Nghiên cứu tình hình, đặc điểm lâm sàng và đánh giá hiệu quả điều trị bệnh sporotrichose bằng itraconazole

1

ĐẶT VẤN ĐỀ


Bệnh vi nấm sâu (La Sporotrichose) là một bệnh nhiễm nấm bán cấp
hay mãn tính ở da, do vi nấm Sporothrix Schenckii gây ra xâm nhập chủ yếu
qua đường da lan theo đường mạch bạch huyết nông dưới dạng cục nhỏ, sau
đó vỡ thành các vết loét ít đau.
Sporothrix Schenckii là nấm nhị độ lưỡng hình (dimorphique) sống
hoại sinh ở đất, lá cây, thực vật sống hoặc chết, gai, chất bài tiết của súc vật
… xâm nhập cơ thể qua vết trầy xướt da, vết thương do gai đâm. Vì vậy dể
gây bệnh cho người làm vườn, làm ruộng, trồng hoa, thợ hầm mỏ… bệnh còn
được gọi là bệnh gardener’s .Triệu chứng lâm sàng có thể gặp 4 thể: Thể da –
bạch huyết (Formes Cutanées – lymphangitique Sporochose), Thể đơn thuần
khu trú ở da (Formes cutanées), Thể bệnh lan tỏa (Formes généralisées),Thể
phổi nguyên phát (Formes pulmonaire primitive), Ở Việt Nam bệnh gặp rải
rác và rất hiếm ở các tỉnh miền Bắc, ở miền nam chỉ gặp ở Đà Lạt có một số
vùng nội dịch, bệnh nhân hầu hết là nông dân làm vườn rẫy, trồng rau quả và
hoa, buôn bán hoa [2][5][7] Hàng năm phòng khám TT.PCBXH tỉnh Lâm
đồng tiếp nhận và điều trị khoảng40-50bệnh nhân mỗi năm, phần lớn bệnh
nhân cư trú ở phường 7, 8, 9, 12 Thành phố Đà Lạt, thị trấn Lạc Dương và Xã
Lát Huyện Lạc Dương, qua kết quả nghiên cứu của TTPC. Bệnh Xã Hội tỉnh
Lâm đồng năm 2006 [6].
Mặt khác thường bệnh nhân khi mắc bệnh thường tự mua thuốc chữa trị,
hoặc đến các phòng khám không chuyên, điều trị không đúng phác đồ bệnh
vẫn không thuyên giảm, một số trường hợp còn nhầm với lao da, ung thư
da…. Phần lớn bệnh nhân và cộng đồng thiếu kiến thức về bệnh lý này không
biết cách phòng tránh và xử lý vết thương. Bệnh đã ảnh hưởng đến sức khỏe

2

đời sống kinh tế xã hội của nhân dân địa phương, ngoài phương pháp điều trị
cổ điển bằng Potassium Iodur (KI) qua kết quả nghiên cứu của TTPCBXH
Lâm đồng năm 2006 [6],[8] thì chưa có nghiên cứu nào hệ thống về áp dụng
thuốc kháng sinh kháng nấm để điều trị bệnh lý này. Vì vậy chúng tôi tiến
hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu tình hình, đặc điểm lâm sàng và đánh
giá hiệu quả điều trị bệnh Sporotrichose bằng Itraconazole” nhằm mục tiêu:
1. Khảo sát đặc điểm lâm sàng bệnh Sporotrichose tại Bệnh viện Da liễu
Trung Ương và Trung tâm phòng chống bệnh xã hội Lâm đồng
2. Đánh giá hiệu quả điều trị bệnh Sporotrichose bằng Itraconazole .

