Die Lungen/Kiemen-
Kombination zeigt die Anpassung der Apfelschnecken an
Standorte mit sauerstoffarmem Wasser wie Sümpfen und
seichten Seen. Ein anderer Vorteil der Atmung zusammen
mit einer „Tür“ (operculum) am Schneckenhaus ist die
Fähigkeit, Dürreperioden zu überstehen.

Handelsübliche Arten für den Einsatz in Aquarien sind die
Apfelschnecken Pomacea bridgesii, Pomacea canaliculata,
Marisa cornuarietis, Pomacea paludosa. Diese können in
jedem Aquarium gemeinsam mit Fischen leben und dabei
die überschüssige Vegetation – das sind vor allem Algen –
vernichten.

Abb. 1: Die Apfelschnecken a) Pomacea bridgesii und b)
Pomacea canaliculata *
* aus:
/>man.htm


Das Problem der Kontamination von Apfelschnecken
mit PSP-Toxinen

Außer für den Aquaristikhandel exportiert Vietnam seit
einigen Jahren Apfelschnecken als Delikatesse für Seafood-
Restaurants. Dabei unterliegen Apfelschnecken ebenso wie
andere Krusten- und Schalentiere internationalen
lebensmittelrechtlichen Bestimmungen, denn es muss
sichergestellt werden, dass Apfelschnecken, die für die
menschliche Ernährung vorgesehen sind, keine
krankheitsverursachenden Keime enthalten. Auch dürfen
die Konzentrationen an Algentoxinen die gesetzlich
vorgeschriebenen Grenzwerte nicht übersteigen.

Da Apfelschnecken eine große Anzahl Mikroorganismen in
ihren Eingeweiden aufweisen, müssen bei der Verarbeitung
die hygienischen Vorschriften eingehalten werden, damit
die Qualität der Ware nicht absinkt. Auch ist die Mikroflora
der Apfelschnecken mit einer starken Enzymaktivität
verbunden, so dass mit Algen aufgenommene Toxine in
den Schnecken sehr schnell metabolisiert werden.

PSP- Toxine

Weltweit wird jedes Jahr von teilweise tödlich
verlaufenden Vergiftungen nach dem Verzehr von mit
Algentoxinen kontaminierter Seafood berichtet [1-3]. Dabei
ist die bekannteste und gleichzeitig gefährlichste
Intoxikation durch Schalentiere Paralytic Shellfish
Poisoning (PSP), verursacht durch eine Gruppe von 18
Neurotoxinen unterschiedlicher Toxizität mit Saxitoxin
(STX) als Leitsubstanz (Abb.2).

Abb. 2: Chemische Struktur der PSP-Toxine


PSP-Toxine werden vor allem von marinen Dinoflagellaten
synthetisiert, und nach der Akkumulation in Krusten- und
Schalentieren werden sie teilweise in Derivate mit stärkerer
Toxizität umgewandelt [4-7]. Dabei können bei einigen
Schalentieren enzymatisch sowohl Epimerisierungen als
auch Dehydroxylierungen, Esterspaltungen und teilweise
sogar Decarboxylierungen erfolgen. [5]. So werden in
Muscheln durch Epimerisierung die instabileren ß-Formen
C2, GTX3 und GTX4 in die stabileren -Formen C1, GTX2
und GTX1 überführt [4]. Daneben bewirken natürlich
vorkommendea chemische Reduktanden mit SH-Gruppen,
beispielsweise Glutathion und Cystein, unter anaeroben
Bedingungen eine Metabolisierung [7]. Beispiele hierfür
sind u.a. die Reduktion von Neo zu STX bzw. von GTX1
und GTX4 zu GTX2 und GTX3 sowie die Bildung von
Carbamoyl- und Decarbamoyl-Toxinen aus N-
Sulfocarbamoyl-Toxinen. Die wichtigste Umwandlung ist

jedoch die Bildung von Decarbamoyl-Saxitoxin (dcSTX)
aus Carbamoyl-Toxinen [2, 5].

