Luận văn : PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH CẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR part 3 potx

33









Hình 4.2. Vi khuẩn Lxx dƣới kính hiển vi (độ phóng đại 1000 lần).
Kết quả quan sát sự xuất hiện của vi khuẩn Lxx trong dịch chiết nƣớc mía dƣới
kính hiển vi cho kết quả: trong 6 giống mía sản xuất đƣợc khảo sát tại TTNNCMĐ thì
chỉ có giống VN84-1437 và R570 là không nhiễm bệnh, còn lại 4 giống mía khác là
C90-127, DLM24, VN85-1427 và ROC26 đều thấy đƣợc sự xuất hiện của vi khuẩn
Lxx dƣới kính hiển vi (xem Bảng 4.1). Tuy nhiên, phƣơng pháp chẩn đoán này cho tỉ
lệ kết quả dƣơng tính giả và âm tính giả khá cao. Nguyên nhân ở đây là sự phát hiện vi
khuẩn Lxx trong dịch chiết dƣới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần là rất khó khi
nồng độ vi khuẩn nhiễm bệnh hiện diện trong dịch chiết thấp.

Bảng 4.1. Kết quả chẩn đoán bệnh cằn mía gốc trên các giống sản xuất tại
TTNCMĐ và nông trƣờng Thọ Vực bằng phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi.
TTNCMĐ
Nông trƣờng Thọ Vực
STT
Giống
Kết quả
STT
Giống

Kết quả
1
2
3
4
5
6
C90-127
VN84-4137
DLM24
R570
VN85-1427
ROC26
+
-
+
-
+
+
1
2
3
4
5
Mi55-14
VN84-4137
QĐ368
VĐ85-177
VN85-1427
+

-
+
+
+
Chú thích: - : Mẫu âm tính +: Mẫu dương tính.
Thân mía đƣợc nhuộm bằng dung dịch thuốc nhuộm safranin, sau 30 phút làm tiêu
bản xem dƣới kính hiển vi với độ phóng đại 40 và 100 lần, ta sẽ thấy có sự nhuộm màu


34


hay không nhuộm màu của các bó mạch khoẻ mạnh và bị nhiễm Lxx. (xem hình 4.3).
Mạch đƣợc nhuộm màu đỏ của safranin là kết quả của sự thẩm thấu dung dịch thuốc
nhuộm lên trên thân, còn mạch không đƣợc nhuộm màu là do vi khuẩn Lxx tồn tại
trong bó mạch làm tắt nghẽn sự lƣu thông của dung dịch thuốc nhuộm đi lên lên trên.

Hình 4.3. Mẫu thân nhuộm safranin dƣới kính hiển vi (x 40 lần (A) và x 100 lần (B)).
Chú thích: a: mạch vàng có chứa vi khuẩn; b: mạch đỏ là không có vi khuẩn.
Chẩn đoán bằng phƣơng pháp nhuộm STM cho kết quả: tất cả các giống mía sản
xuất khảo sát tại TTNCMĐ và nông trƣờng Thọ Vực đều bị nhiễm bệnh cằn mía gốc
với các mức độ nhiễm bệnh khác nhau. (xem bảng 4.2).
Bảng 4.2. Kết quả chẩn đoán bệnh cằn mía gốc dựa trên phƣơng pháp nhuộm STM.

Chú thích: Tb: Trung bình
TTNCMĐ
Nông trƣờng Thọ Vực
TT
Giống
Tỉ lệ

mạch
nhuộm
đỏ (%)
Mức độ
nhiễm
bệnh
TT
Giống
Tỉ lệ
mạch
nhuộm
đỏ (%)
Mức độ
nhiễm
bệnh
1
2
3
4
5
6
C90-127
VN84-4137
DLM24
R570
VN85-1427
ROC26
79,18
54,67
54,67

75,28
80,42
78,82
Tb
Nặng
Nặng
Tb
Tb
Tb
1
2
3
4
5
My55-14
VN84-4137
QĐ368
VĐ85-177
VN85-1427
68,11
82,82
79,18
79,88
65,90
Nặng
Tb
Tb
Tb
Nặng
Trung bình tỉ lệ

