PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU NHIỄM SẮC THỂ NGƯỜI docx

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU NHIỄM
SẮC THỂ NGƯỜI


I. ĐẠI CƯƠNG:
 Nhiễm sắc thể (NST) người được xem là những yếu tố của sự di truyền.
 Thuật ngữ “Chromosome” (chromo = color = MÀU và some = body = THỂ) đã
được Waldeyer đưa ra vào năm 1888. Các NST chỉ có thể quan sát được khi chúng co
ngắn lại ở kỳ giữa để chuẩn bị cho sự phân chia tế bào.
 NST đã được nghiên cứu từ cuối thế kỷ 19, nhưng với trình độ khoa học kỹ thuật
thời bấy giờ các nhà khoa học đã đưa ra nhiều kết luận khác nhau về số lượng NST
người.
1891  Flemming đề nghị bộ NST người là: 2n = 24
Morre đề nghị bộ NST người là: 2n = 32
Wilcox đề nghị bộ NST người là: 2n = 36
 Đầu thế kỷ 20, việc quan sát phân tích số lượng NST người đã gần đúng sự thật.
 1912  Winiwater phân tích mô tinh hoàn cắt mảnh và cho rằng :
♂ = 47 NST (trong đó có 1 NST giới tính X)
♀ = 48 NST (trong đó có 2 NST giới tính XX)




 1921  Tìm ra NST Y
 1923  Painter cũng dùng mô tinh hoàn cắt mảnh để phân tích và đi đến
kết luận bộ NST người là 2n = 48
♂ = 46 NST thường + XY

♀ = 46 NST thường + XX
 Như vậy, số lượng NST người với 2n = 48 của Painter được mọi người công nhận
và tồn tại trong các sách giáo khoa hàng chục năm.
 Mãi đến năm 1956, Tjio và Levan qua phân tích tế bào thai người, xác định chính
xác số lượng NST của người là 2n = 46
Nam = 44 nst thường + XY
Nữ = 44 nst thường + XX
 Năm 1960, Moorhead và cộng sự đã đề xuất phương pháp cấy tế bào lympho ở
máu ngoại vi trong vòng 48h – 72h để làm tiêu bản NST người và qua đó phân tích,
đánh giá các NST một cách chính xác.
 Chu kỳ tế bào:





(Pr)
G

2
(Pr)
G

2
S

(AND)

M

G1
S interphase (gian kỳ)
G2
2 gđ chính
Prophase : kỳ đầu
Metaphase : kỳ giữa
M: Mitosis (phân chia tb) Anaphase : kỳ sau
Telophase : kỳ cuối
Trong giai đoạn phân chia tế bào, ta quan sát các NST rõ nhất ở kỳ giữa.


II. CÁC NGUYÊN TẮC KỸ THUẬT ĐỂ LÀM TIÊU BẢN NST NGƯỜI:
1. Nguyên tắc cơ bản:
 Các NST chỉ có thể được xác định và phân tích cấu trúc ở cuối kỳ đầu và kỳ giữa,
vì thế, trong việc nghiên cứu NST người, ta chỉ dùng những mô có các tế bào đang
trong giai đoạn phân chia, còn đối với những mô bao gồm các tế bào ít phân chia hoặc
không phân chia, phải kích thích cho chúng phân chia và nuôi cấy chúng trong một
môi trường thích hợp (RPMI, F10, TC199… ). VD: Tế bào lympho ở máu ngoại vi là




những tế bào không phân chia, tuy nhiên dưới tác dụng của chất Phytohemagglutinin
(PHA), tế bào lympho sẽ chuyển dạng và phân chia. PHA là một loại mucoprotein

