Luận văn : HOÀN THIỆN QUY TRÌNH BIẾN NẠP ĐOẠN DNA VÀO TẾ BÀO VI KHUẨN E. coli DH5α part 2 doc

12

- Đôi khi còn có thêm một chữ viết hoa để chỉ chủng vi khuẩn sử dụng.
Ví dụ:
Escherichia coli Ry13
Giống Loài Chủng
EcoRI: enzyme đầu tiên đƣợc tìm thấy ở E. coli
EcoRV: enzyme thứ 5 đƣợc tìm thấy ở E. coli
2.3.1.3 Các loại ezyme giới hạn
Enzym cắt giới hạn là các endonuclease có khả năng thủy giải DNA mạch đôi
một cách lặp lại ở những trình tự xác định.
Dựa vào khả năng này ngƣời ta chia ra làm 3 loại enzym cắt giới hạn:
Loại 1: Khi enzym nhận biết đƣợc trình tự, nó sẽ di chuyển trên phân tử DNA
đến cách đó khoảng 1000-5000 nucleotide và giải phóng độ khoảng vài chục
nucleotide.
Loại 2: Enzym nhận biết trình tự và cắt ngay tại vị trí đó.
Loại 3: Enzym nhận biết một trình tự và cắt DNA tại vị trí cách đó khoảng 20
nucleotide. Trong các thí nghiệm ngƣời ta chỉ sử dụng các enzym cắt giới hạn loại II.
2.3.1.4 Các RE loại II
Trình tự nhận biết: Mỗi enzym cắt giới hạn nhận biết một trình tự nocleotide
đặc trƣng. Các trình tự này thƣờng bao gồm từ 4-8 nucleotide (thƣờng là 4 hay 6). Các
RE khác nhau có cùng trình tự nhận biết gọi là isochizomers. Đối với một số RE, trình
tự nhận biết không có tính chuyên biệt tuyệt đối – một số nucleotide của trình tự có thể
đƣợc thay thế bởi nucleotide khác.
Ví dụ : NspI GGGC(A,T)C- vị trí cắt thứ tƣ có thể là C, A, hay T
Bgly GCCNNNNNGGC – N là bất kì nucleotide nào.
Đặc trƣng quan trọng nhất của trình tự nhận biết là chúng có cấu trúc
palyndromic, nghĩa là hai mạch của trình tự hoàn toàn giống nhau khi chúng đƣợc đọc
theo chiều 5’ 3’. Nhƣ vậy, vị trí cắt là giống nhau trên hai mạch.
13

Hình 2.4 Hiện tƣợng giới hạn ở vi khuẩn
(a) DNA của phage bị phân huỷ trong tế bào vi khuẩn
(b) DNA của vi khuẩn không đưôc nhận biết bởi enzym cắt
Các kiểu cắt của RE loại 2
Cắt tạo đầu bằng (blunt-ends): Một số RE cắt hai mạch DNA tại cùng một
điểm. Sau khi cắt, hai đầu bằng sẽ không có khả năng tự kết hợp lại. Để nối chúng lại
phải dùng enzym T4 ligase.

HaeIII

5’ GG CC 3’
3’ GG CC 3’

5’ GG + CC 3’
3’ CC GG 5’
Cắt đầu dính (cohesive ends): Ở một số RE, vị trí cắt lệch nhau trên hai mạch.
Trong trƣờng hợp này, các đầu dính bổ sung có thể bắt cặp trở lại, hai phân tử DNA có
nguồn gốc khác nhau khi đƣợc cắt bởi chung một RE sẽ có khả năng kết hợp thành
một thông qua các đầu dính.



EcoRI
không cắt
DNA đƣợc
methyl hoá

DNA
đƣợc

methyl
hoá

Enzym cắt
giới hạn
EcoRI

Enzym cắt
giới hạn
EcoRI

DNA
không
đƣợc
methyl
hoá

DNA không
đƣợc methyl
hoá

Phân cắt

Đầu dính

14

EcoRI

5’ G AATT C 3’

3’ C TTAA G 5’

5’ G AATTC 3’
3’ C TTAA G 5’
Một số qui tắc cần chú ý khi thiết lập một phản ứng thủy giải bởi RE
Mỗi RE hoạt động tối ƣu trong những điều kiện phản ứng xác định, nhất là về
mặt dung dịch đệm. Tốt nhất ta nên tuân thủ đúng các khuyên cáo của hãng sản xuất.
Các dung dịch đệm dùng cho phản ứng RE thƣờng cơ bản khác nhau ở nồng độ NaCl.
Do đó khi trong một phản ứng cần sử dụng nhiều RE:
Nếu chúng hoạt động tốt trong cùng một dung dịch đệm thì có thể đƣợc sử dụng
đồng thời.
Nếu yêu cầu về dung dịch đệm khác nhau thì DNA phải đƣợc cắt bởi RE hoạt
động trong dung dịch đệm có nồng độ NaCl thấp trƣớc, sau đó thêm NaCl để đạt nồng
độ cao hơn cần cho RE kia hoạt động và tiếp tục phản ứng thủy giải.
RE sẽ giữ đƣợc hoạt tính trong một dung dịch đệm chứa 50% glycerol nếu luôn
luôn đƣợc bảo quản ở -20
0
C. Khi tiến hành phản ứng thủy giải, chỉ lấy RE ra vào phút
chót sau khi đã đủ các thành phần khác và giữ trong đá trong thời gian càng ngắn càng
tốt trƣớc khi cắt trở lại vào -20
0
C.
Nên tiến hành phản ứng trong một thể tích càng nhỏ càng tốt để tạo thuận lợi
cho sự tiếp xúc enzyme-cơ chất. Tuy nhiên để đảm bảo RE không vƣợt quá 1/10 thể
tích phản ứng vì glycerol ức chế hoạt động enzyme.
Ứng dụng
Việc sử dụng các enzyme cắt giới hạn có ý nghĩa quyết định trong sự phát triển
của sinh học phân tử eukaryote. Chúng cho phép cắt nhỏ bộ gen khổng lồ của các sinh
vật eukaryote. Các enzyme cắt giới hạn chủ yếu đƣợc sử dụng trong phƣơng pháp tạo
dòng với mục đích thu nhận một trình tự xác định với số lƣợng lớn. Ngoài ra, chúng

còn đƣợc dùng vào việc lập bản đồ giới hạn (restriction map), vào việc phân tích so
15