mạch nhuộm đỏ
70,50 Trung bình 75,18 Trung bình
a
b


35


Bảng 4.2 cho thấy tỉ lệ mạch đƣợc nhuộm màu có sự khác nhau giữa các giống: cao
nhất ở giống VN84-4137 (82,82%) tại nông trƣờng Thọ Vực, thấp nhất là giống
VN84-4137 và DLM24 (54,67%) tại TTNCMĐ. Điều này tƣơng đƣơng với giống
VN84-4137 tại Thọ Vực bị nhiễm trung bình, giống VN84-4137 và DLM24 bị nhiễm
nặng với bệnh cằn mía gốc.
Về kết quả phát hiện vi khuẩn Lxx thì phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi và
phƣơng pháp nhuộm STM cho kết quả ở Bảng 4.3.
Bảng 4.3. Kết quả chẩn đoán của hai phƣơng pháp: dùng kính hiển vi và nhuộm STM.
Chú thích: STM: Nhuộm Safranin mô cây mía - : Mẫu âm tính
KHV: Chẩn đoán dựa vào kính hiển vi +: Mẫu dương tính
Nhận xét: Kết quả chẩn đoán bệnh cằn mía gốc bằng phƣơng pháp quan sát dƣới
kính hiển vi và nhuộm STM trên các giống cho thấy rằng hầu nhƣ tất cả các giống sản
xuất đƣợc kiểm tra tại TTNCMĐ và nông trƣờng Thọ Vực đều bị nhiễm RSD.
Nguyên nhân của tình hình trên có thể là do thiếu sự nghiên cứu thống kê về tình
hình bệnh, cũng nhƣ thông kê số liệu về mức độ thiệt hại do bệnh cằn mía gốc gây ra ở
nƣớc ta nói chung và các giống mía ở TTNCMĐ và nông trƣờng Thọ Vực nói riêng.
Từ đó ngƣời dân vẫn chƣa quan tâm đúng mức đến việc phòng chống tác nhân gây
bệnh. Mặt khác, nguyên nhân cũng có thể là do triệu chứng của bệnh cằn mía gốc
không đặc trƣng và khó có thể phân biệt đƣợc cây bị bệnh. Vì vậy ngƣời nông dân sẽ
không biết đƣợc ruộng mình bị nhiễm bệnh cằn mía gốc khi nào và đôi khi lầm lẫn
TTNCMĐ

Nông trƣờng Thọ Vực
STT
Giống
Phƣơng pháp
chẩn đoán
STT
Giống
Phƣơng pháp
chẩn đoán
KHV
STM
KHV
STM
1
2
3
4
5
6
C90-127
VN84-4137
DLM24
R570
VN85-1427
ROC26
+
-
+
-
+

+
+
+
+
+
+
+
1
2
3
4
5
My55-14
VN84-4137
QĐ368
VĐ85-177
VN85-1427
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+


36

rằng ruộng mình bị thiếu dinh dƣỡng hay bị sâu bệnh phá hoại. Kết quả có ý nghĩa
thực tiễn trong việc thống kê tình hình nhiễm bệnh RSD trên các giống mía khảo sát.
4.2.2. Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nuôi cấy vi khuẩn Lxx
và nhận dạng khuẩn lạc của nó trên môi trƣờng nuôi cấy
Vi khuẩn Lxx là vi khuẩn rất khó nuôi cấy trên môi trƣờng nhân tạo, khuẩn lạc vi
khuẩn theo nghiên cứu là phải mất đến khoảng 22 ngày nuôi cấy trên môi trƣờng đặc
trƣng mới hình thành đƣợc (Stevens Brumbley, 2003). Do vậy thời gian 2 tháng để
nghiên cứu nuôi cấy vi khuẩn Lxx trên môi trƣờng nhân tạo là quá ngắn và kết quả thu
đƣợc cũng hạn chế, không có bào tử của vi khuẩn Lxx hình thành. Tuy nhiên, sau quá
trình nghiên cứu chúng tôi cũng thu đƣợc một số kết quả nhất định cụ thể nhƣ sau:
- Quan sát và theo dõi quá trình hình thành khuẩn lạc của vi khuẩn Lxx trên môi
trƣờng nuôi cấy hàng ngày kể từ lúc bắt đầu cấy đến khoảng 15 - 22 ngày (ủ ở
28
O
C). Theo đó thì chỉ sau khi cấy mẫu dịch chiết vào môi trƣờng nuôi cấy 1 ngày
thì các vi khuẩn đã bắt đầu mọc trên môi trƣờng nuôi cấy. Đặc biệt là vào những
ngày đầu tiên, đã có sự xuất hiện của các khuẩn lạc giống nhƣ khuẩn lạc của vi
khuẩn Lxx đƣợc Davis (1980) mô tả ,đó là khuẩn lạc nhỏ đƣờng kính từ 0,1 - 0,3
mm, không màu. Tuy nhiên sau vài ngày nuôi cấy các khuẩn lạc này lớn dần lên
và có màu vàng (Hình 4.4). Thậm chí sau 15 - 20 ngày nuôi cấy vẫn còn một số
vùng trên đĩa nuôi cấy có các khuẩn lạc có kích thƣớc và hình dạng tƣơng tự, tuy
nhiên khi phân lập ra môi trƣờng trên đĩa khác thì lại không phải Lxx mà vẫn là
loại vi khuẩn có khuẩn lạc màu vàng này.