3

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN

1.1. Tình hình bệnh Sporotrichose trên thế giới và Việt Nam
Sporothrix Schenckii là nấm lưỡng dạng (dimorphique) sống hoại sinh
ở đất, lá cây, thực vật sống hoặc chết (thực vật mục nát, vỏ cây có gai, gai
thực vất, chất bài tiết của súc vật … xâm nhập cơ thể qua vết trầy xước da, vết
thương do gai đâm, … Vì vậy dể gây bệnh cho người làm vườn, làm ruộng,
trồng hoa, thợ hầm mỏ… bệnh còn được gọi là bệnh gardener’s (bệnh người
làm vườn) được Schenk mô tả lần đầu tiên ở Mỹ năm 1898, sau đó Beumann
và Ramoud (1903) phát hiện ở Châu Âu. Năm 1912 Beumann và Gougerot
mô tả chi tiết hình dạng của nấm. Theo Findley, Sporothrix Schenkii phát
triển tốt nhất ở nhiệt độ 25 – 27 độ C, do đó bệnh thường gặp ở vùng cao
nguyên, ôn đới hay nhiệt đới, nhiều nhất là ở Châu Mỹ La Tinh (Amérique
Latine) như: Mexique, Costarica, Venezuela, Bresil, Guatemala, ở Nam Phi
(grotte du Tranvaal) và cũng tìm thấy ở Nhật Bản (Japon). Bệnh hiếm gặp ở
Châu Âu, mặc dù người ta đã chẩn đoán nhiều trường hợp ở Pháp vào khoảng
năm 1905-1920 [20],[21],[23][43].
Ở Việt Nam gặp rải rác ở một số tỉnh miền Bắc, theo thống kê bệnh
lý tại Bệnh viện Da liễu Trung ương thì hàng năm chỉ có khoảng từ 3-5 cas.
Ở miền nam chỉ gặp nhiều tại Đà Lạt có một số vùng nội dịch với suất độ
mắc bệnh cao, bệnh nhân hầu hết là nông dân làm vườn rẫy, trồng rau quả
và hoa, buôn bán hoa. Theo kết quả điều tra trước đây của GS.TS Trần
Xuân Mai Trường Đại Học Y – Dược Thành Phố Hồ Chí Minh năm 1984
đã tìm thấy sự hiện diện của Sporothrix Schenckii trong đất và rau ở khu
vực phường 3,4 cũ (tức là phường 7,8 hiện tại) [5],[8], kết quả điều tra của

4

TT.PCBXH tỉnh Lâm đồng năm 2006[6] đã tìm thấy sự hiện diện của nấm
Sporothrix Schenckii trong môi trường đất và thực vật ở các phường của
Thành phố Đà lạt và Lạc dương.
Hàng năm phòng khám TT. PC.BXH và ở một số phòng khám da liễu
thuộc tỉnh Lâm Đồng tiếp nhận và điều trị khoảng 40-50 bệnh nhân mỗi năm,
phần lớn bệnh nhân cư trú ở phường 7,8,9,12 Thành phố Đà Lạt, thị trấn Lạc
Dương và Xã Lát Huyện Lạc Dương,bệnh đã gây ảnh hưởng trực tiếp đến sức
khỏe và kinh tế của người lao động địa phương [5],[6].
1.2. Dịch tễ học và triệu chứng lâm sàng bệnh Sporotrichose
Bình thường gặp ở nam giới , khỏe mạnh , dưới 30 tuổi , ít gặp ở trẻ
em, hay gặp ở những người làm vườn, làm ruộng, thợ nề, trồng hoa hoặc bán
hoa, những người tiếp xúc với đất, nhiều trường hợp lây nhiễm trong phòng
thí nghiệm [1],[2],[3].
Triệu chứng lâm sàng có thể gặp 4 thể: [7],[14],[15],[17],[19]
1.2.1. Thể da – bạch huyết: (Formes Cutanées – lymphangitique Sporochose)
Đây là thể thường gặp nhất, bệnh bắt đầu từ 1 chi ở vùng da hở thường
là tay phải dưới dạng cục sẩn gồ trên mặt da không đau, đặc biệt cục sẩn mọc
trên đường bạch huyết, lúc đầu cứng di động sau đó trở nên dính, do có hoại
tử nên quanh cục u đỏ rồi tím đen, sau đó các cục u mềm và loét có mũ sệt
vàng dọc theo mạch bạch huyết, từ dưới lên trên xuất hiện các cục u mới, có
diễn tiến giống cục u ban đầu, giữa các vết loét, u cục là mạch bạch huyết bị
sưng như một sợi dây nhỏ dưới da có thể sờ thấy, đôi lúc như chuổi hạt trai,
bệnh nhân không đau không sốt.


5

1.2.2 Thể đơn thuần khu trú ở da ( Formes cutanées )

Thể này rất hiếm, gặp ở người có sức đề kháng tốt. Sang thương
thường dưới dạng bướu gai và mụn cóc, không lan theo mạch bạch huyết.
1.2.3 Thể bệnh lan tỏa ( Formes généralisées )
Thể này rất hiếm, dạng này tiếp theo dạng da – mạch bạch huyết hay
thể nguyên phát ở phổi, triệu chứng giống như một sự nhiễm nấm huyết gặp ở
những người có tình trạng sức khỏe xấu, suy giảm miễn dịch, nghiện rượu,
bệnh lý về máu, ung thư, AIDS … Trên bề mặt da của cơ thể có rất nhiều cục
u nhỏ, cứng, ít khi loét (rạch có thể thấy một mũ đặc, vết rạch loét và lâu
lành) vi nấm xâm nhập vào máu và lan tỏa khắp cơ thể : bề mặt các khớp
xương, tủy xương, hệ thống thần kinh trung ương, phổi thận, và cơ quan sinh
dục – dịch hoàn, vú.
1.2.4 Thể phổi nguyên phát (Formes pulmonaire primitive)
Xẩy ra ở những người sống trong vùng dịch tể, do hít bào tử vi nấm
vào phổi. Thể bệnh này khó chẩn đoán nên dể bỏ qua. Biểu hiện bệnh về lâm
sàng và X-Quang khá giống bệnh lao, bệnh nhân có thể ho ra máu giống lao
phổi, dần tạo thành hang ở phổi, triệu chứng toàn thân mệt mỏi sốt nhẹ.
* Tiêu chuẩn chẩn đoán Sporotrichose:
 Triệu chứng lâm sàng đặc trưng.
 Xét nghiệm nuôi cấy (+) tính (nuôi cấy-phân lập,PCR…)
 Giải phẩu bệnh (hình ảnh đặc trưng)
*Tiêu chuẩn lành bệnh:các thương tổn lành và hóa sẹo hoàn toàn
* Thuốc điều trị: [1],[2],[6],[7],[9],[12],[24]