Im Sinne eines effektiven Verbraucherschutzes und um die
betroffenen Wirtschaftszweige vor erheblichen finanziellen
Verlusten zu bewahren, ist die Kontrolle der Interaktion der
Toxine in der Umwelt sowie mit biologischem Material,
nicht zuletzt wegen der offensichtlichen Zunahme toxischer
Algenblüten und der damit verbundenen steigenden
Kontamination von Nahrungsmitteln mariner Herkunft mit
PSP-Toxinen, unerläßlich. Allerdings ist Voraussetzung für
ein besseres Verständnis der Rolle von Algentoxinen in der
marinen Umwelt die Entwicklung leistungsfähiger
analytischer Verfahren zur quantitativen Erfassung der
Toxine, wobei in den letzten Jahren erhebliche Fortschritte
erzielt werden konnten.

Analytik

Das international verbindlich vorgeschriebene Verfahren
zur Erfassung von PSP-Toxinen aus marinen Organismen
und Lebensmitteln mariner Herkunft ist der Maus-
Bioassay, d.h. ein auf einem Tierversuch basierendes
Analysenverfahren [2].

In Europa gibt es aber starke Widerstände gegen
Tierversuche, und deshalb wurde der Maus- Bioassay in
Deutschland durch ein physikalisch-chemisches Verfahren
ersetzt. Als Routineverfahren zur Kontrolle von Seafood
auf PSP-Toxine kommt eine chromatographische (HPLC)

Methode mit Fluoreszenzdetektion (FLD) zum Einsatz.
Wenn Überschreitungen des Grenzwertes von 800 µg PSP
pro Kilogramm Seafood (= 800µgSTXequ./kg) gefunden
werden, müssen die Ergebnisse des chromatographischen
Verfahrens jedoch zusätzlich massenspektrometrisch
(LC/MS) und über den Maus-Bioassay abgesichert werden.
In jedem Fall ist aber nur das Ergebnis des Maus-Bioassays
juristisch verbindlich, und auf dem Ergebnis des
Tierversuches gründet sich die Entscheidung, ob das
Lebensmittel importiert oder exportiert werden darf. [2,
12].

Viele gegenwärtig im Routinebetrieb zur PSP- Bestimmung
eingesetzte HPLC-Verfahren basieren auf der
Ionenpaarchromatographie, jedoch sind diese Verfahren
aufgrund der hohen Konzentrationen an nichtflüchtigen
Substanzen im Eluenten nicht für die direkte Kopplung an
ein Massenspektrometer (LC/MS) geeignet [8-11]. Der
Einsatz der LC/MS-Kopplung ist jedoch notwendig, um
selektiv detektierte Toxine spezifisch nachzuweisen sowie
um bisher noch nicht bekannte Strukturen ebenfalls
toxischer Verbindungen aufzuklären. In diesem
Zusammenhang erwies es sich als wichtig, dass eine
HPLC/FLD- Methode entwickelt wurde, die auch eine
Kopplung an ein Massenspektrometer ermöglicht [13].
Dieses HPLC/FLD/MS-Verfahren wurde zusätzlich zum
Maus-Bioassay eingesetzt, um von Vietnam nach Europa
exportierte Apfelschnecken auf PSP-Toxine zu
untersuchen. Die hierzu verwendete Apparatur zeigt Abb.3.

Abb. 3: HPLC-System mit Ionenaustauschersäulen und
MS-Detektion sowie elektrochemischer Oxidation,
Fluoreszenzdetektion und Fraktionssammler


Nachfolgend wird die mögliche Kontamination von
Apfelschnecken mit Algentoxinen betrachtet, und speziell
die Untersuchungen im Hinblick auf eine quantitative
Erfassung von PSP-Toxinen, die für einen ungehinderten
Handel mit Seafood unerlässlich sind, werden am Beispiel
der Untersuchung von Importware aus Vietnam nach
Europa näher beschrieben.

Untersuchung von Apfelschnecken aus Vietnam

Das Probenmaterial (Proben Nr. 01565 und Nr. 01566)
wurde vom Niedersächsischem Landesamt für
Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit, Cuxhaven,
an die Friedrich-Schiller-Universität nach Jena gesandt,
damit hier sowohl der Maus-Bioassay als auch die Analyse
mittels HPLC/FLD/MS durchgeführt wird. Bei den zur
Untersuchung übersandten Proben handelte es sich um
Apfelschneckenfleisch (tiefgefroren), das aus Vietnam (Phu
Tanh Frozen Factory, Kien Giang) über die Niederlande
nach Deutschland exportiert worden war. Zur Kontrolle der
Ware auf PSP-Toxine im August 2003 war ein HPLC/FLD-
Verfahren zur Anwendung gekommen, und es wurde ein
PSP-Gehalt von 1029µg/kg ermittelt.