A B
Hình 4.4. Khuẩn lạc nhỏ tƣơng tự nhƣ khuẩn lạc Lxx trên môi trƣờng sau 2 ngày nuôi
cấy (A); và khuẩn lạc của nó sau khi phân lập (B).


37



- Theo quan sát thì có khoảng 3 loại vi khuẩn tồn tại trên môi trƣờng nuôi cấy và một
số loài nấm. Các loại này đều phát triển trên môi trƣờng nuôi cấy đôi lúc nhanh (sau
vài ngày) nhƣng cũng có lúc chậm (nhiều đĩa nuôi cấy có vi khuẩn mọc lên với hình
dạng và kích thƣớc giống mô tả, khuẩn lạc này giữ nguyên hình dạng và kích thƣớc
cho đến 20 ngày sau nuôi cấy). Tuy nhiên đây không phải là vi khuẩn Lxx, mà vẫn là
loại vi khuẩn có khuẩn lạc màu vàng.
Do hạn chế về mặt tài liệu nghiên cứu nên môi trƣờng mà chúng tôi sử dụng để
nuôi cấy vi khuẩn Lxx là môi trƣờng SC (Davis, 1980) và có bổ sung thêm một số
thành phần theo Stevens Brumbley (2003) là chƣa hoàn chỉnh. Theo nghiên cứu mới
đây của Stevens Brumbley thì môi trƣờng thích hợp hơn và thời gian hình thành bào tử
ngắn hơn (khoảng 15 ngày) là do vi khuẩn đƣợc nuôi trên môi trƣờng MSC (Teakle,
12992) có bổ sung thêm methionine (L. E.Camargo và ctv, 2004).
Có sự tạp nhiễm trên là do thành phần môi trƣờng nuôi cấy không thích hợp, các
kháng sinh và acid amin không tinh nên khó tan trong dung dịch nƣớc. Mặt khác dịch
vi khuẩn đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy là dịch không vô trùng nên sẽ có rất nhiều vi
khuẩn hình thành trên môi trƣờng rất giàu dinh dƣỡng cho vi khuẩn Lxx này. Do vậy
cần thiết lập một quy trình chuẩn bị mẫu vô trùng dành cho nuôi cấy vi khuẩn mới có
hiệu quả đƣợc.
4.2.3. PCR phát hiện vi khuẩn Lxx

Song song với việc nuôi cấy vi khuẩn Lxx, chúng tôi cũng tiến hành chạy PCR trực
tiếp trên dịch chiết của cây mía bị bệnh. Sau nhiều lần tiến hành thí nghiệm, thay đổi quy
trình và sử dụng các chất bổ sung khác nhau vào phản ứng PCR, nhƣng kết quả PCR dựa
vào cặp mồi của Stevens Brumbley (2003) đều không đạt đƣợc kết quả mong đợi.
- Kết quả thí nghiệm 1: PCR theo protocol của Stevens Brumbley (2003).
Kết quả điện di: Không có sản phẩm trên gel điện di.
Nhận xét: Nguồn mẫu DNA đƣợc chuẩn bị theo quy trình của Stevens
Brumbley (2003) để chạy phản ứng PCR. Primer đƣợc đặt mới tại công ty
Biorad với trình tự đƣợc blast trên NCBI có kết quả cho bắt cặp đặc hiệu với
vi khuẩn Lxx trên ngân hàng gen. Tuy nhiên kết quả điện di không có thì
nguyên nhân có thể là do quy trình thực hiện chƣa tối ƣu hoặc do DNA mẫu


38


đƣa vào chƣa đƣợc biến tính tốt.
- Thí nghiệm 2: Thay đổi cách chuẩn bị mẫu. Khảo sát hiệu quả của hai phƣơng
pháp chuẩn bị mẫu: Biến tính bằng nhiệt và li trích DNA vi khuẩn Lxx. Chạy
PCR theo thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt nhƣ ở thí nghiệm 1.
Mẫu đƣợc chuẩn bị và đem đi đo OD, tính kết quả lƣợng DNA có trong mẫu
và thêm vào trong thành phần phản ứng PCR với nồng độ thƣờng dùng là 0,5
μM. Kết quả: không có băng DNA trên gel điện di. Nhận xét: Do OD không
có tác dụng trong trƣờng hợp này vì dịch chiết nƣớc mía có chứa nhiều nhân tố
ức chế nên lƣợng DNA đo đƣợc không chính xác với thực tế DNA mẫu vi
khuẩn trong mẫu. Tăng lƣợng DNA mẫu đƣa vào phản ứng PCR lên 1,5 và 2
lần cũng không cho kết quả vì điều này cũng đồng nghĩa với việc tăng các
nhân tố ức chế phản ứng PCR.
Hút DNA từ lớp trên của dịch biến tính đem chạy PCR. Tăng lƣợng DNA mẫu
đƣa vào phản ứng với nồng độ gấp 1,5 lần, 2 lần. Kết quả: không có băng