6

 Thuốc cổ điển KI: 1-5g/ngày dùng liều tăng dần, uống với nước hoa
quả hoặc sữa
 Kháng sinh diệt nấm:
- Ketoconazole 200mg/ngày x vài tháng

- Itraconazole (Sporal) 200mg/ngày x 3 tháng
- Có thể kết hợp Griseofulvin với terbinafin hoặc Itraconazole
* Tác dụng phụ của thuốc:[37],[38],[39],[40],[44]
Kháng sinh diệt nấm Itraconazole (sporal): là một dẫn xuất Triazole, có
hoạt tính đối với vi nấm Dermatophytes (các chủng Trichophyton, Microsporum,
Epidermophyton floccosum), nấm men (Cryptococus neoformans, các chủng
Candida bao gồm C.albican, C.glabrata và C.Krusei, các chủng Pityrosporum)
các Aspergillus, các chủng Histoplasma, Paracoccidioides, Sporothrix schenckii,
các chủng Fonsecaea, các chủng Cladosporium, Blastomyces dermatitidis và
các vi nấm men khác. Các nghiên cứu trong ống nghiệm đã xác nhận rằng
Sporal gây rối loạn việc tổng hợp Esgosterol của tế bào vi nấm, Ergosterol là
một thành phần thiết yếu của màng tế bào vi nấm. Sự rối loạn tổng hợp chất
này cuối cùng dẫn đến một tác dụng kháng nấm.
* Tác dụng phụ của Itraconazole:
Đau bụng, buồn nôn, nôn mữa, tiêu chảy, biếng ăn, mệt mỏi, sốt, khó
chịu chảy nước mũi, vàng da vàng mắt, phát ban, ngứa, nổi mề đay, nhức đầu
chóng mặt, giảm ham muốn, cao HA, đau cơ khớp.
* Tác dụng phụ của Iodua Kali: Trứng cá, tiêu chảy, chán ăn, buồn nôn, đau
bụng, nôn mữa…phát ban, nổi mày đay, khó thở, tức ngực, loét miệng,sưng


7

miệng, sưng tấy cổ họng, sưng mặt, phân đen, sốt, mạch tăng, tê ngứa bàn tay
ban chân.
1.3 Cận lâm sàng
1.3.1. Hình ảnh nuôi cấy và đặc tính sinh vật hóa học của nấm Sporothrix.
schenckii: [26],29],[31],[32],35]
* Hình ảnh nuôi cấy của nấm Sporothrix.schenckii
- Hình ảnh nấm S .schenkii trên môi trường Sabouraud có Chloramphenicol

Sau 3 – 5 ngày ở nhiệt độ phòng, vi nấm mọc thành khúm nhỏ, phẳng,
màu kem bề mặt khô và có tính chất dai. Để thêm một tuần khúm nấm sẽ trở
nên nhăn nheo và có màu đen. Quan sát một mảnh khúm nấm dưới kính hiển
vi, thấy những sợi tơ nấm mảnh mai, thanh tú, có bào đài ngắn, trên đầu có


8

các bào tử đính kích thước (2 – 4um) x (2 – 6um); ngoài ra còn có những bào
tử đính mọc trực tiếp từ những sợi tơ nấm.


- Hình ảnh nấm S .schenkii trên môi trường thạch BHI có Chloramphenicol


Sau 2 – 4 ngày ở 28
0
C vi nấm mọc thành khúm nhỏ, bề mặt khô trắng
và mịn như bông gòn. Quan sát dưới kính hiển vi , ta thấy những tế bào hạt
men kích thước (1 – 3) x (4 – 10um), đôi khi tế bào có hình tròn hay hình


9

trứng. Chúng sinh sản bằng cách nảy búp có hình dáng như điếu cigar, nên
còn được gọi là thể cigar.