sánh bộ gen ở các loài khác nhau thông qua kĩ thuật RFLP (Restriction Fragments
Length Polymorphism – tính đa hình kích thƣớc của các trình tự).
2.3.2 Các enzym thông dụng khác
2.3.2.1 DNA polymerase I (DNA pol I)
Bản sao của một chuỗi axit nucleic luôn luôn đƣợc tổng hợp, nhờ một enzyme
sao chép, theo cách bổ sung, đối song, và theo hƣớng 5’P 3’OH. Các DNA
polymerase tổng hợp chuỗi DNA từ khuôn DNA đƣợc gọi là DNA polymerase tùy
thuộc DNA. DNA polymerase không thể tự khởi đầu một chuỗi axit nucleic, để khởi
đầu một chuỗi axit nucleic cần cho vào môi trƣờng phản ứng một mồi axit nucleic.
DNA polymerase I (từ E. coli) là một chuỗi polypeptide duy nhất với ba hoạt
động enzyme: DNA polymerase (tổng hợp) 5’ 3’, exonuclease (thủy giải),
3’ 5’ và exonuclease 5’ 3’.
Enzym DNA fragment Klenow là enzym DNA polymerase I bị cắt bỏ tiểu đơn
vị nhỏ (nhờ một protease), phần chịu trách nhiệm exonuclease 5’ 3’. Do đó, enzym
Klenow có hai hoạt động: hoạt động tổng hợp DNA polymerase5’ 3’ và hoạt động
thủy giải exonuclease 3’ 5’.
2.3.2.2 Taq polymerase
Là một loại DNA polymerase chịu nhiệt đƣợc tách chiết từ một vi khuẩn suối
nƣớc nóng, Thermus aquaticus. Enzyme này không bị phá hủy ở nhiệt độ biến tính và
xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng.
2.3.2.3 Terminal transferase
Enzym này đƣợc ly trích từ tuyến ức của bê. Terminal transferase xúc tác phản
ứng gắn các deoxynucleotide vào đầu 3’OH tự do của phân tử DNA. Sự gắn này mang
tính ngẫu nhiên nên thành phần nucluetide của chuỗi polynucleotide mới hình thành
hoàn toàn phụ thuộc nồng độ của 4 loại nucleotide có trong phản ứng.
Enzym này đƣợc sử dụng khi cần thêm đuôi nucleotide để tạo đầu sole cho
phân tử DNA hay đánh dấu đầu 3’OH của các DNA trong phƣơng pháp xác định trình

tự nucleic axit theo Maxam và Gilbert.
2.3.2.4 Các DNase
Các DNase thƣờng đƣợc cô lập từ tuyến tụy bò, là các endonuclease có khả
năng cắt một phân tử DNA sợi đơn hay kép theo cách ngẫu nhiên để cho một hỗn hợp
16

các oligonucleotide. Hoạt động của DNase thay đổi tuỳ theo sự hiện diện của Mn
2+

hay Mg
2+
. Khi có Mn
2+
, DNase tác động trên hai sợi DNA gần nhƣ ở cùng một nơi để
cho những đầu thẳng (hay không quá 1-2 nucleotide). Khi có Mg
2+
, DNase tác động
trên mỗi sợi DNA riêng lẻ.
2.3.2.5 Các enzym khử phosphoril hóa
Đó là các phosphatase kiềm, có vai trò loại một nhóm phosphate ở đầu 5’ của
chuỗi DNA. Ngƣời ta thƣờng khử phosphoril hoá vector vừa đƣợc mở bởi enzym giới
hạn để tránh sự tự đóng lại của vector. Enzym loại này thƣờng đƣợc sử dụng là CIP
(Calf intestinal alkalyne phosphatase), cấu trúc là một dimer glycoprotein- xúc tác
phản ứng cắt bỏ gốc phosphate từ phân tử DNA mạch thẳng. Trong phản ứng của
enzym này cần có sự hiện diện của ion Zn
2+
nhƣ là yếu tố hoạt hoá. Sau khi phản ứng
xảy ra bất hoạt enzym bằng cách thêm vào một lƣợng nhỏ proteinase K và EDTA, sản
phẩm khử phosphoril đƣợc tinh sạch lại bằng cách sử dụng phenol:chloroform (Simsek
và cộng sự, 1973).

2.3.3 Các enzym nối DNA
Phản ứng nối giữa một đoạn phân tử DNA và vector đã mở vòng bằng enzym
cắt giới hạn liên quan đến sự hình thành liên kết cộng hoá trị giữa gốc phosphate và
gốc hydroxyl của hai phân tử DNA mạch đôi liền kề. Sự hình thành liên kết này có thể
đƣợc xúc tác bởi hai loại enzym là E. coli DNA ligase hay T4 DNA ligase.
2.3.3.1 E. coli DNA ligase
Enzym đƣợc ly trích từ E. coli xúc tác nối hai đoạn DNA có đầu so le
5’ ACGG + TAATCGCCA 3’
3’ TGCCATTA GCGGT 5’
E. coli DNA ligase

5’ ACGGTAATCGCCA 3’
3’ TGCCATTAGCGGT 3’
2.3.3.2 T4 DNA ligase
Có nguồn gốc từ phage T4 xâm nhiễm E. coli. Enzyme này có cùng chức năng
với ligase trích từ E. coli nhƣng đặc biệt còn có khả năng nối hai trình tự DNA đầu
bằng nên là ligase đƣợc chuộng nhất trong sinh học phân tử.
17

2.4 Các phƣơng pháp sử dụng trong biến nạp
2.4.1 Chuẩn bị tế bào khả nạp
Vi khuẩn là vật chủ lý tƣởng nhất cho việc đƣa DNA tái tổ hợp vào và biến
chúng thành những nhà máy sản xuất ra những sản phẩm mà ta mong muốn. Những ƣu
điểm cơ bản của vi khuẩn khi sử dụng chúng nhƣ những vật chủ để đƣa DNA tái tổ
hợp vào nhƣ sau:
- Vi khuẩn có khả năng biến nạp. Khả năng này đƣợc Federick Griffith đƣa ra
từ năm 1928. Tuy nhiên khả năng này không phải tất cả vi khuẩn đều có mức độ nhƣ
nhau.
- Vi khuẩn là cơ thể đơn bào, chúng có khả năng sinh sản, phát triển và trao đổi
chất rất mạnh. Do đó nếu đƣa DNA tái tổ hợp vào vi khuẩn và chúng có khả năng biểu