DNA trên gel điện di. Nhận xét: DNA sau khi biến tính sẽ nằm ở lớp trên dung
dịch vì vậy chúng tôi sử dụng lớp này chạy PCR nhằm thu lƣợng DNA sạch,
Tuy nhiên kết quả PCR không cho sản phẩm khuyếch đại thì có thể là do biến
tính Lxx. Có lẽ trong quá trình biến tính vi khuẩn bằng cách gia nhiệt, thành tế
bào vi khuẩn bị phá vỡ và DNA vi khuẩn Lxx thoát ra ngoài, tuy nhiên quá
trình này cũng giải phóng ra các enzym phân hủy hoặc làm hƣ hỏng DNA vốn
tồn tại trong tế bào. Do vậy chúng tôi thử nghiệm ly trích DNA vi khuẩn từ
dịch chiết nƣớc mía.
Thực hiện lọc mẫu dịch vi khuẩn ở màng lọc 0,4 μm; chuẩn bị mẫu cho phản
ứng PCR, tƣơng tự nhƣ quy trình của Stevens Brumbley (2003). Nhận xét:
Dùng màng lọc 0,4 μm lọc Lxx và kiểm tra vi khuẩn có qua lỗ lọc không bằng
cách quan sát dƣới kính hiển vi. Kết quả quan sát dƣới kính hiển vi kiểm tra
không thấy có sự hiện diện của vi khuẩn Lxx trong dịch lọc. Chúng tôi nhận
định rằng có thể màng lọc 0,4 μm có kích thƣớc nhỏ nên vi khuẩn Lxx không
qua đƣợc, hoặc có qua nhƣng ít và không thể quan sát đƣợc dƣới kính hiển vi.
Do vậy chúng tôi vẫn tiếp tục thực hiện cách biến tính mẫu nhƣ quy trình của
Stevens Brumbley và đem do OD sản phẩm, hút DNA mẫu ở lớp trên dịch
biến tính để chạy PCR nhƣng vẫn không đạt đƣợc kết quả. Kết luận: Không


39


thể loại bỏ đƣợc các nhân tố ức chế phản ứng PCR trực tiếp trong dịch chiết
nƣớc mía bằng cách ly tâm đƣợc.
Li trích vi khuẩn Lxx trong dịch chiết nƣớc mía theo quy trình ly trích vi khuẩn
thông thƣờng. Kết quả: Không có băng DNA vi khuẩn trên gel điện di sau li
trích. Nhận xét: Có thể do lƣợng vi khuẩn Lxx trong dịch chiết nƣớc mía có ít
nên thực hiện li trích DNA không có kết quả.
- Thí nghiệm 3: Khảo sát hiệu quả sử dụng của PVP trong PCR trực tiếp từ dịch

chiết nƣớc mía.
Kết quả: không có sản phẩm PCR đích.
Nhận xét: Tăng hàm lƣợng PVP vào phản ứng nhằm mục đích tăng cƣờng khả
năng khử các nhân tố ức chế phản ứng PCR, tuy nhiên có lẽ khi nồng độ PVP
cao thì nó cũng quay lại ức chế phản ứng PCR do đó chúng tôi không tăng
nồng độ PVP trong các thí nghiệm tiếp theo nữa. Do vậy chúng tôi tiếp tục
làm thí nghiệm theo hai hƣớng. Thứ nhất là giữ nguyên cách chuẩn bị mẫu
DNA cho PCR theo Stevens Brumbley (2003) và thay đổi quy trình phản ứng.
Thứ hai là thay đổi quy trình chuẩn bị mẫu DNA cho PCR.
- Thí nghiệm 4: Chuẩn bị mẫu theo quy trình của Stevens Brumbley. Khảo sát ảnh
hƣởng của các thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt.
Kết quả thí nghiệm: Không có sản phẩm trên gel điện di.
Tóm lại, PCR là một hệ thống tƣơng thích các thành phần hóa chất và chu trình
nhiệt. Nhiều trƣờng hợp phản ứng PCR đƣợc thực hiện từ dịch DNA mẫu ly trích với
mồi chuyên biệt nhƣng vẫn không ra kết quả. Vì vậy PCR trực tiếp từ dịch chiết nƣớc
mía là một vấn đề rất khó thực hiện vì nguồn mẫu ban đầu là dịch chiết nƣớc mía
không sạch, có chứa nhiều nhân tố ức chế phản ứng PCR. Kết quả điện di sản phẩm
sau các lần chạy PCR mà không có băng DNA đích trên gel điện di thì có thể là do rất
nhiều nguyên nhân:
- Có thể là nguồn DNA mẫu đƣa vào trong phản ứng PCR không tinh sạch. Chúng
tôi tiến hành ở đây là do trong dịch chiết có quá nhiều chất lơ lửng, ức chế phản
ứng PCR. Nguồn mẫu dịch chiết mà chúng tôi dùng để chạy phản ứng PCR đƣợc
thu từ những cây có triệu chứng điển hình ngoài đồng ruộng, kết hợp với kiểm
tra quan sát sự xuất hiện vi khuẩn Lxx trong dịch chiết mía dƣới kính hiển vi và
dƣơng tính khi nhuộm STM. Tuy nhiên mặc dù đã xác định đƣợc lƣợng mẫu đƣa