Allerdings wurde ausschließlich Decarbamoyl- Saxitoxin

(dcSTX) gefunden, das eine im Vergleich zu Saxitoxin
(STX) deutlich geringere Toxizität aufweist (Toxicity
factor dcSTX: 0.43, vgl. Abb. 2), so dass die PSP-
Belastung des Probenmaterials nur 442.5µg STXequ./kg
betrug. Damit wurde der international verbindliche
Grenzwert für den PSP-Gehalt von Krusten-und
Schalentieren von 800µg STXequ./kg zwar nicht
überschritten, jedoch lag der PSP-Gehalt der Proben
deutlich über dem Gehalt von 200µgPSP/kg, der als
„Warnwert“ in Anl.3 zu §17 der in der Bundesrepublik
Deutschland geltenden Fischhygiene- Verordnung
aufgeführt ist [14].

Als problematisch erwies sich jedoch, dass dieser Befund
nicht massenspektrometrisch abgesichert war, und
außerdem waren die dcSTX-Konzentrationen im
Apfelschneckenfleisch aus Vietnam nicht mit Hilfe des im
Zweifelsfall durchzuführenden Maus-Bioassays kontrolliert
worden.

Diese Analysen wurden in Jena nachgeholt, und sie
ergaben ein übereinstimmendes Ergebnis. Bei der
HPLC/FLD-Methode mit pre-column Derivatisierung [10],
die in Cuxhaven angewendet wurde, war im
Chromatogramm bei der Retentionszeit von dcSTX ein
Peak sichtbar gewesen, der deshalb als dcSTX ausgewertet
wurde. Dieser Peak erwies sich im Ergebnis der in Jena
durchgeführten Analysen als ein Inhaltsstoff der
Apfelschnecken, jedoch ohne die toxische Wirkung eines
PSP-Toxins. Das geht aus Abb. 4 und Tab. 1 hervor.

Abb. 4: HPLC/FLD – Bestimmung von PSP Toxinen
nach
post-column Derivatisierung
a) PSP-Standardmix b) Probe 01565 c) Probe 01566
chromatogr. Bedingungen vgl. [17]


Zwar tauchte nach der chromatographischen Trennung der
Extrakte aus den Apfelschnecken auch in Jena in den
HPLC/FLD-Chromatogrammen ein verdächtiger Peak bei
Rt 7.9 min auf (vgl. Abb.4), jedoch stimmten die
Retentionszeiten bei den hier angewandten HPLC/FLD-
und HPLC/FLD/MS-Methoden mit post-column
Derivatisierung [13,17] weder mit dcSTX noch mit einem
anderen PSP-Toxin überein. Dadurch konnte die
Anwesenheit von PSP-Toxinen im Fleisch der
Apfelschnecken aus Vietnam (jedenfalls für die zur
Untersuchung gelangte Ware) ausgeschlossen werden.

Dennoch blieb die Frage ungeklärt, ob der nicht
identifizierte Peak in den Chromatogrammen von einer
Substanz aus den Apfelschnecken mit ebenfalls toxischen
Eigenschaften herrührte, und auch deshalb wurde der
Maus-Bioassay [16] zusätzlich zu den HPLC-Verfahren
durchgeführt. Dabei wurden die gleichen Extrakte
eingesetzt, die vorher chromatographisch untersucht
worden waren [17].

Wie aus den in Tab. 1 dargestellten Ergebnissen ersichtlich

ist, ergaben sich keine Hinweise auf eine PSP-ähnliche
Wirkung, hervorgerufen durch den aus den Apfelschnecken
extrahierten Inhaltsstoff.
Tab. 1: Ergebnisse des Maus-Bioassays für die
Untersuchung von Apfelschneckenfleisch aus Vietnam
auf PSP-Toxine


Zusammenfassung

Apfelschnecken (Ampullariidae) sind nicht nur für
Aquarianer interessant, sondern einige Arten stellen auch
hochwertige Lebensmittel dar.