hiện đựoc tính trạng hợp lí mà ta mong muốn thì chỉ trong thời gian rất ngắn ta có thể
thu nhận một lƣợng vật chấ lớn khổng lồ.
- Vi khuẩn phát triển mạnh trong các nồi lên men. Do đó ta hoàn toàn có khả
năng tự động hóa, cơ giới hóa quá trình sản xuất.
Từ những ƣu điểm nổi bật trên mà các nhà khoa học đã nghiên cứu và đƣa ra
những phƣơng pháp chuẩn bị tế bào khả nạp hợp lý và rất dễ thực hiện.
2.4.1.1 Phƣơng pháp hóa biến nạp
Phƣơng pháp này có sự trợ giúp của CaCl
2
kèm với làm sốc nhiệt để làm tăng
khả năng biến nạp của vi khuẩn. Theo đó vi khuẩn chủ sẽ đƣợc trộn với DNA tái tổ
hợp. Ngƣời ta cho vi khuẩn vào dung dịch CaCl
2
lạnh và làm sốc nhiệt (nâng nhanh
đến 42
0
C trong 2 phút) sẽ làm tăng khả năng biến nạp lên nhiều lần.
Đối với tế bào động vật ta có thể thực hiện phƣơng pháp biến nạp bằng cách
hấp thụ DNA tái tổ hợp qua trung gian phosphate calcium.
Đối với tế bào thực vật, ta cũng có khả năng tạo biến nạp. Tuy nhiên, việc đầu
tiên là tạo tế bào trần (protoplast) thực vật bằng cách dùng enzyme cellulose phân hủy
thành tế bào thực vật. Sau đó trộn tế bào trần này với DNA tái tổ hợp với sự có mặt
của CaCl
2
và polyethylenglycol. Tiếp theo ta lại nuôi tế bào trần trong môi trƣờng
thích hợp để tái tạo lại thành tế bào nguyên thủy. Khi đó tế bào này mới phát triển
thành cây trong những điều kiện tƣơng ứng.

18

2.4.1.2 Phƣơng pháp điện biến nạp
Ta có thể sử dụng xung điện để tế bào thực vật hấp thụ DNA tái tổ hợp. Bằng
phƣơng pháp này ta thu đƣợc hiệu quả biến nạp rất cao.
2.4.2 Phƣơng pháp chọn lọc thể biến nạp và plasmid tái tổ hợp
Sau khi xâm nhập, plasmid tái bản và thể hiện gen kháng kháng sinh trong tế
bào chủ. Điều này giúp tế bào chủ có khả năng sinh trƣởng trên môi trƣờng có kháng
sinh. Do đó, khi trải E. coli biến nạp lên môi trƣờng chứa kháng sinh, chỉ tế bào nào
đã thu nhận plasmid và biểu hiện gen kháng kháng sinh mới có thể sinh trƣởng. Các tế
bào không tiếp nhận plasmid sẽ không sinh trƣởng đƣợc.
Tuy vậy, kết quả của phản ứng nối giữa đoạn DNA và vector đã đƣợc mở vòng
là một tổ hợp bao gồm nhiều kết quả nối, đó là vector-vector, vector-DNA chèn. Do
vậy, có những thể biến nạp có khả năng sinh trƣởng trên môi trƣờng chứa kháng sinh
nhƣng không mang gen mục tiêu. Việc sàng lọc các thể biến nạp mang gen mục tiêu
đƣợc tiến hành theo nhiều phƣơng pháp. Phổ biến là các phƣơng pháp sau:
- Xác định thể biến nạp có mang plasmid tái tổ hợp dựa trên việc quan sát màu
xanh hay trắng của khuẩn lạc bằng α-complementation.
- Xác định thể biến nạp có mang plasmid tái tổ hợp bằng phƣơng pháp lai
(lai khuẩn lạc).
- Xác định gen đích trên plasmid trong thể biến nạp bằng PCR (PCR khuẩn lạc).
Thông thƣờng, để phân tích một dòng ngƣời ta dung hai phƣơng pháp là khảo sát
plasmid tái tổ hợp bằng cách tạo bản đồ cắt giới hạn và giải trình tự toàn bộ đoạn gen đích.
Nhiều plasmid vector (ví dụ họ pUC, pBluescript, pGEM và các plasmid có
nguồn gốc từ các họ plasmid này) mang một đoạn ngắn của DNA E. coli chứa những
trình tự điều hòa và mã hóa cho α-protein của β-galactosidase (đầu amin). Việc chèn
vào đoạn này trình tự MCS chứa các vị trí cắt giới hạn duy nhất (vẫn duy trì khung
đọc) sẽ tạo thêm vài amino axit trong α-protein mà không ảnh hƣởng tới chức năng
của lacZ. Các vector loại này sẽ đƣợc sử dụng với các chủng chủ thể hiện phần đầu
carboxyl của β-galactosidase. Hiện tƣợng α-complementation xảy ra khi hai protein
bất hoạt của β-galactosidase E. coli (α, ω-protein ) kết hợp với nhau để tạo thành một
enzym có chức năng. Các khuẩn lạc có α-complementation sẽ dễ dàng đƣợc phát hiện

vì việc xuất hiện khuẩn lạc màu xanh trên môi trƣờng có chứa cơ chất tạo màu X-gal
19

(5-Bromo- 4- chloro-3-Indolyl –β-D-galactopyranoside). Hợp chất không màu X-gal
bị phân cắt bởi β-galactosidase để cho galactose và một dẫn xuất của indoxyl. Dẫn
xuất này, đến lƣợt nó bị oxy hóa trong không khí để tạo ra dẫn xuất dibromo-dichloro
có màu xanh. Để có sự biểu hiện của β-galactosidase cần có chất kích hoạt là IPTG
(đồng phân của galactose không bị nhận biết bởi β-galactosidase), đóng vai trò nhƣ là
chất kích hoạt của gen lacZ.
Khi chèn đoạn DNA vào trình tự MCS của các vector (ví dụ pBluescript) sẽ làm
ngăn cản việc tạo thành α-protein đầu amin. Do đó, hiện tƣợng α-complementation
không thể xảy ra. Vì vậy, khuẩn lạc do thể biến nạp hình thành có màu trắng.
2.4.3 Chiết tách DNA plasmid
Với mong muốn thu nhận một số lƣợng lớn các bản sao plasmid, ngƣời ta sử
dụng bộ máy di truyền của các tế bào chủ. Thông qua đó, plasmid đƣợc sao chép với
số lƣợng lớn và tốc độ cực kì nhanh chóng theo tốc độ tăng trƣởng của tế bào chủ.
Trƣớc hết, biến nạp plasmid vào tế bào chủ, sau đó nuôi cấy tế bào chủ trên môi
trƣờng chọn lọc thích hợp thu nhận sinh khối tế bào. Quá trình tách chiết plasmid từ tế
bào chủ là công đoạn cuối cùng nhằm thu nhận plasmid dƣới dạng tinh. Các quy trình
tách chiết đều có các bƣớc chính là phá vỡ màng tế bào, biến tính DNA, tủa protein,
cuối cùng là tủa DNA. Tuỳ theo từng phƣơng pháp cụ thể ngƣời ta sẽ sử dụng các tác
nhân khác nhau trong từng công đoạn của quá trình tách chiết.
Có nhiều phƣơng pháp tách chiết plasmid từ tế bào chủ, chẳng hạn nhƣ:
- Phƣơng pháp nhiệt độ cao
- Phƣơng pháp Lythium
- Phƣơng pháp SDS-kiềm
2. 5 Điện di (Electrophoresis)
Kỹ thuật điện di trên gel rất quan trọng đối với ngƣời làm kỹ thuật di truyền, vì
đó là cách chủ yếu làm cho các đoạn nucleic acid hiển thị trực tiếp. Phƣơng pháp này
dựa trên một đặc tính của nucleic acid là ở pH trung tính chúng mang điện tích âm nhờ

các nhóm phosphate nằm trên khung phosphodiester của các sợi nucleotide. Điều đó
có nghĩa là các phân tử sẽ chạy về cực dƣơng khi đặt chúng vào điện trƣờng. Kỹ thuật
này đƣợc tiến hành trên một dung dịch đệm gel có tác dụng phân tách các phân tử
nucleic acid theo kích thƣớc.
20