40

vào là có vi khuẩn đích nhƣng còn quá nhiều yếu tố không thể kiểm soát đƣợc
nhƣ các chất ức chế phản ứng có trong dịch chiết nƣớc mía, lƣợng mẫu DNA
thích hợp đƣa vào phản ứng.
- Có thể hóa chất mà chúng tôi sử dụng sau nhiều lần thực hiện phản ứng đã làm
đông lạnh và rã đông nhiều lần dẫn đến sự mất hoạt tính của hóa chất đặc biệt là
Taq DNA polymerase và primer.
- Mặt khác các máy PCR khác nhau cũng cho kết quả khác nhau. Hiện TTPT có 3
loại máy PCR và mỗi máy có một chế độ lên xuống nhiệt độ theo chu kỳ nhiệt
khác nhau (nhanh hay chậm) do vậy đây cũng là một nguyên nhân không thể loại
trừ. Tuy nhiên sau khi thực hiện PCR luân phiên trên cả 3 loại máy vẫn không có
kết quả.



41


Phần 5. KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
- Các giống mía đƣợc khảo sát không bị nhiễm SCMV.
- Tỉ lệ mô cây không bị nhiễm bệnh cằn mía gốc trên các giống mía khảo sát
trong phƣơng pháp nhuộm STM tại TTNCMĐ là 70,5%, tại nông trƣờng Thọ
vực là 75,18%.
- Nuôi cấy phân lập vi khuẩn Lxx chƣa thu đƣợc khuẩn lạc.
- Phát hiện vi khuẩn Lxx dựa vào kỹ thuật PCR trực tiếp dịch chiết nƣớc mía
chƣa đạt đƣợc kết quả mong muốn.
5.2. Đề nghị
- Tiến hành điều tra khảo sát tình hình bệnh khảm lá mía và cằn mía gốc trên
nhiều giống mía ở các giai đoạn tăng trƣởng khác nhau, và thực hiện tại các
vùng mía lận cận để có cái nhìn tổng quát và chính xác hơn về tình hình diễn

biến của bệnh tại 2 khu vực này. Đặc biệt là đối với bệnh cằn mía gốc, cần tiến
hành bố trí thí nghiệm trên nhiều giống khác nhau đối chứng với giống không
bị bệnh, để cuối cùng có con số thống kê chính xác về tình hình và mức độ gây
hại của bệnh hiện nay, từ đó có những khuyến cáo thích hợp trong việc phòng
trừ và kiểm soát bệnh.
- Qua quá trình tìm hiểu về bệnh cùng với sự hỗ trợ về kiến thức của GS. Stevens
Brumbley (Australia), ngƣời đã có kinh nghiệm nghiên cứu lâu năm về bệnh
cằn mía gốc và vi khuẩn Lxx, chúng tôi xin đề nghị về quy trình nuôi cấy thu
khuẩn lạc vi khuẩn Lxx, cũng nhƣ quy trình PCR trực tiếp từ dịch chiết nƣớc
mía nhƣ sau trong các thí nghiệm tiếp theo nhƣ sau:
 Quy trình nuôi cấy vi khuẩn Lxx
 Xác định triệu chứng ngoài đồng ruộng.
 Xác định cây nhiễm bệnh cằn mía gốc bằng phƣơng pháp nhuộm STM.
 Thu dịch chiết (tiến hành vô trùng), kiểm tra sự hiện diện của Lxx dƣới
kính hiển vi điện tử hay đối pha (Phụ lục 1).
 Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trƣờng MCS có bổ sung các thành phần theo
Stevens Brumbley (2003) và L. E Camargo (2004).