- Hình ảnh nuôi cấy nấm S .schenkii trên môi trường thạch CandidaSelect

- Hình ảnh nuôi cấy nấm S .schenkii trên môi trường CHROMagar


10


Trên các môi trường nuôi cấy Sporothrix .schenkii vừa có thể sợi tơ
vừa có thể hạt men và giữa hai thể này có thể chuyển hóa cho nhau được, nên
Sporothrix schenkii được xem là vi nấm nhị độ (Diphasis Fungus).
* Các tích chất sinh vật hoá học của nấm Sporothrix.schenkii
Test mầm giá:
Kỹ thuật làm test mầm giá.
- Hút 3 giọt huyết thanh vào một tube thuỷ tinh nhỏ.
- Sử dụng pipette, nhẹ nhàng lấy một khóm nấm men cho vào tube
huyết thanh và đánh thành huyền dịch.
- Ở nhiệt độ 35 – 37
0
C trong 3 giờ nhưng không được để lâu.
- Nhỏ một giọt huyết thanh lên lam kính để kiểm tra.
- Đậy lam kính và soi kính hiển vi với độ phóng đại ở vật kính x40.



11

Kết quả:
+ Test dương tính: ở đầu sợi nấm có một chồi tế bào nấm mọc ra (mầm giá)
+ Test âm tính: Chỉ có tế bào nấm men.

Kết quả chạy giá đường API20 CAUX




12

CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu:
2.1.1. Bệnh nhân nghiên cứu:
Tất cả BN Sporotrichose nội trú và ngoại trú tại Bệnh viện Da liễu
Trung Ương và phòng Khám Da liễu TT.PCBXH Lâm đồng từ tháng 01 năm
2010 đến tháng 6 năm 2011
* Tiêu chuẩn chẩn đoán:
- Triệu chứng lâm sàng đặc trưng của Sporotrichose:
Thể da – bạch huyết: thể thường gặp nhất, bệnh bắt đầu từ 1 chi thường
là tay phải dưới dạng cục sẩn gồ trên mặt da không đau, mọc trên đường bạch
huyết, lúc đầu cứng di động sau đó trở nên dính, màu đỏ rồi tím đen, sau đó
loét có mũ sệt vàng, mạch bạch huyết bị sưng như một sợi dây nhỏ dưới da có
thể sờ thấy, đôi lúc như chuổi hạt trai,BN không đau không sốt.
Thể đơn thuần khu trú ở da: rất hiếm gặp, ở người có sức đề kháng tốt.
Thương tổn dưới dạng bướu gai và mụn cóc, không lan theo mạch bạch huyết.
Thể bệnh lan tỏa : rất hiếm, triệu chứng như nhiễm nấm huyết gặp ở
những người có tình trạng sức khỏe xấu, nghiện rượu, bệnh lý về máu, ung
thư, AIDS… nấm xâm nhập vào máu và lan tỏa khắp cơ thể : bề mặt các khớp
xương, tủy, thần kinh trung ương, phổi thận, sinh dục – dịch hoàn, vú.
Thể phổi nguyên phát :Xẩy ra ở những người sống trong vùng dịch tể,
do hít bào tử vi nấm vào phổi. Thể bệnh này khó chẩn đoán nên dể bỏ qua.

Biểu hiện bệnh về lâm sàng và X-Quang giống bệnh lao, bệnh nhân có thể ho
ra máu giống lao phổi,hang ở phổi, triệu chứng toàn thân mệt mỏi sốt nhẹ.


13

- Sinh thiết giải phẩu bệnh : sinh thiết nhuộm PAS có thể thấy
những thể sao (asteroid bodies) là những tế bào nấm hình ovale hay điếu xì gà
- Nhuộm soi, nuôi cấy, PCR (+)
* Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân: bệnh nhân Sporotrichose điều trị nội trú và
ngoại trú tại Bệnh viện Da liễu TW và TTPCBXH tỉnh Lâm đồng.BN được
giải thích và tự nguyện đồng ý hợp tác nghiên cứu điều trị.
* Tiêu chuẩn loại trừ:
- BN không đồng ý, không hợp tác .
- BN chống chỉ định dùng Itraconazole: suy gan, suy thận nặng, dị ứng
với Itraconazole.
2.1.2. Bệnh phẩm nghiên cứu:
- Thương tổn trên da: sinh thiết làm giải phẩu bệnh tại Bệnh viện Da
liễu Trung Ương. Nhuộm soi, nuôi cấy làm PCR tại Bệnh viện Phong-Da liễu
Trung Ương Qui Hòa
- Máu : xét nghiệm công thức máu, sinh hóa, chức năng gan…
- Các xét nghiệm khác : X quang xương, phổi (nếu cần)
2.1.3. Thời gian nghiên cứu: từ tháng 01 năm 2010 đến tháng 06 năm 2011
2.1.4. Địa điểm nghiên cứu: Bệnh viện Da liễu Trung Ương và phòng Khám
Da liễu TT.PCBXH tỉnh Lâm đồng.
2.2 Phương pháp nghiên cứu:
2.2.1 Thiết kế nghiên cứu:
- Nghiên cứu lâm sàng và yếu tố liên quan: Mô tả cắt ngang
- Nghiên cứu hiệu quả điều trị : Thử nghiệm lâm sàng (tự chứng: so
sánh trước và sau điều trị).