Loại gel dùng trong điện di có tác dụng rất quan trọng đối với mức độ phân tách
các phân tử, nó phụ thuộc vào cấu trúc và kích cỡ của các lỗ có trong gel. Có hai loại
gel đƣợc sử dụng phổ biến là agarose và polyacryamid.
Gel agarose là loại gel thông dụng nhất, một phần do thao tác đơn giản, thƣờng
dùng để phân tách những đoạn có kích thƣớc trong khoảng 0,5 – 20 kb. Gel đƣợc đổ
trên một giá thể nằm ngang và điện di đƣợc thực hiện theo phƣơng nằm ngang. Các
nucleic acid trong gel agarose sẽ hiện hình dƣới tia tử ngoại (UV) nhờ một hóa chất có
tên là ethidium bromide (EtBr). Chất này có khả năng xen vào giữa các base của acid
nucleic và dƣới tác dụng của tia tử ngoại sẽ phát huỳnh quang.
Gel polyacrylamide dùng để tách các đoạn có kích thƣớc nhỏ, tức là dƣới 1000
cặp base. Thao tác với gel polyacrylamide phức tạp hơn với gel agarose. Do đó, gel
này chỉ đƣợc sử dụng cho những mục đích đặc hiệu. Các ứng dụng chủ yếu của loại
gel này là:
- Tinh sạch các oligonucleotide tổng hợp
- Xác định trình tự DNA
- Tách các đoạn DNA nhỏ có chiều dài dƣới 500 cặp base.
Gel đổ giữa hai tấm thuỷ tinh và phƣơng của điện di là phƣơng thẳng đứng.
Thực hiện nạp mẫu điện di
Điện di đƣợc thực hiện bằng cách đƣa các mẫu nucleic acid đã đƣợc trộn đều
với loading buffer bơm vào các giếng của miếng gel trong dung dịch đệm TAE 0,5X
hoặc TBE 0,5X và đặt một điện áp vào đó. Trạng thái đó đƣợc duy trì cho đến khi
vạch cuối của loading buffer chạy tới đầu cuối của gel. Sau đó, bản gel đƣợc nhuộm
trong dung dịch ethidium bromide và xem dƣới UV.
2.6 Các nghiên cứu về biến nạp ở trong nƣớc và ngoài nƣớc

2.6.1 Ngoài nƣớc
Cohen và cộng sự (1973), đã thành công khi biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế
bào vi khuẩn E. coli bằng phƣơng pháp Calcium chloride.
Sambrook và cộng sự (1989), đƣa ra phƣơng pháp chuẩn bị tế bào E. coli khả
nạp, biến nạp plasmid vào tế bào theo phƣơng pháp hóa chất và sốc nhiệt, sau đó ông
đƣa ra công thức tính hệ số biến nạp
N = A x10
n
x OV/PV
21

N: hệ số biến nạp, tính bằng CFU/µg plasmid DNA
A: số khuẩn lạc đếm đƣợc trên môi trƣờng chọn lọc
n: hệ số pha loãng
OV: thể tích ban đầu khi phục hồi (µl)
OP: thể tích dịch vi khuẩn đƣợc trải trên đĩa (µl)
Inoue và cộng sự(1990), đƣa ra công thức dung dịch TB sử dụng trong quá trình
chuẩn bị tế bào khả nạp nhƣ sau:
10mM Pipes, 55mM MnCl
2
, 15mM CaCl
2
, 250mM KCl
Zhiming Tu và cộng sự (2004), nghiên cứu cải thiện phƣơng pháp chuẩn bị tế
bào khả nạp và nâng cao hệ số biến nạp plasmid sử dụng những chủng E. coli khác
nhau. Kết quả nghiên cứu của ông cho thấy sử dụng tế bào ở đầu phage log ảnh hƣởng
rất lớn đến sự thành công của việc chuẩn bị tế bào khả nạp. Giá trị OD
600
thích hợp của
dịch nuôi cấy khi chuẩn bị tế bào khả nạp với các chủng vi khuẩn nhƣ sau: XL-blue là

từ 0.15-0.45, TG1 là từ 0.2-0.5, DH5α là từ 0.145-0.45. Nồng độ của CaCl
2
sử dụng
trong dung dịch TB tối ƣu là 75mM. Cũng trong nghiên cứu này Zhiming Tu cho thấy
thời gian lƣu trữ tế bào khả nạp ở -20
o
C là 7 ngày, ở -70
o
C là 15 ngày.
2.6.2 Trong nƣớc
Phạm Duy và Huỳnh Văn Thái, trƣờng Đại Học Nông Lâm TPHCM, đã thực
hiện thành công đề tài : Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn
E. coli DH5α” bƣớc đầu xây dựng đƣợc quy trình chuẩn bị tế bào khả nạp, quy trình
tách chiết plasmid, tiến hành phủ đầu bằng cho đoạn DNA từ sản phẩm PCR, thiết lập
phản ứng nối cho đoạn DNA trên với plasmid, thực hiện phản ứng PCR trên plasmid
đã chèn.








22

PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện khoá luận tốt nghiệp
Thời gian : Khoá luận đƣợc tiến hành từ ngày 14 tháng 02 năm 2006 đến ngày

14 tháng 08 năm 2006.
Địa điểm : Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hoá Sinh, Bộ Môn Bảo Vệ Thực
Vật-Trƣờng Đại học Nông lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
3.2 Vật liệu nghiên cứu
3.2.1 Vi khuẩn E. coli DH5α
Chủng vi khuẩn đã đột biến, có những thiếu hụt dùng để biến nạp và nhân
nhanh số lƣợng bản sao plasmid hoặc cosmid.
Kiểu gen : supE44 ∆lacU169(Ф80lacZ∆M15)
hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1relA1.
Đột biến Ф80lacZ∆M15 cho phép xảy ra hiện tƣợng α-complementation với
tiểu phần mang đầu amino của β-galactosidase đƣợc mã hoá bởi plasmid họ pUC
(Hanahan 1983 ; Bwnthesda Research Laboratories 1986)
3.2.2 pBluescript II SK(+/-)
pBluescript phagemid (plasmid với vùng khởi đầu sao chép của phage) là vector
nhân tạo, đƣợc thiết kế để sử dụng trong cloning và đọc trình tự. pBluescript chứa MCS
với trình tự nhận biết của 21 enzym cắt giới hạn. Bên ngoài vùng MCS là T7, T3 RNA
polymerase promoter, có thể sử dụng để tổng hợp RNA invitro. Trình tự của T7, T3 còn
có thể sử dụng để thiết kế primer sử dụng cho phƣơng pháp đọc trình tự.
pBluescript chứa trình tự mã hoá cho 131 amino axit của β-galactosidase. Việc
phân biệt pBluescript II SK (+/-) hay pBluescript II KS (+/-) phụ thuộc vào cách sắp
xếp thứ tự các trình tự nhận biết của các enzym cắt giới hạn trong vùng MCS so với
trình tự của T7, T3 RNA polymerase promoter. Ở pBluescript II SK (+/-), trình tự của
enzym Kpn I gần với T7 promoter, trình tự của enzym Sac I gần với T3 promoter và
ngƣợc lại.
23