chiết xuất từ hạt đậu đỏ hình thận, tên khoa học là Phaseolus Vulgaris. PHA có tác
dụng làm chuyển dạng các tế bào lympho nhỏ thành những tế bào giống như nguyên
bào lympho (lymphoblast-like cells), gây nên sự gia tăng tổng hợp ARN và ADN
trong vòng 48 giờ nuôi cấy. PHA còn có tác dụng gây ngưng kết hồng cầu.
 Làm cho các tế bào đang phân chia dừng lại ở kỳ giữa vì các NST ở kỳ giữa có
dạng điển hình nhất giúp ta dễ quan sát, phân tích và đánh giá. Hoá chất có tác dụng
này là Colchicin, là một hoạt chất của hạt cây Thu Thủy Tiên (Colchicum Autumnale)
hoặc hóa chất tổng hợp có tác dụng tương tự như Colchicin là Colcemid. Đặc tính của
hóa chất này là phá vỡ thoi vô sắc, do đó NST mất chỗ tựa và không thể di chuyển về
2 cực của tế bào được, vẫn nằm tại mặt phẳng xích đạo. Colchicin còn có tác dụng làm
cho NST co ngắn lại, dày lên và quan sát dễ dàng.
 Dùng sốc nhược trương (hypotonic shock) để làm trương phồng tế bào phá vỡ
màng tế bào, các NST ở kỳ giữa sẽ phân tán không xếp chồng lên nhau, nhờ vậy có thể
quan sát dễ từng chiếc một. Dung dịch nhược trương thường được dùng là KCl 0,75M
hoặc Citrat Natri 1%.
 Định hình các NST bằng dung dịch Carnoy theo tỷ lệ 3/1 (3 methanol / 1 acid
acetic)
 Nhuộm NST bằng các loại phẩm nhuộm nhân: Giemsa, orcein …






2. Phương pháp làm tiêu bản NST:
 Có 2 phương pháp: trực tiếp và gián tiếp
a. Phương pháp trực tiếp:
 Là phương pháp lấy tế bào của cơ thể không qua giai đoạn nuôi cấy chuẩn bị, chỉ
sử dụng những tế bào đang ở trong giai đoạn phân chia rất mạnh trong cơ thể. VD: tế
bào tủy xương, mô bào thai, mô tinh hoàn ….

 Chú ý :
 Vẫn phải nhỏ Colchicin với mục đích làm ngưng giai đoạn phân chia tế bào ở kỳ
giữa.
 Vẫn phải dùng dung dịch nhược trương KCl với mục đích làm bung các NST.
b. Phương pháp gián tiếp:
 Là phương pháp mà trong đó các tế bào phải trải qua 1 quá trình nuôi cấy trong
môi trường thích hợp, kích thích các tế bào chuyển dạng và phân chia nhờ vào PHA.
 Loại tế bào hay được dùng trong phương pháp gián tiếp là các lympho bào ở máu
ngoại vi vì mẫu vật dễ lấy và phương pháp nuôi cấy tương đối đơn giản.
 Ngoài tế bào lympho ở máu ngoại vi, còn có thể nuôi cấy các tế bào của mô bào
thai, tế bào gai nhau, nguyên bào sợi, tế bào của các khối u ác tính …
 Sử dụng phương pháp gián tiếp thường có nhiều tế bào phân chia hơn so với
phương pháp trực tiếp, và do vậy có được nhiều cụm kỳ giữa để quan sát, phân tích và
đánh giá hơn.




2. Tiến hành nuôi cấy máu ngoại vi: (giảng trong phần thực tập)
III. BỘ NST NGƯỜI:
 Tế bào lưỡng bội bình thường ở ngươi chứa 46 NST, các NST giống nhau từng đôi
một về hình dạng, kích thước (gọi là NST tự thân hay Autosomes) và một đôi không
giống nhau đó là NST giới tính (sex chromosomes)
♂ = 44A + 2 NST giới tính giống nhau là XX
♀ = 44A + 2 NST giới tính giống nhau 1 X và 1 Y
 Năm 1960 các nhà tế bào di truyền đã họp tại Denver, Colorado thống nhất về việc
sắp xếp bộ NST người dựa vào cấu trúc và kích thước của các NST.
1. Phân loại theo cấu trúc :
 Dựa vào vị trí của tâm động, ta xác định 3 loại NST quan sát được ở kỳ giữa như
sau:

a) NST tâm giữa (Metacentric chromosomes): gồm các NST có tâm nằm ở gần như
chính giữa tạo thành 2 nhánh gần bằng nhau.
b) NST có tâm lệch (Submetacentric chromosomes): Các NST có tâm nằm lệch ở một
bên tạo thành 2 nhánh không bằng nhau; nhánh ngắn và nhánh dài.
c) NST tâm đầu (Acrocentric chromosomes): Các NST có tâm nằm rất lệch ở gần một
đầu NST tạo thành 2 nhánh: một nhánh rất ngắn và một nhánh rất dài.
 Ở người các NST số 1, 2, 3, 16, 19 và 20 là những NST có tâm giữa hoặc gần giữa.
Các NST 13, 14, 15, 21, 22 và Y là những NST tâm đầu. Các NST còn lại có tâm lệch.
2. Phân loại NST theo kích thước :




 Khi các NST được nhuộm bằng kỹ thuật Giemsa thông thường thì không tạo nên
các băng, ta không thể xác định số từng NST một. Do đó, dựa vào kích thước to, nhỏ
cũng như cấu trúc (vị trí của tâm động) mà sắp xếp các NST theo hệ thống Denver
thành 7 nhóm dùng các chữ số từ A đến G như sau:
 Nhóm A: gồm những NST lớn nhất có tâm giữa hoặc gần giữa gồm các
đôi 1, 2, 3. Đôi 1 và 3 có tâm giữa. Đôi 2 có tâm gần giữa.
 Nhóm B: gồm những NST lớn nhưng hơi nhỏ hơn nhóm A, có tâm lệch
hoặc hơi lệch, gồm đôi số 4, 5.
 Nhóm C: là NST trung bình có tâm lệch, các đôi NST ở nhóm này rất
khó phân biệt chính xác từng đôi một nếu không sử dụng KT nhuộm băng.
Gồm các đôi NST số 6  số 12 và NST giới tính X. Các đôi 6, 7, 8, 11 và X
có tâm gần giữa, còn các đôi 9, 10, 12 có tâm lệch.
 Nhóm D: là những NST trung bình, tâm đầu có kèm theo vệ tinh gồm
các đôi 13, 14, 15.
 Nhóm E: là những NST trung bình hoặc dưới trung bình gồm các đôi 16,
17, 18. Đôi 16 có tâm giữa. Đôi 17, 18 có tâm lệch.
 Nhóm F: là những NST nhỏ có tâm giữa, gồm đôi 19, 20.

 Nhóm G: là những NST nhỏ có tâm đầu, kèm theo vệ tinh gồm đôi 21,
22. NST Y cũng xếp vào nhóm này nhưng không có vệ tinh, các nhánh dài
nằm sát nhau.
NHÁNH
NGẮN






CENTROMERE
NHÁNH
DÀI

METACENTRIC SUBMETACENTRIC ACROCENTRIC
3. Ký hiệu thường dùng trong nghiên cứu NST người :
 Trong nghiên cứu phân tích bộ NST người được tiến hành theo thứ tự qua 2 giai
đoạn:
a) Giai đoạn phân tích qua kính hiển vi:
 Chọn các cụm kỳ giữa đẹp, rõ để qua đó xác định số lượng NST, phân tích các sai
lệch về số lượng cũng như các sai lệch lớn về cấu trúc.
 Ghi lại tọa độ của các cụm kỳ giữa đã được phân tích vào phiếu phân tích NST.
 Quan sát và phân tích khoảng 30 cụm kỳ giữa.
 Chọn và đánh dấu tọa độ những cụm kỳ giữa đẹp, rõ, sau đó chụp hình.
b) Phân tích qua ảnh chụp:
 Các cụm kỳ giữa đẹp, rõ đã được ghi tọa độ lại qua kính hiển vi sẽ được chụp hình
qua kính KHV có máy chụp hình.
 Rửa ảnh các cụm kỳ giữa đẹp.