14

2.2.2 Cỡ mẫu:
Mẫu tất cả bệnh nhân Sporotrichose đến khám tại Bệnh viện Da liễu
Trung Ương và phòng Khám Da liễu TTPCBXH Lâm đồng
2.2.3 Các kỷ thuật áp dụng trong nghiên cứu:
2.2.3.1 Nghiên cứu lâm sàng:
- Lập phiếu nghiên cứu và làm bệnh án điều trị (xem phụ lục)
- Chọn bệnh nhân theo các tiêu chuẩn đề ra
- Phỏng vấn bệnh nhân, các thông tin cần thu thập:
+ Thông tin cá nhân: tên, tuổi, giới, dân tộc, trình độ học vấn, nơi cư
trú, nghề nghiệp.
+ Điều kiện môi trường làm việc lao động của bệnh nhân: cây trồng,
vật nuôi, phân bón, nguồn nước tưới, bảo hộ lao động …
+ Khảo sát quá trình nhiễm nấm: vị trí vết thương, thời gian ủ bệnh,
cach xử trí vết thương, những nơi đã đến khám và điều trị, kết quả …
+ Triệu chứng lâm sàng và diễn biến của bệnh: triệu chứng cơ năng,
triệu chứng thực thể, tỷ lệ các thể, diễn biến, quá trình lành bệnh, làm sẹo.
+ Tình trạng khám bệnh và điều tri trước đó: điều trị ở đâu? thuốc gì?
- Các bệnh nhân đều được giải thích và đồng ý tham gia.
2.2.3.2 Quy trình kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu
Thu thập mẫu
- Lập phiếu điều tra cá nhân, giải thích cho bệnh nhân trước khi tiến
hành kỹ thuật rạch da.
- Bệnh phẩm là mủ hoặc chất hoại tử tại thương tổn. Loại bỏ bớt chất
hoại tử hoặc mủ ở bề mặt thương tổn, dùng tăm bông lấy chất dịch ở nền

15

thương tổn, có thể bóp nặn thương tổn để lấy được phần dịch từ trong mô
chảy ra.
- Hoặc cắt mảnh da tại thương tổn áp dụng cho bệnh nhân có thương
tổn không điển hình, không có loét, lấy như quy trình cắt sinh thiết làm giải
phẩu bệnh.
- Bệnh phẩm dính trên tăm bông, dao rạch da, hoặc mảnh sinh thiết được
trước hết được cấy trên môi trường nuôi cấy nấm, sau đó làm một phết tiêu bản
để khảo sát trực tiếp, cuối cùng cho vào ống nghiệm chứa cồn etanol 70%, giữ ở
nhiệt độ phòng tối đa 1 tháng cho đến khi sử dụng để chiết tách DNA.
Kỹ thuật cắt sinh thiết da :
Chuẩn bị dụng cụ:
- Bông, băng keo, gạc, kẹp phẩu tích không mấu, khoan sinh thiết
đường kính 2mm, dao rạch da (dao mổ số 11) vô trùng. Cán dao mổ số 11.
- Ống nghiệm efpendorf chứa sẵn 1ml cồn ethanol 70% .
- Thuốc gây tê tại chỗ Lidocaine .
- Cồn sát trùng
Tiến hành lấy mẫu:
- Dùng khoan sinh thiết nhấn nhẹ vào vị trí thương tổn đã gây tê, cho
khoan sinh thiết đi sâu hết thượng bì vào trung bì thì ngưng. Mảnh sinh thiết
dính trong lòng khoan, nhẹ nhàng đẩy picton ở đầu trên khoan sinh thiết để
đẩy mẩu da ra ngoài.
- Mảnh da cắt được cho vào ống nghiệm vô trùng để cấy, hoặc ống
nghiệm chứa cồn ethanol 70% nếu làm PCR, folmol 10% nếu làm GPB…
- Chuyển ống nghiệm chứa bệnh phẩm đến phòng xét nghiệm.