Sơ đồ 3.1 Vùng trình tự MCS của plasmid pBluescript II SK (+/-)
3.2.3 Đoạn DNA
Hai đoạn DNA đƣợc chọn nghiên cứu trong khoá luận này là

Đoạn DNA (900bp) của nấm Phytophthora trên cây địa lan
Đoạn DNA (223bp) trong vùng Tef của nấm Trichorderma
3.3 Dụng cụ và hóa chất
3.3.1 Dụng cụ thí nghiệm
Đĩa petri lớn, nhỏ
Ống nghiệm lớn, nhỏ
Eppendorf: 1.5ml, 200μl
Pipet : 0.5-10 µl; 10 - 100 µl;
100 - 1000 µl
Đầu tip : xanh, vàng, trắng
Lọ thủy tinh đƣng hóa chất
Đầu lọc hóa chất : 0.22μm, 0.45μm
Bình tam giác : 100ml, 200ml, 500ml
Que trang thủy tinh
3.3.2 Các thiết bị máy móc
Tủ cấy vô trùng (micro flow)
Bồn ổn nhiệt (water bath)
Máy ly tâm (Mikio 22)
Tủ định ôn
Máy lắc vi khuẩn
Tủ 4
0
C, - 20
0
C, - 80
0
C
Tủ sấy dụng cụ
Thiết bị điện di (Bio - Rad)
Máy chụp gel (Bio - Rad)

Lò vi sóng (Microway)
Nồi hấp (Autoclave - Tomy)
3.3.3 Các loại môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn
Môi trƣờng LB lỏng (bacto tryptone, bacto yeast extract, natri chlorua )
Môi trƣờng LB lỏng có bổ sung kháng sinh (bacto tryptone, bacto yeast extract,
natri chlorua, ampicillin)
24

Môi trƣờng LB agar (bacto tryptone, bacto yeast extract, natri chlorua, agar )
Môi trƣờng LB agar, kháng sinh ampicillin, X-gal, IPTG (bacto tryptone, bacto
yeast extract, natri chlorua, agar. Ampicillin, X-gal, IPTG)
3.3.4 Các loại hóa chất dùng trong thí nghiệm
Hóa chất để chuẩn bị tế bào khả nạp : CaCl
2
100mM, glycerol 98%.
Hóa chất biến nạp : Ampicillin 100μg/ml, X-gal 20mg/ml, IPTG 300mg/ml.
Hóa chất ly trích plasmid
Dung dịch I (50mM glucose, 25mM Tris-HCl, 10mM EDTA)
Dung dịch II (0,2N NaOH, 1% SDS, nƣớc cất)
Dung dịch III (5M Potassium acetate, glacial acetic acid, nƣớc cất)
Phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25 : 24 : 1)
Chloroform / isoamyl alcohol (24 :1)
Isopropanol, Ethanol 70 %, TE 1X (pH = 8)
Hóa chất điện di và nhuộm: Loading dye, TAE 0.5X, Ethdium bromide
3.3.5 Các loại enzym dùng trong thí nghiệm

Tên enzyme
Trình tự nhận
biết
Buffer

Mã hàng
Nhà sản
xuất
BamHI
G /GATCC
B (10X)
Cat. No. 220 612
Roche
EcoRV
GAT/ATG
B (10X)
Cat. No. 667 145
Roche
HindIII
A/AGCTT
B (10X)
Cat. No. 656 313
Roche
DNA T4
ligase

NEbuffer 10X
Product No.
70005Y
usb
DNA
fragment
Klenow

T4 reaction

buffer
Code number
M0210S
BioLabs





25

3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu
3.4.1 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn

Vi khuẩn E. coli sau khi xử lí CaCl
2
sẽ làm cho màng tế bào trở nên khả nạp
giúp cho DNA xâm nhập tế bào E.coli dễ dàng hơn. Giai đoạn sốc nhiệt kế tiếp (42
0
C
trong 45 giây) để kích thích sự chuyển của phân tử plasmid vào trong tế bào. Môi
trƣờng dƣỡng chất đƣợc thêm vào sau đó cho phép tế bào hồi phục và plasmid tiến
hành sao mã, phiên mã và dịch mã tạo nên các protein tƣơng ứng. Một trong các tính
trạng do các gen này qui định đƣợc chọn làm dấu hiệu chọn lọc để phân biệt nhữnng tế
bào có tiếp nhận DNA plasmid trong số những tế bào không tiếp nhận DNA plasmid.




Vi khuẩn Ecoli

Xử lí CaCl
2


Sốc nhiệt ở 42
0
C
trong 45 giây
Cấy lên đĩa
Sơ đồ 3.2 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn E. coli

26

3.4.2 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn E. coli DH5α và kiểm tra

Sơ đồ 3.3 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn E. coli DH5α và kiểm tra
Vi khuẩn E. coli DH5α

Khả nạp

+ CaCl
2


Plasmid Bluescript II SK (+/-)

Vi khuẩn mang plasmid Bluescript

Sốc nhiệt

Chiết tách plasmid

Tinh sạch

Đoạn DNA

Cắt plasmid bằng HindIII

Blunt - end

Tinh sạch

Phản ứng nối

Biến nạp vào khả nạp

Chọn lọc khuẩn lạc màu xanh

Chọn lọc khuẩn lạc màu trắng

Chiết tách plasmid

Cắt plasmid bằng BamHI, HindIII

Phản ứng PCR với primer T3, T7

Blunt - end
27

3.4.3 Tăng sinh vi khuẩn E. coli DH5α trên môi trƣờng LB
Từ dòng vi khuẩn E. coli DH5α gốc hút 20µl dịch vi khuẩn sang ống nghiệm có
chứa môi trƣờng LB lỏng.
Đem nuôi cấy lắc ở 37
0
C, 150 vòng/phút trong vòng 36-48h.
Hút 1ml dịch vi khuẩn sau khi đã nuôi cấy vào ống eppendorf 1.5ml, thêm
150µl glycerol 98% vào và cất ống eppendorf vào tủ âm 70 để giữ giống.
Dịch còn lại tiếp tục cấy sang các ống nghiệm để chuẩn bị tế bào khả nạp.
3.4.4 Chuẩn bị tế bào khả nạp
Bƣớc 1: Hút 20µl dịch vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 3ml môi trƣờng LB lỏng.
Bƣớc 2: Nuôi cấy lắc trong vòng 3-4 giờ.
Bƣớc 3: Chuyển ống nghiệm chứa vi khuẩn vào thùng nƣớc đá giữ lạnh trong
10 phút.
Bƣớc 4: Hút 1.5ml dịch nuôi cấy cho vào eppendorf 1.5ml, ly tâm 4000