Wegen des Lebens im aquatischen Milieu, vor allem auch
im Brackwasser entlang von Küsten, besteht eine erhöhte
Gefahr, dass die Schnecken nicht nur Algen sondern auch
die von diesen produzierten Toxine aufnehmen. Dabei
können in Apfelschnecken besonders die von
Dinoflagellaten und Cyanobakterien gebildeten Paralytisch
Shellfish Poisoning (PSP)- Toxine akkumuliert werden.

Um die Verbraucher vor einer Gefährdung der Gesundheit
durch den Verzehr PSP-belasteter Apfelschnecken zu
schützen, haben viele Länder Verordnungen erlassen, in
denen die maximal duldbaren Konzentrationen an
Algentoxinen in Krusten- und Schalentieren aufgeführt
sind. Außerdem ist festgelegt worden, wie und in welchem
Umfang der Handel mit diesen Tieren zu kontrollieren ist.

Hinsichtlich der Überwachung von Seafood auf PSP-
Toxine wird ein maximaler PSP-Gehalt von 800µgPSP/kg
(= 800µgSTXequ./kg) toleriert, und zur Kontrolle auf
Algentoxine werden durch die Lebensmittelüberwachung
sowohl physikalisch-chemische (HPLC/FLD und LC/MS)
als auch biologische Verfahren (Maus-Bioassay) eingesetzt.
Werden mit den verschiedenen Methoden unterschiedliche
PSP-Gehalte ermittelt, so gilt der Maus-Bioassay als
Referenzmethode.

Besonders in Vietnam hat der Verzehr von Apfelschnecken
Tradition, und deshalb importiert die EU diese Tiere häufig
aus Vietnam. Dabei wurde von einem in der
Bundesrepublik Deutschland ansässigen und für die
amtliche Lebensmittelüberwachung zuständigen Landesamt
in Apfelschnecken aus Vietnam eine relativ hohe Belastung
mit dem PSP-Toxin dcSTX gefunden. Allerdings erfolgte
der Nachweis nur mit einer HPLC/FLD-Methode, denn die
massenspektrometrische Absicherung sowie die
Überprüfung des Resultates mit Hilfe des
rechtsverbindlichen Maus-Bioassays konnten nicht sofort
durchgeführt werden. Deshalb wurde neues Probenmaterial
zur Nachuntersuchung an ein anderes Institut versandt.
Die im Beanstandungsfalle für eine lebensmittelrechtliche
und toxikologische Bewertung unerlässliche Kombination
von physikalisch-chemischen Verfahren (HPLC/FLD/MS)
und biologischen Tests (Maus-Bioassay) ergab hinsichtlich
einer PSP-Kontamination der importierten Apfelschnecken
eindeutige Untersuchungsergebnisse, d.h. in den Proben
waren weder dcSTX noch andere PSP-Toxine nachweisbar.

Zwar tauchte in den Chromatogrammen ein zusätzlicher
Peak auf, jedoch wurden erst auf der Basis der Ergebnisse
des Maus-Bioassays Aussagen hinsichtlich der
toxikologischen Relevanz dieser in den Extrakten der
Apfelschnecken vorliegenden Verbindung möglich.
Somit kann konstatiert werden, dass es vom ethischen
Standpunkt aus betrachtet zweifellos erstrebenswert ist, bei
der Kontrolle von Lebensmitteln hinsichtlich einer
Kontamination mit Algentoxinen auf Tierversuche völlig
zu verzichten. Allerdings erlaubt der gegenwärtige Stand
der Technik z.Z. nur eine kombinierte Anwendung von
physikalisch- chemischen und biologischen Verfahren.
Deshalb sollte im Zusammenhang mit dieser Problematik
offen ausgesprochen werden, dass auch bei verstärktem
Einsatz von Hochleistungsanalysengeräten nur die
Konzentrationen von bekannten Toxinen und Toxin-
Metaboliten sehr genau bestimmt werden können, während
verlässliche Daten hinsichtlich der toxischen Wirkungen
dieser Verbindungen im Organismus sicherlich auch
weiterhin nur über Tierversuche erhalten werden können.

Literatur

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8956-3