16

Lý tưởng nhất, mẫu mô cần lấy bao gồm cả các mô lấy tại vị trí bình
thường, trung tâm và rìa của tổn thương. mẫu mô cần được giữ ẩm với nước
muối hoặc nước dùng BHI và được vận chuyển đến phòng thí nghiệm càng
sớm càng tốt.
Mẫu mô cần được giữ trong một đĩa petri vô trùng. Nếu bệnh phẩm có
mủ và chất hoại tử, cấy trực tiếp lên môi trường nuôi cấy. Ngoài ra thực hiện
thêm một tiêu bản để kiểm tra trực tiếp. Cắt mẫu thành từng miếng nhỏ với
một lưỡi dao vô trùng, Cấy mẫu bệnh phẩm đã cắt nhỏ lên môi trường.
- Cấy vào Sabouraud dextrose agar có chứa chloramphenicol và
gentamicin và nuôi cấy ở 26
o
C và 35
o
C,
- Hoặc cấy vào thach dinh dưỡng (BHIA), bổ sung máu cừu 5% và ủ
tại 35
o
C. Duy trì nuôi cấy trong 4 tuần.
Lưu ý: Tránh nhiễm khuẩn cho đĩa cấy vào túi nilon vô trùng hoặc dán kín
nắp đĩa petri, duy trì ở 26
0
C quan sát trong 4 tuần, một số nấm phát triển chậm.
Xét nghiệm soi tươi quan sát trực tiếp vảy da, tóc và móng tay hoặc cho các
thành phần khác của nấm
Chuẩn bị Kali Hydroxide - Dimethyl Sulfoxide (KOH-DMSO)
Phương pháp:
Sử dụng một pipette an toàn, thêm DMSO với nước cất và sau đó hòa
tan trong dung dịch KOH.
Dimethyl sulfoxide (DMSO) 40 ml
Nước cất 60 ml

Kali hydroxit 10 gam
Làm gắn kết cho kính hiển vi:


17

1. Mẫu bênh phẩm hòa trong một giọt KOH-DMSO trên một lam kính sạch.
2. Đậy lamen. Không cần làm nóng nếu dùng hỗn hợp KOH +DMSO.
3. Khảo sát dưới kính hiển vi trong vòng 20 phút.
Nuôi cấy nấm trên lam để quan sát hình dạng và cách thức sinh bào tử,
nhằm định danh S schenckii:
Để xác định chính xác nhiều loại nấm, điều cần thiết là quan sát sự sắp
xếp của các cuống đính bào tử (conidiophores) và cách thức sinh bào tử
(conidial ontogeny). Phương pháp đơn giản của Riddel là nuôi cấy trên lam
(42:265 Mycologia, 1950), nấm được phát triển tại chỗ hạn chế thấp nhất sự
xáo trộn. Phương pháp đơn giản được cải tiến chỉ sử dụng một mẩu thạch
dinh dưỡng nhỏ như là thạch khoai tây đường (potato dextrose) , tuy nhiên,
một số loại nấm khó mọc có thể dùng thạch bột ngô hoặc thạch Dox Czapek.
để kích thích hình thành bào tử.
1. Sử dụng một lưỡi dao vô trùng cắt một khối thạch (7 x 7 mm) từ
đĩa thạch, Lấy khối thạch đặt bên trên đĩa thạch.
2. Đặt một lamen lên bề mặt của tấm thạch.
3. Cấy vào bốn mặt của khối thạch với các bào tử hoặc các mảnh sợi
nấm cần nuôi cấy.
4. Đậy đĩa thạch
5. Ủ các đĩa ở 26oC cho đến khi bào tử hình thành và phát triển (4-7
ngày).
6. Khi nấm đã mọc và bám lên lamen, nhấc nhẹ nhàng lamen ra khỏi
mẩu thạch.
7. Nhỏ một giọt cồn 95% như một chất làm ướt lên lamen

18

8. Nhẹ nhàng nhỏ một giọt nhỏ Lactophenol Coton màu xanh trên
một slide thủy tinh sạch.
9. Âp nhẹ nhàng lamen lên giọt Lactophenol cotton để lại qua đêm
cho khô và sau đó gắn lamen vào lam thủy tinh bằng sơn bóng.
10. Quan sát dưới kính hiển vi

Mô tả khúm nấm và bào tử của S.schenckii
Tại 25oC, khuẩn lạc nấm chậm phát triển, mắt khuẩn lạc trông ẩm và
nhẵn , bề mặt nhăn nheo nhiều nếp gấp. Một số chủng có thể sinh sợi nấm
ngắn trên không và sắc tố có thể thay đổi từ trắng đến kem sang màu đen. Các
bào tử đính phát sinh ở các góc từ vách mỏng của sợi nấm và thường chỉ có
một, mọc thẳng và nhỏ dần về phía đỉnh (như điếu xì gà). Bào tử nấm được
phát triển thành cụm có nhiều mấu nhỏ, với nhiều gố nhỏ chứa bào tử đính
trông như một bông hoa (hoa đào). Tùy vào thời gian nuôi cấy, bào tử nấm
được hình thành bào tử đính và sợi nấm không khác biệt. Bào tử nấm có hình
trứng 3-6 x 2-3 um, trong suốt, có một vách ngăn và rất mỏng. Trên thạch
máu BHI ở 37 oC, khúm nấm nhẵn, trắng xám vàng và giống khúm nấm men,
có các tế bào nấm men hình cầu hay hình bầu dục vừa chớm nở.