42


 Tăng sinh trong môi trƣờng lỏng S8 để thu sinh khối (Thành phần môi
trƣờng nuôi cấy cho ở Bảng phụ lục 2).
 Quy trình PCR phát hiện vi khuẩn Lxx:
 Nuôi cấy thu sinh khối vi khuẩn Lxx, thực hiện li trích DNA vi khuẩn Lxx
theo quy trình cho ở Phụ lục 3.
 Thực hiện phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn Lxx
 Sau khi ổn định quy trình rồi thì tiến hành PCR trực tiếp từ dịch chiết nƣớc
mía dựa trên đối chứng dƣơng là vi khuẩn Lxx đã nuôi cấy đƣợc.

43


TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT
1. Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn, 8/2006. Báo cáo tổng kết mía đường năm
2005-2006.
2. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 1999. Di truyền phân tử. Nhà xuất bản nông
nghiệp.
3. Đỗ Ngọc Diệp, 2002. Nghiên cứu sâu đục thân hại mía và biện pháp phòng trừ ở
vùng Đông Nam Bộ. Luận án tiến sỹ, Đại học Nông Nghiệp I, Hà Nội.
4. Hà Đình Tuấn, 2004. Điều tra thành phần hại mía trên một số giống mới nhập nội
và khảo sát diễn biến bệnh hại quan trọng ở vùng mía nguyên liệu vùng Đông
Nam Bộ. Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp. Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí
Minh.
5. Lê Song Dự, Nguyễn Thị Quí Mùi, 1997. Cây mía. Nhà xuất bản Nông nghiệp
Tp. Hồ Chí Minh.
6. Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999. Bệnh vi khuẩn và virus hại cây trồng. Nhà
xuất bản Giáo dục.
7. Nguyễn Thị Lang, 2002. Phương pháp cơ bản trong nghiên cứu công nghệ sinh
học. Nhà xuất bản Nông nghiệp TP. Hồ Chí Minh.
8. Nguyễn Huy Ƣớc, 1994. Kỹ thuật trồng mía. Nhà xuất bản Nông nghiệp.
9. Nguyễn Văn Tuất, 2002. Kỹ thuật chẩn đoán và giám định bệnh hại cây trồng.
Nhà xuất bản Nông nghiệp.
10. Phạm Văn Ty, 2001. Miễn dịch học. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Hà Nội.
11. Phan Gia Tân, 1990. Cây mía. Tủ sách ĐH Nông Lâm.

12. Trƣơng Lê Bạch Liên, 2005. Điều tra và phát hiện bệnh khảm lá (Sugarcane
Mosaic Virus) trên cây mía (Sacccharum spp) bằng kỹ thuật ELISA và bước đầu
xây dựng kỹ thuật RT-PCR. Luận văn tốt nghiệp kỹ sƣ Nông học, Đại học Nông
Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam.
13. Vũ Triệu Mân, 2003. Chẩn đoán bệnh hại thực vật. Nhà xuất bản Nông nghiệp.
TIẾNG NƢỚC NGOÀI
14. Andreas Westphal and T. Eril Mirkov, 2003. Need for improved detection of
Ratoon stunting disease in Sugarcane in South Texas. Phytopathology 7: p 133 -
136.


44


15. Alfred. Hercules, 2000. Aurum Total RNA Mini Kit Instruction Manual Bio-Rad
Laboratories, p 26-27.
16. Chemicon International, Inc - 28820 Single Oak Drive - Temecula, CA 92590,
Introduction to Antibodies - Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
<
17. Damann. K.E, Jr. 1988. Alkaline-induced metaxylem autofluorescence: a
diagnostic symptom of ratoon stunting disease of sugarcane. Phytopathology 78: p
233 - 236.
18. Fegan, 1999. Sensitive and specific detection of Clavibacter xyli subsp. xyli,
causal agent of ratoo stunting disease os sugarcane , with a polymerase chain
reaction-based assay. Phytopathology, p 33 - 36.
19. John R. Crowther, 2001, The Elisa Guidebook – Volume 149, p 12 – 34.
20. Gillaspie Jr., A.G. Davis, M.J. (1992): Ratoonstunting disease of sugarcane. In
Plant disease of International Importance. Disease of sugar, Forestand Plantation
Crops, vol4 (A.N. Mukhopadhyay,J. Kamar, H.S. Chaube, U.S.Singh, eds).
EnglewoodCliffs: New Jersey, Prentice Hall, p 41 – 61.