vòng/phút trong 10 phút ở 4
0
C.
Bƣớc 5: Đổ bỏ phần dịch bên trên, thu phần sinh khối kết tủa bên dƣới. Lập lại
bƣớc này đến khi hết dịch nuôi cấy.
Bƣớc 6: Cho 1ml CaCl
2
100mM lạnh vào eppendorf chứa phần sinh khối vừa
thu đƣợc. Vortex nhẹ để hòa tan phần kết tủa.
Bƣớc 7: Ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 4
0
C.
Bƣớc 8: Đổ bỏ phần dịch bên trên, lật ngƣợc eppendorf 1 phút để làm khô kết tủa.
Bƣớc 9: Cho 150µl CaCl
2
100mM lạnh vào hòa tan phần kết tủa trên.
Thêm 20µ glycerol vào và trữ ở -70
0
C.
Khả nạp đƣợc chuẩn bị theo phƣơng pháp CaCl
2
kết hợp với sốc nhiệt sau đó
đƣợc bảo quản ở -70
0
C. Việc thêm glycerol có tác dụng giảm sốc khi rã đông giúp
việc bảo quản khả nạp đƣợc lâu hơn. Cần chú ý là phải chia nhỏ thể tích khả nạp đủ
cho mỗi lần sử dụng.
3.4.5 Biến nạp plasmid pBluescript vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α bằng
phƣơng pháp sốc nhiệt (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi)
Chúng tôi tiến hành biến nạp theo 3 qui trình sau. Lƣợng DNA không lớn hơn

50ng trong một thể tích là 10μl hoặc ít hơn.

28

Quy trình 1
- Hút 10µl dịch huyền phù tế bào competent cell đã đƣơc chuẩn bị cho vào
eppendorf 1.5ml, thêm 1.5µl DNA plasmid vào, đảo nhẹ, giữ lạnh trong đá
trong 20 phút
- Chuyển nhanh eppendorf trên vào bồn nhiệt 42
0
C, giữ trong 90 giây.
- Chuyển nhanh eppendorf trên vào bình nƣớc đá, giữ trong 2 phút.
- Thêm 500µl môi trƣờng LB lỏng vào eppendorf và ủ ở 37
0
C trong 1 giờ.
- Hút 100µl dịch vi khuẩn đã biến nạp cho lên đĩa môi trƣờng LB có chứa
kháng sinh ampicilin nồng độ 100μg/ml, X-gal, IPTG, dùng que trang trang đều
trên bề mặt môi trƣờng.
- Để đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô bề mặt.
- Lật ngƣợc đĩa, ủ qua đêm ở 37
0
C.
- Lặp lại quy trình trên nhƣng không cho DNA plasmid vào tế bào khả nạp để
làm đối chứng.
Quy trình 2
- Hút 3µl dịch huyền phù tế bào khả nạp đã đƣợc chuẩn bị cho vào eppendorf
1.5ml, thêm 0.5µl DNA plasmid vào, đảo nhẹ, giữ lạnh trong đá trong 20 phút.
- Chuyển nhanh eppendorf trên vào bồn nhiệt 42
0
C, giữ trong 90 giây.

- Chuyển nhanh eppendorf trên vào bình nƣớc đá, giữ trong 2 phút.
- Thêm 200µl môi trƣờng LB lỏng vào eppendorf và ủ ở 37
0
C trong 1 giờ.
- Hút 100µl (đã pha loãng ½) dịch vi khuẩn đã biến nạp cho lên đĩa môi trƣờng
LB có chứa kháng sinh ampicilin nồng độ 100μg/ml, X-gal, IPTG, dùng que
trang trang đều trên bề mặt môi trƣờng.
-Để đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô bề mặt.
- Lật ngƣợc đĩa, ủ qua đêm ở 37
0
C.
- Lặp lại quy trình trên nhƣng không cho DNA plasmid vào tế bào khả nạp để
làm đối chứng.
Quy trình 3
Lập lại quy trình 2 nhƣng không pha loãng khi hút 100µl dịch vi khuẩn đã biến
nạp cho lên đĩa môi trƣờng LB có chứa kháng sinh ampicilin nồng độ 100μg/ml, X-
gal, IPTG.
29

3.4.6 Chiết tách plasmid và sử dụng enzym cắt để kiểm tra
3.4.6.1 Chiết tách plasmid
Có nhiều phƣơng pháp chiết tách DNA plasmid nhƣ: Phƣơng pháp sử dụng
nhiệt độ cao, phƣơng pháp SDS – kiềm. Nhƣng chúng tôi chọn phƣơng pháp SDS –
kiềm để chiết tách plasmid sử dụng cho khóa luận này.
Nguyên tắc của phƣơng pháp này là màng tế bào vi khuẩn bị phá vỡ bởi các tác
nhân phá màng. Sau khi màng tế bào bị vỡ , dƣới tác dụng của SDS protein của tế bào
sẽ bị biến tính. Nhờ vậy mà DNA sẽ tránh đƣợc sự phân hủy của DNAse. Mặt khác, sự
bổ sung dung dịch II với nồng độ kiềm cao ở giai đoạn đầu của quá trình tách chiết,
làm cho DNA của genome và DNA của plasmid bị biến tính. Sau đó trung hòa nhanh
bằng dung dịch III, cấu trúc của DNA sẽ đƣợc phục hồi nhanh chóng. DNA của bộ gen

có kích thƣớc lớn nên khó phục hồi cấu trúc hơn so với DNA của plasmid. Vì vậy
DNA của plasmid sẽ nằm ở phần dịch nổi sau khi ly tâm, protein của tế bào và DNA
của bộ gen sẽ bị tủa xuống. Nhƣ vậy ta có thể tách plasmid ra khỏi tế bào chủ mà
không bị lẫn DNA của bộ gen. DNA của plasmid đƣợc tủa dƣới tác dụng của
isopropanol nên ta thu hồi lại dễ dàng.
Phƣơng pháp chiết tách DNA plasmid sử dụng SDS – kiềm (theo quy trình
của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi)
Bắt những khuẩn lạc màu xanh từ đĩa petri cấy sang môi trƣờng LB lỏng có
chứa kháng sinh. Chọn những ống có vi khuẩn phát triển tiến hành chiết tách plasmid
theo quy trình sau:
Bƣớc 1: Hút dịch vi khuẩn từ mỗi ống cho vào mỗi eppendorf 1.5 ml, ly tâm để
thu sinh khối ở 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 20
0
C
Bƣớc 2: Hút bỏ dịch bên trên, hút dịch vi khuẩn từ các ống nghiệm tƣơng ứng
cho vào, ly tâm 10000 vòng/phút, trong 5 phút ở 20
0
C, lặp lại cho đến
khi hết dịch nuôi cấy trong ống nghiệm.
Bƣớc3: Cho 150μl dung dịch I vào mỗi eppendorf chứa sinh khối, vortex đến
khi sinh khối vi khuẩn tan ra hết.
Bƣớc 4: Thêm 200μl dung dịch II, đảo nhanh eppendorf 5-6 lần, sau đó thêm
tiếp 150μl dung dịch III, đảo nhanh eppendorf 5-6 lần.
30