 Các NST được cắt ra và xếp từng đôi theo hệ thống xếp loại Denver.
 Quá trình này được gọi là xếp bộ NST (Karyotyping) và ảnh các NST được cắt và
xếp hoàn tất thì được gọi là NST đồ (Karyotype).
 Để miêu tả bộ NST người trong bộ NST đồ (Karyotype), người ta sử dụng các ký
hiệu đã được thông qua, tiêu chuẩn hóa trong các cuộc hội nghị về tế bào di truyền
quốc tế Denver (1960) và Paris (1970). Diễn tả một bộ NST người gồm 3 phần, ngăn
cách nhau bởi dấu phẩy:
 Phần 1: Số lượng NST
 Phần 2: Số lượng NST giới tính
 Phần 3: Miêu tả các rối loạn về số lượng và cấu trúc.
 Dưới đây là một số ký hiệu thường dùng để nghiên cứu bộ NST người:
 A  G : Các nhóm NST
 1  22 : Số các NST thường
 X, Y : NST giới tính
 46, XX : Bộ NST nữ bình thường
 46, XY : Bộ NST nam bình thường
 p : Nhánh ngắn (short arm)
 q : Nhánh dài (long arm)
 cen : Tâm động (centromère)
 s : Vệ tinh (satellite)




 dic : NST 2 tâm (dicentric)
 r : NST vòng (ring)
 ace : NST không tâm (acentric)

 i : NST đều (isochromosome) có 2 nhánh bằng
nhau đều nhánh ngắn hoặc đều nhánh dài. Do hiện tượng phân chia NST tại
centromère theo chiều thẳng góc.
 del : Khuyết đoạn (deletion)
 dup : Nhân đoạn (duplication)
 inv : Đảo đoạn (inversion)
 ins : Thêm đoạn (insertion)
 t : Chuyển đoạn (translocation)
 / : Thể khảm (mosaicism 46/47)
 + hay - : Đặt trước số của NST thì chỉ NST đó thừa hoặc
thiếu cả NST đó. Ví dụ: 47, XX, +21 (thừa 1 NST 21)
 + hay - : Đặt ngay sau ký hiệu của nhánh thì chỉ nhánh
đó thiếu hoặc thừa. Ví dụ: 46,XXq
-
(NST X thiếu 1 phần nhánh dài)
 45, XO : nữ bị hội chứng Turner
 47, XXY : nam bị hội chứng Klinefelter
 47, XX, +21 : nữ bị hội chứng Down




 46, XX, del (5p) : nam bị mất một phần nhánh ngắn NST số 5
(Hội chứng mèo kêu: cri du chat syndrome)
 46, XY, -14, +t(14q, 21q) : nam bị hội chứng Down thể chuyển đoạn
IV. CÁC PHƯƠNG PHÁP MỚI ĐỂ XẾP LOẠI BỘ NST:
- Bằng các phương pháp làm tiêu bản NST và nhuộm Giemsa thông thường, chỉ cho
phép phân tích và phát hiện được các RL về số lượng cũng như các sai lệch về cấu trúc
lớn như đứt gãy NST, NST vòng, NST 2 tâm, chuyển đoạn hòa nhập tâm …
- Ngày nay với sự tiến bộ của môn Tế bào-Di truyền và các kỹ thuật mới làm tiêu

bản NST cho phép xác định một cách chính xác các sai lệch NST rất nhỏ như đảo
đoạn, thêm đoạn, chuyển đoạn tương hỗ
1. Phương pháp tự chụp hình phóng xạ :
- Phương pháp này dựa vào đặc điểm tự nhân lên của ADN của một số NST không
giống nhau vào các thời gian khác nhau được đánh dấu vào Thymidin, qua đó người ta
đã phân biệt được các NST nhóm B, D và G và NST X .
- Tuy nhiên việc áp dụng phương pháp này còn gặp nhiều trở ngại về trang thiết bị,
hóa chất, và thời gian.
2. Phương pháp huỳnh quang (FISH - Fluorescence In Situ Hybridization):
- Năm 1971 Caspersson và cộng sự đã công bố phương pháp huỳnh quang để xác
định vị trí các NST.
- Nguyên tắc cơ bản của phương pháp này là: khi nhuộm NST bằng các phẩm
nhuộm huỳnh quang (Quinacrine hoặc Quinacrine mustard) liên kết với ADN thì trên