19


Tách chiết DNA và phản ứng PCR
Kỹ thuật tách chiết DNA:
Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất

- Hoá chất và sinh phẩm để ở nhiệt độ phòng
- Chuẩn bị bồn ủ nhiệt 56
o
C và 70
o
C.
- Hoá chất gồm AL, AE, AW1, AW2 và ethanol 100%.
- Ống nghiệm và cột lọc DNA được cung cấp trong bộ hoá chất.
Tiến trình tách chiết DNA :
- Ly tâm ống nghiệm có chứa mẫu 1000rpm/30 giây để làm lắng mẫu
trên nắp ống nghiệm.
- Thêm vào ống nghiệm 200l dung dịch AL, trộn đều 15 giây, sau đó
cho vào bồn ủ 70
o
C trong 10 phút. Ly tâm ống nghiệm có chứa mẫu
1000rpm/30 giây để làm lắng mẫu trên nắp ống nghiệm.
- Thêm vào ống nghiệm 200l Ethanol 100%, trộn đều, thật mạnh trong
15 giây, sau đó ly tâm ống nghiệm có chứa mẫu 1000rpm/30 giây để làm lắng
mẫu trên nắp ống nghiệm.


20

- Chuyển toàn bộ hỗn dịch trên vào cột lọc DNA, Ly tâm 8000rpm/1
phút. Chuyển cột lọc trên sang ống nghiệm khác, thêm vào cột lọc 500l dung
dịch AW1. Ly tâm 8000rpm/1 phút.
- Chuyển cột lọc trên sang ống nghiệm khác, thêm vào cột lọc 500l
dung dịch AW2. Ly tâm 13.000rpm/3 phút.
- Chuyển cột lọc trên sang ống nghiệm khác. Ly tâm 13.000rpm/1 phút
để loại bỏ toàn bộ hóa chất còn dính trên màng lọc.

- Chuyển cột lọc trên sang ống nghiệm có nắp, ghi mã số mẫu, thêm vào
cột lọc 100l dung dịch thôi DNA, để ở nhiệt độ phòng 1 phút. Ly tâm 8000rpm/1
phút. Phần dịch li tâm là dung dịch có chứa DNA.
- Giữ mẫu DNA trong tủ lạnh -20
o
C, cho đến khi sử dụng.
Phản ứng PCR và Nested PCR
Gen đích:
- M85053  18S rRNA gene of S. schenckii
Trình tự các mồi
SS1, 5’-CTC GTT CGG CAC CTT ACA CG-3’, (1007-1026)
SS2, 5’-CGC TGC AGC CAA AAC GCG GG-3’, (1311-1292)
Sản phẩm PCR: 305-nucleotide.
SS3, 5-ACT CAC CAG GTC CAG ACA CGA TG-3’; (1146-1168)
SS4, 5’-CGC TTT GGG AGG TTA AGC AG-3’, (1297-1275)
Sản phẩm PCR 152-nucleotide.




21

Thành phần phản ứng PCR:
PCR1:
- Nước tinh khiết 30,5 l
- Buffer 5 l
- dNTP (A-T-G-C) 5 l
- Primers SS1 2 l
- Primers SS2 2 l
- Taq-polimerase ( Takara) 0,5 l

- DNA khuôn (Templat) 5 l
PCR2:
- Nước tinh khiết 32,5 l
- Buffer 5 l
- dNTP (A-T-G-C) 5 l
- Primers SS3 2 l
- Primers SS4 2 l
- Taq-polimerase ( Takara) 0,5 l
- DNA product PCR1 2 l
Nested PCR fungi với chu trình nhiệt:
1 chu kì 95
0
C 5 phút
40 chu kì 95
0
C 1 phút
68
0
C 1 phút
72
0
C 1 phút
1 chu kì 72
0
C 10 phút