Bƣớc 5: Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 20
0
C. Thu hết dịch nổi cho
vào eppendorf mới tƣơng ứng.
Bƣớc 6: Cho vào mỗi eppendorf chứa dịch nổi vừa mới thu đƣợc 1µl RNAse, ủ

ở 37
0
C trong1 giờ.
Bƣớc 7: Cho vào mỗi eppendorf 300µl phenol/chloroform/isoamylalcohol
(25:24:1) vortex đều, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 20
0
C .
Thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tƣơng ứng.
Bƣớc 8: Cho vào mỗi eppendorf trên 300µl chloroform/isoamylalcohol, lắc đều,
ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 20
0
C. Thu dịch nổi cho vào các
eppendorf mới tƣơng ứng.
Bƣớc 9: Thêm vào mỗi eppendorf trên 300µl isopropanol, và ủ ở -20
0
C trong 1
giờ, ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút ở 20
0
C. Hút bỏ dịch nổi,
thu kết tủa.
Bƣớc 10: Rửa tủa trên bằng cách cho 500µl ethanol 70% lạnh vào mỗi
eppendorf, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 4
0
C. Hút bỏ dịch
nổi, thu lấy kết tủa và làm khô bằng cách úp ngƣợc trên giấy thấm.
Bƣớc 11: Cho TE vào mỗi eppendorf để hòa tan kết tủa. Tùy lƣợng mẫu mà
thêm vào.
Bƣớc 12: Hút 4µl chạy điện di trên agarose nồng độ 1% trong 30 phút để xem
kết quả chiết tách.
Sau khi điện di kiểm tra sản phẩm chiết tách trên gel agarose, thực hiện phản

ứng cắt DNA plasmid tách chiết và DNA plasmid đối chứng.
Thực hiện phản ứng cắt DNA plasmid và DNA plasmid đối chứng bằng enzym
EcoRV, sau đó kiểm chứng bằng cách điện di trên gel agarose sẽ cho biết DNA
plasmid chiết tách đƣợc có phải là plasmid mà mình mong muốn hay không.
Qui trình li trích plasmid sử dụng Aurum
TM
Plasmid Mini Kit (Bio-Rad)
Thành phần của Aurum
TM
Plasmid Mini Kit
Resuspension solution (dung dịch hòa tan)
Lysis solution (dung dịch phân giải)
Neutralization solution (dung dịch trung hòa)
Wash solution (dung dịch rửa)
31

Elution solution (dung dịch tách rửa)
Plasmid mini columns 100
2ml capless wash tubes 100
Vi khuẩn sau khi tăng sinh trong môi trƣờng LB lỏng (theo tỉ lệ 1:20) trong
vòng 16 giờ hoặc xác định mật độ tế bào bằng cách đo OD ở bƣớc sóng 600 nm đến
khi OD
600
= 6.
Bƣớc 1: Chuyển dịch vi khuẩn đã nuôi cấy vào ống eppendorf (1.5-2.0ml). Li
tâm trong 1 phút 13000 vòng/phút ở 4
0
C. Loại bỏ dịch nổi bằng việc
gạn hay hút.
Bƣớc 2: Thêm 250µl dung dịch resuspension và vortex hoặc hút lên hút xuống

đến khi cặn tế bào tan hoàn toàn.
Bƣớc 3: Thêm 250µl dung dịch lysis và trộn bằng cách đảo ngƣợc eppendorf
nhanh, mạnh 6-8 lần. Không vortex hoặc lắc mạnh. Dung dịch sẽ trở
nên nhớt và mỏng.
Bƣớc 4: Thêm tiếp 350µl dung dịch neutralization và trộn bằng cách đảo ngƣợc
eppendorf 6-8 lần. Không vortex hoặc lắc mạnh. Kết tủa đã đƣợc hình
thành.
Bƣớc 5: Li tâm trong vòng 5 phút 13000 vòng/phút ở 4
0
C hỗn hợp trên. Cặn
đặc trắng sẽ hình thành dọc theo cạnh hoặc dƣới đáy của ống
eppendorf. Dịch nổi chứa DNA plasmid.
Bƣớc 6: Trong khi li tâm, chèn 1 cột plasmid mini column vào ống capless
wash 2ml.
Bƣớc 7: Bằng việc hút hay gạn, chuyển dịch nổi từ bƣớc 5 vào cột plasmid mini
column. Li tâm 1 phút 13000 vòng/phút ở 4
0
C.
Bƣớc 8: Dung dịch wash solution đƣợc cung cấp ở nồng độ 5X. Thêm vào 4 thể
tích (100 ml) ethanol 95-100% trƣớc khi sử dụng.
Bƣớc 9: Lấy cột plasmid mini column ra khỏi ồng wash tube. Bỏ phần nƣớc đã
lọc từ ống tube, và chuyển plasmid mini column vào ống wash tube
khác. Thêm vào 750µl dung dịch wash solution và li tâm 1 phút 13000
vòng/phút ở 4
0
C.
32

Bƣớc 10: Bỏ dung dịch wash solution từ ống tube, và chuyển cột plasmid mini
column vào ống wash tube khác. Li tâm thêm 1 phút nữa để loại bỏ

dung dịch wash solution còn lại.
Bƣớc 11: Chuyển cột plasmid mini column vào ống eppendorf. Thêm 50µl
dung dịch elution vào màng hoặc đế của cột và cho phép 1 phút để
dung dịch bão hòa màng. Li tâm 1 phút 13000 vòng/phút ở 4
0
C để
tách rửa plasmid.
Bƣớc 12: Bỏ cột mini column và trữ DNA tinh ở 4
0
C.
3.4.6.2 Phản ứng cắt Plasmid (quy trình trích dẫn bởi Samuel S.M.Sun, 1994)
Định nghĩa đơn vị enzym cắt: Một đơn vị enzym cắt giới hạn là lƣợng enzym
xúc tác phản ứng cắt hết một lƣợng DNA là 1µg trong buffer thích hợp trong thời gian
là 1 giờ ở nhiệt độ thích hợp. Thực hiện phản ứng cắt với các thành phần nhƣ sau
Buffer 10X 2.5µl
DNA plasmid 1µg
Enzym EcoRV 1 unit
Thêm nƣớc cho tới 25µl
Ủ phản ứng ở 37
o
C trong 1 giờ, biến tính enzym ở 65
o
C trong 15 phút
Điện di 8µl sản phẩm cắt trên gel agrose 1%, với hiệu điện thế 100V, trong 30
phút để kiểm tra.
Tƣơng tự thực hiện phản ứng cắt với enzym RsaI và HindIII để kiểm tra sản
phẩm sau khi li trích.
3.4.6.3 Quy trình điện di trên gel agarose
Chuẩn bị khuôn đổ gel, gắn lƣợc vào khuôn, cân 0.1g agarose cho vào chai
chứa 12.5 ml dung dịch TAE 0.5X, nấu agarose trong lò vi sóng trong 2 phút, 650W.