21. G.P. Rao, A. Salem Saumtally, Phillippe Rott. (2004). Sugarcane pathology.
Volume III: Bacteria and nematode diseases, p 1 – 225.
22. Hoy J. W; Grisham M. P. and Damann K.E, 1999. Spread and increase of ratoon
stunting disease and comparison of disease detection methods. In Plant disease.
23. Koike H, and Gillaspie A.G, 1989. Mosaic. In: Diseases of Sugarcane: Major
diseases, (Edited by C. Recaud, B. T. Egan, A.G. Gillaspie, C. G. Hughes).
International Society of Sugarcane Technologist, p 301-322.
24. P. Taylor and Stevens Brumbley, 2003. Development of PCR –based markers for
detection of Leifsonia xyli subsp. xyli in fibrovascular fluid of infected sugarcane
plants. CSIRO publishing.
25. Y Pan, 1998. A polymerase chain reaction protocol for detection of Clavibacter
xyli subsp xyli, the causal bacterium of sugarcane ratoon stunting.
Phytopathology: p 1 – 8.
26. Biowave vol.6 No.23 2004, tomato spotted wilt virus.
<www.bric.postech.ac.kr/webzine/content/review/virology/2005/v7n12/pv0616.pdf >

27. G.A. Dafalla, Plant Pathology Centre, Faculty of Agricultural Sciences,University
of Gezira, Wad Medani, Sudan.
<www.iita.org/info/virology/pdf_files/18-24.pdf>
28. Introduction to Microbiology: Virus Genomes, 2005.
< />

xii


PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Qui trình thu dịch chiết nƣớc mía.
(Quy trình đƣợc đƣa ra bởi Stevens Brumbley - 2006)

1. Cắt hết lá của thân bị nhiễm bệnh.
- Phụ thuộc vào chiều dài của mắt mía mà cắt đoạn thân ra có chứa 3 - 4 mắt mía
- Vì nồng độ vi khuẩn cao nhất ở dƣới thân cho nên lấy phần thân ở sát gốc mía.
2. Rửa thân bằng bàn chải và lau cho khô bằng giấy lau.
3. Rửa sạch bằng nƣớc.
4. Ngâm thân mía vào trong dung dịch thuốc tẩy 10 % trong 10 phút.
5. Rửa sach dƣới vòi nƣớc máy.
6. Khử trùng thân mía bằng cồn 70 % và đốt để cho hết cồn còn dƣ.
7. Cắt một đoạn thân mía ra và khử trùng đoạn thân này.
8. Dùng bơm đẩy khí từ một đầu và thu dịch chiết ở đầu kia bằng eppendorf
vô trùng.
9. Đổ dịch chiết trên vào môi trƣờng nuôi cấy MSC. Kiểm tra môi trƣờng
nuôi cấy hàng ngày.


xiii


Phụ lục 2: Thành phần môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli
(Quy trình đƣợc đƣa ra bởi Stevens Brumbley - 2006)

MÔI TRƢỜNG MSC ( CHO 1L MÔI TRƢỜNG)

 Thành phần hấp vô trùng:
Corn meal agar = 17 g
Bacto-agar = 4 g
Bacto-peptone = 8 g
MgSO
4
7H

2
O =

0.2 g
K
2
HPO
4
(0.1 M ) = 13 ml
KH
2
PO
4
(0.1 M ) = 87 ml
H
2
O = 800 ml
 Thành phần lọc
Glucose = 2 g
Cysteine = 0.5 g
Bovine serum albumin = 2 g
H
2
O = 100 ml
Bovine hemin chloride = 30 ml


Hòa tan các thành phần hấp trong nƣớc và chỉnh về pH = 7,5 với 5 N NaOH. Hấp vô
trùng. Hòa tan các thành phần lọc vào trong nƣớc và thêm vào môi trƣờng đƣợc hấp khi
chúng ở 55

O
C bằng một màng lọc vô trùng 0.22 m.

MÔI TRƢỜNG LỎNG S8
 Thành phần hấp vô trùng
Bacto - Soytone = 8 g
Hemin chloride = 15 ml
MgSO
4
.7H
2
O = 0.2 g
K
2
HPO
4
= 0.35 g
KH
2
PO
4
= 1.1 g
H
2
O = 885 ml
 Thành phần lọc:
Glucose = 2 g
Cysteine = 0.5 g
Bovine serum albumin = 2 g
H

2
O = 100 ml

1) Hòa tan tất cả các thành phần trong nƣớc và chỉnh về pH 6,6 bằng NaOH 5N.
2) Hấp vô trùng và trữ ở nhiệt độ phòng đến khi thêm các thành phần lọc vô trùng vào.