22

Điện di phát hiện:
1. Pha dung dịch TAE 1 X bằng cách cho thêm 960 ml nước cất vào với 40
ml TAE 25X được cung cấp, lắc đều.
2. Đun thạch Agarose 2% bằng cách trộn 2gram Agarose được cung cấp
trong 100 ml TAE 1X. Đun tan thạch trong lò viba hay đun cách thủy
cho đến khi tan hòan toàn, trong lúc đun thỉnh thoảng lắc dung dịch
agarose để đảm bảo tan hết. Đừng để dung dịch agarose sôi trào ra ngoài.
3. Để thạch nguội ở nhiệt độ phòng khoảng 10 phút, cho vào thạch 4 l
Ethidium bromide 10mg/ml (hóa chất độc nên cẩn thận khi thao tác,
mang găng tay, tránh hít vào mũi, và tránh dính vào da), trộn hòa tan đều
Ethidium bromide vào trong thạch, tránh làm thạch có bọt khí khi trộn.
4. Chuẩn bị khuôn đổ thạch, đặt lược vào khuôn, rồi đổ thạch vào khuôn
cho đạt bề dày mong muốn (khoảng 4-5mm). Để thạch nguội và đặc
trong nhiệt độ phòng.
5. Khi thạch đặc, gỡ lược. Đặt thạch vào trong máng điện di, đổ dung dịch
TAE 1X cho ngập mặt thạch.
6. Chuẩn bị mẫu thử bằng cách cho 12 l Loading buffer vào trong mỗi
mẫu thử (50l), thay đầu cone sau mỗi lần nhỏ, vortex nhẹ để trộn đều.
7. Dùng micropipette cho mẫu vào giếng theo thứ tự, nếu cần cho 1 giếng
chứa DNA marker để so chuẩn DNA. Chạy điện di trong 20- 30 phút ở
dòng điện 100V.
8. Sau khi chạy xong (khi thấy vệt màu xanh cách giếng khoảng 2-2.5 cm)
lấy khuôn ra khỏi máng và đẩy gel lên hộp UV. Xem các band DNA
dưới tia sáng của đèn UV.


23

.
Các xét nghiệm khác: XQ xương, phổi thẳng và nghiêng, công thức máu,

chức năng gan,…trước và sau điều trị.
2.2.3.3 Nghiên cứu hiệu quả điều trị:
Đánh giá hiệu quả điều trị bệnh Sporotrichose bằng Itraconazole (Spral) :
- Bệnh nhân Sporotrichose được giải thích và đồng ý hợp tác điều trị,
uống Itraconazole 100mg, ngày 2 viên, uống sau bữa ăn, trong 3 tháng.
- Thương tổn tại chổ: bôi dung dịch Iốt 10% ( dung dịch Povidin 10%)
- Bệnh nhân được dặn quay lại tái khám sau 10 ngày,1 tháng, 2 và 3
tháng để kiểm tra đáp ứng điều trị, lâm sàng, các xét nghiệm cần thiết:
+ Hỏi bệnh nhân về việc tuân thủ điều trị
+ Hỏi bệnh nhân về các tác dụng phụ của thuốc
+ Khám để xem và đánh giá các tiến triển lâm sàng
+ Làm các xét nghiệm khi cần thiết: công thức máu, chức năng
gan, thận,


24

- Đánh giá hiệu quả điều trị:
+ Kết quả tốt: lành bệnh khi bệnh nhân hết các triệu chứng lâm sàng,
thương tổn trên da lành hẳn và hóa sẹo thì cho bệnh nhân ngưng thuốc và theo
dõi sau 10 ngày,1 tháng điều trị…
+ Kết quả không tốt: thương tổn trên da không lành,tiến triển nặng hơn
và lan rộng, loét, sùi và bội nhiễm…
2.3. Xử lý và phân tích số liệu:
- Kiểm tra, mã hóa, tạo tập tin dữ liệu
- Phân tích dữ liệu : dùng phần mềm SPSS 15.0 để xử lý số liệu.
2.4. Đạo đức trong nghiên cứu:
- Nghiên cứu giúp tìm hiểu rỏ hơn về tình hình đặc điểm lâm sàng của
bệnh Sporotrichose và các yếu tố liên quan lây nhiễm, qua đó đề xuất các biện
pháp phòng chống trong cộng đồng.

- Các kỷ thuật nghiên cứu không gây ra bất cứ một tác hại nào trên
bệnh nhân.
- Bệnh nhân được giải thích về mục tiêu nghiên cứu và đồng ý tham gia
- Mọi thông tin về bệnh nhân được giữ bí mật.
- Đề cương nghiên cứu sẽ được Hội đồng chấm đề cương luận văn
chuyên khoa cấp II Trường đại học Y Hà nội xét duyệt thông qua.


25

CHƯƠNG 3
DỰ KIẾN KẾT QUẢ

3.1. Phân tích tình hình, đặc điểm hình thái lâm sàng bệnh Sporotrichose
và các yếu tố liên quan :
Đặc điểm BN: tuổi, giới, dân tộc, địa chỉ,trình độ học vấn, nghề nhiệp.
B¶ng 3.1: Ph©n bè tuæi (n=50)
Nhóm tuổi
Số bệnh nhân
Tỷ lệ%
n
%
< 20



20 - 29

30 - 39



> 40











Tổng



B¶ng 3.2: Ph©n bè theo d©n téc (n=50)
Dân téc
Số bệnh nhân
Tỷ lệ%
Kinh


Thiểu sè

Tổng