NST xuất hiện các băng sẫm và các băng nhạt, các băng này quan sát được qua KHV
huỳnh quang; phần cuối NST Y bắt màu huỳnh quang mạnh nhất.
- Với phương pháp huỳnh quang ta có thể xác định chắc chắn từng NST một.
3. Phương pháp ASG (Acetic – Saline – Giemsa):
- Năm 1971, Summer và cộng sự đề xuất phương pháp ASG.
- Phương pháp ASG gồm các phương pháp cơ bản sau:
 NST được cố định bằng dung dịch cố định có acid acetic (A)
 Xử lý tiêu bản trong dung dịch muối nóng (S)
 Nhuộm tiêu bản bằng phẩm nhuộm Giemsa (G)
- Nguyên tắc cơ bản của ASG: Các ADN tạo nên phần dị nhiễm sắc ở trên NST sẽ
bắt màu phẩm nhuộm Giemsa không giống nhau tạo nên các băng sẫm và nhạt đặc
trưng cho từng NST. Các băng tạo bởi phương pháp ASG gọi là băng G và ta có thể
quan sát chúng bằng KHV quang học .

- Năm 1972 Seabright đã dùng men Trypsin hoặc Chymotrypsin thay cho giai đoạn
xử lý bằng dung dịch muối nóng, cũng cho các băng sẫm nhạt trên NST tương tự như
băng làm theo phương pháp ASG. Phương pháp xử lý bằng Trypsin hoặc
Chymotrypsin tạo nên các băng gọi là băng T.
- Từ năm 1970 đến nay, chủ yếu dựa vào các nguyên tắc cơ bản trên mà các nhà
nghiên cứu Tế bào-Di truyền đã đưa ra hàng loạt các phương pháp phát hiện băng khác
nhau như băng R (vị trí các băng sẫm và nhạt ngược với băng G), băng C, băng T……




- Gần đây nhất với sự nuôi cấy tế bào và thu hoạch NST ở giai đoạn kỳ đầu, và áp
dụng các phương pháp nhuộm băng nói trên đã cho phép phân tích đánh giá những sai
lệch rất nhỏ về cấu trúc của từng NST một cách rất chính xác .
V. ỨNG DỤNG Y HỌC CỦA VIỆC PHÂN TÍCH NST NGƯỜI:
1. Chẩn đoán lâm sàng:
- Nghiên cứu NST rất có lợi trong chẩn đoán lâm sàng chủ yếu ở các bệnh nhân đa
dị tật bẩm sinh, chậm phát triển tâm thần; khả năng sống kém hoặc những rối loạn về
sự phát triển cơ quan sinh dục.
2. Nghiên cứu các loại u ác tính:
- Ứng dụng đầu tiên của băng Q là phát hiện ra NST Philadelphia, tìm thấy khi nuôi
cấy tế bào máu tủy xương của bệnh nhân bị CML (Chronic myelogenous leukemia) đó
chính là NST 22 một phần nhánh dài bị mất đi.
- 1973 Rowley xác định chính xác NST Philadelphia là do sự chuyển đoạn nhánh dài
của NST 22; t(9q22q)
- Trong Retinoblastoma  13q14
–

- Trong bệnh Wilm
’

s Tumors  11p13


3. Vấn đề sinh sản :
- Khảo sát NST ở các cặp vợ chồng sẩy thai liên tiếp, vô sinh… cho thấy có sự bất
thường NST, ví dụ như có một sự chuyển đoạn từ 1 NST giới tính sang NST thường,
46, XY, t(Y  2p)
- Đa số bệnh nhân vô sinh một phần có liên quan đến gen và rối loạn NST.




4. Chẩn đoán trước sinh :
- Lập Karyotype của phôi thai qua nuôi cấy tế bào nước ối, tế bào gai nhau và máu
thai nhi để phát hiện các rối loạn NST về số lượng cũng như về cấu trúc. Đối với các
thai phụ lớn tuổi hoặc có tiền căn đẻ con dị tật bẩm sinh thì thông qua xét nghiệm chẩn
đoán trước sinh lập Karyotype thai nhi, qua đó phân tích và đưa ra các lời khuyên di
truyền và các biện pháp điều trị kịp thời.
ThS. BS. PHÙNG NHƯ TOÀN