xiv


Phụ lục 3: Quy trình li trích DNA vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli
(Quy trình đƣợc đƣa ra bởi Stevens Brumbley - 2006)

Quy trình gồm 14 bƣớc nhƣ sau:
1) Nuôi Lxx trong 50 ml môi trƣờng lỏng S8.
2) Thu tế bào (ly tâm 6000 vòng trong 10 phút).
3) Huyền phù tế bào trong 2 ml lysis buffer (50 mM Tris, pH 8; 1 mM EDTA).
4) Ủ ở 37
O
C trong 30 phút.
5) Thêm 1/10 thể tích SDS vào để đạt nồng độ 1% SDS.
6) Thêm proteinase K đến nồng độ cuối cùng là 50 μg/ml.
7) Ủ ở 50 - 55
O
C trong 4 giờ.
8) Ly trích với phenol trung tính: chloroform : isoamyl alcohol cho đến khi bề
mặt đƣợc rửa sạch.
9) Thêm ethanol lạnh vào với thể tích tăng 2 lần nhằm làm kết tủa acid nucleic.
10) Thu DNA bằng pipet, rửa cẩn thận bằng cồn 70%.

11) Xử lí bằng Rnase.
12) Tiếp tục thêm phenol : chloroform để kết tủa ethanol.
13) Thu DNA bằng pipet và rửa bằng cồn 70%.
14) Huyền phù DNA trong TE.


xv


Phụ lục 4: Danh sách bệnh hại mía quan trọng và phổ biến.


Tên Việt Nam
Tên tiếng Anh
Tác nhân gây hại
I
Bệnh do nấm

1
Bệnh sọc nâu
Brown stripe
Cohliobalus stenospilus (Drechs)
2
Bênh mốc sƣơng
Downy mildew
Peronosclerospora sacchri (T. Miyake)
3
Bệnh đốm mắt én
Eye spot
Bipolaris sacchari shoemaker

4
Bênh đốm trắng
White speck
Bipolaris sacchari T.C.Lo
5
Bệnh cháy lá
Leaf scorch
Stagonospora sacchari Lo and Ling
6
Bệnh dứa
Pinapple disease
Ceratosystis paradoxa Moreau
7
Bệnh xoắn cổ lá
Pokkah boeng
Fusarium moniliform Sheldon
8
Bệnh thối đỏ
Red rod
Colectotrichum falcatum Went
9
Bệnh rỉ sắt đỏ
Rust
Puccinia melanopcephala H. &P. Syd
10
Bệnh rỉ sắt vàng
Rust orange
P. kuehnii Butl
11
Bệnh than

Smut
Ustilago senaminea Syd
12
Bệnh đốm vàng
Yellow spot
Mycovellosiella koepket
13
Bệnh đốm vòng
Ring spot
Leptosphaeria sacchari van Berda de Haan

Bệnh do vi khuẩn


14
Bệnh gôm
Gumming diease
Xanthomonas camestris pv. Vasculorum
15
Bệnh thân ngọn đâm
chồi
Leaf scald
Xanthomonas alibilineans (Ashby 1929)
16
Bệnh cằn mía gốc
Ratoon stunting
disease
Leifsonia xyli subsp xyli (Davis et al, 1980)
17
Sọc đỏ

Red stripe
Pseudomonas rubrilineans (Lee et al)
II
Bệnh do Phytoplasma

18
Bênh chồi cỏ
Grassy shoot

19
Bệnh trắng lá
White leaf

III
Bệnh do virus

20
Bênh sọc vàng
Chlorotich streak
Chƣa rõ
21
Bệnh Fiji
Fiji disease
Fiji disease virus
22
Bệnh khảm
Mosaic
Sugarcane mosaic virus
23
Bệnh đốm sọc

Streak
Sugarcane streak virus
24
Vàng gân lá

Sugarcane yellow leaf virus


xvi


Phụ lục 4: Một số hình ảnh về quá trình nghiên cứu bệnh khảm lá mía và cằn
mía gốc.


Hình PL1. Nhận dạng triệu chứng
và thu mẫu.
Hình PL2. Lá mía có triệu chứng khảm.










Hình PL3. Kết quả âm tính trong phân tích
ELISA.

Hình PL4. Bệnh đốm vòng thƣờng
xuất hiện trên các cây khảo sát
Hình PL5. Quá trình điều tra và thu mẫu.

Hình PL6. Gốc mía bị cằn



xvii









Hình PL9,10. Vết đổi màu bên trong thân.
Hình PL7. Đốt thân mía bị nhiễm Lxx nên
ngắn lại.
Hình PL8. Thân mía bị bệnh có đƣờng
kính nhỏ hơn thân bình thƣờng.