Để nguội đến 40-50
0
C, đổ gel vào khuôn, khi gel nguội, gỡ lƣợc ra khỏi miếng
gel, lấy gel ra khỏi khuôn một cách nhẹ nhàng và đặt vào bồn điện di đã có sẵn dung
dịch TAE 0.5X.
Chuẩn bị một miếng parafilm (kích thƣớc tuỳ vào số mẫu chạy điện di), hút 2μl
dung dịch nạp mẫu (loading dye) cho mỗi mẫu cần điện di, hút mẫu cần điện di (thể
tích tuỳ thuộc vào nồng độ mẫu) trộn đều với dung dịch nạp mẫu, hút toàn bộ dung
dịch vừa trộn nạp vào giếng.
33

Đậy nắp bồn điện di, cắm điện cực, điện di với hiệu điện thế 100V, thời gian
30 phút.
Sau khi điện di xong, cẩn thận lấy gel ra và nhuộm trong Ethium bromide trong
10 phút, rửa kỹ gel và đọc kết quả điện di bằng phần mềm Quantity One (khi nhuộm
với ethium bromide phải tuyệt đối cẩn thận).
3.4.7 Tinh sạch plasmid và đoạn DNA từ sản phẩm PCR
3.4.7.1 Phƣơng pháp tinh sạch DNA
Các bƣớc tinh sạch DNA bằng RNAse nhƣ sau:
- Cho hỗn hợp DNA pha loãng với nƣớc vào eppendorf (theo tỷ lệ 1:3)
- Thêm vào 2 l RNAse vào hỗn hợp trên
- Ủ ở 37
0
C khoảng 30 giây
- Thêm vào 2 l Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1)
- Ly tâm lấy phần trên sang ống khác
- Cho vào 800 l ethanol 100% và ủ ở -80
0
C khoảng 30 phút
- Ly tâm bỏ phần dung dịch bên trên

- Làm khô DNA và cho vào TE
- Điện di và đọc kết quả
Phƣơng pháp tinh sạch đƣợc thực hiện theo kit sử dụng cột GFX do hãng
Amersham sản xuất, công ty Nguyên Anh cung cấp. Kit tinh sạch GFX cho phép tinh
sạch DNA trực tiếp hoặc thông qua phƣơng pháp cắt gel.
3.4.7.2 Quy trình tinh sạch DNA từ gel
Nhằm phân tách và thu nhận duy nhất đoạn DNA mong muốn và DNA plasmid
từ bản gel agarose sau khi điện di
Bƣớc 1: Gel sau khi chạy điện di, đƣợc đƣa lên hệ thống UV.
Bƣớc 2: Dùng dao sắc cắt phần gel chứa band DNA cần đƣợc tinh sạch cho vào
eppendoft 1.5ml ( đã cân trọng lƣợng trƣớc).
Bƣớc 3: Cho capture buffer vào eppendorf chứa gel trên với tỷ lệ 10mg gel ≈
10µl capture buffer.
Bƣớc 4: Đậy nắp lại ủ ở 60
o
C cho đến khi agarose tan hết (5 – 15 phút).
Bƣớc 5: Chuẩn bị cột GFX, đặt vào eppendorf tƣơng ứng với số mẩu cần tinh sạch.
Bƣớc 6: Sau khi ủ, đem ly tâm để tập trung mẩu ở đáy eppendorf.
34

Bƣớc 7: Hút hết mẩu sau khi ly tâm cho vào các cột đã chuẩn bị ở trên, ủ ở
nhiệt độ phòng 1 phút.
Bƣớc 8: Đem ly tâm 10000 vòng/phút trong 30giây ở 4
0
C.
Bƣớc 9: Cho thêm vào cột lƣợng wash buffer tƣơng ứng (tỉ lệ 1:5 theo thể tích
mẫu tinh sạch), ly tâm 10000 vòng/phút trong 30 giây ở 4
0
C.
Bƣớc 10: Lấy cột ra và đặt vào eppendoft 1.5ml mới.

Bƣớc 11: Hút 50µl elution buffer nhỏ vào cột GFX.
Bƣớc 12: Ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút.
Bƣớc 13: Ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút ở 4
0
C, lấy cột ra, đậy nắp lại.
Bƣớc 14: Điện di sản phẩm tinh sạch với sản phẩm chƣa tinh sạch trên gel
agarose 0.8 %, hiệu điện thế 100V trong 30 phút để kiểm tra kết quả
tinh sạch.
3.4.7.3 Quy trình tinh sạch trực tiếp sản phẩm PCR bằng cột GFX
Bƣớc 1: Chuẩn bị cột tinh sạch GFX đặt vào eppendorf tƣơng ứng với số mẫu
cần tinh sạch.
Bƣớc 2: Hút capture buffer cho vào các cột với tỷ lệ thể tích giữa capture buffer
và sản phẩm PCR là 5:1.
Bƣớc 3: Cho sản phẩm PCR vào các cột chứa capture buffer đã chuẩn bị ở trên,
ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút.
Bƣớc 4: Đem ly tâm 10000 vòng/phút trong 30 giây ở 4
0
C.
Bƣớc 5: Cho thêm vào cột một lƣợng wash buffer bằng với lƣợng capture
buffer cho vào ở trên, ly tâm 10000 vòng/phút trong 30 giây ở 4
0
C
Bƣớc 6: Lấy cột ra và đặt vào eppendoft 1.5ml mới.
Bƣớc 7: Hút elution buffer nhỏ vào cột GFX, tùy vào mục đích sử dụng sản
phẩm tinh sạch mà lƣợng elution buffer có thể thay đổi.
Bƣớc 8: Ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút.
Bƣớc 9: Ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút ở 4
0
C, lấy cột ra, đậy nắp eppendorf
lại.

Bƣớc 10: Điện di sản phẩm tinh sạch với sản phẩm chƣa tinh sạch trên gel
agarose 1% để kiểm tra kết quả tinh sạch.