Luận văn : Nghiên cứu quá trình lên men lactic từ mật rỉ đường part 1 potx

1




PHẦN 1. MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Ngày nay, nƣớc ta có nhiều nhà máy đƣờng tạo ra một sản lƣợng lớn về đƣờng
kết tinh. Bên cạnh đó một lƣợng không nhỏ mật rỉ đƣờng mà các nhà máy này thải ra
làm ô nhiễm môi trƣờng. Với những ứng dụng Công nghệ Sinh học đã sử dụng những
phế liệu mật rỉ để lên men tạo ra nhiều sản phẩm có giá trị nhƣ L-lysine, acid citric,
acid glutamic.v.v. và đặc biệt là acid lactic đƣợc quan tâm nhiều trong những năm gần
đây.
Nhu cầu cung cấp acid lactic ngày càng nhiều, bởi vì chúng đƣợc ứng dụng rộng
rãi trên nhiều lĩnh vực nhƣ bảo quản và chế biến thực phẩm, trong y học, môi trƣờng
(acid polylactic thay thế các loại sản phẩm nhựa PE, PP, đĩa CD, bịch nilon), mỹ
phẩm.v.v.
Tổng thị trƣờng thế giới về acid lactic 86.000 tấn vào năm 2001, 500.000 tấn vào
năm 2010. Ở Việt Nam: vào năm 2006, đại diện công ti dƣợc IIdong (Hàn Quốc) xuất
khẩu một số lƣợng lớn chế phẩm acid lactic sang hãng MERAP phân phối dƣợc ở Việt
Nam với giá trị hợp đồng 3,7 triệu USD [38], [39], [40].
Xuất phát từ tình hình thực tế trên, đƣợc sự đồng ý của Bộ môn Công nghệ Sinh
học trƣờng Đại học Nông Lâm TP.HCM. Dƣới sự hƣớng dẫn của Thầy Nguyễn Đức
Lƣợng trƣờng Đại học Bách Khoa và Thầy Phan Vĩnh Hƣng Trƣờng Cao đẳng Công
nghiệp Thực Phẩm TP.HCM. Chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu quá trình lên
men lactic từ mật rỉ đường”.
1.2. Mục đích của đề tài

Chọn vi khuẩn có khả năng sinh acid lactic nhiều nhất để sản xuất acid lactic.
1.3. Yêu cầu
- Phân lập vi khuẩn lactic
- Tuyển chọn các khuẩn lạc có khả năng lên men lactic
- Khảo sát các điều kiện tối ƣu cho quá trình lên men
- So sánh sự tạo acid tổng của các khuẩn lạc
- Sản xuất acid lactic từ mật rỉ



2




PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Giới thiệu về acid lactic
Acid lactic, 2-hydroxypropionic acid (CH
3
CHOHCOOH) là acid tồn tại rộng rãi
trong tự nhiên, đƣợc tìm thấy ở ngƣời, động vật, thực vật và vi sinh vật. Đƣợc phát
hiện vào năm 1780 do nhà hóa học Thụy Điển Sheele ở trong sữa chua. Acid lactic
đƣợc chấp nhận là sản phẩm của một quá trình lên men vào năm 1847 [2], [25], [32].
Trong cấu tạo phân tử của acid lactic có một carbon bất đối xứng nên chúng có
hai đồng phân quang học: D - acid lactic và L - acid lactic. Hai đồng phân quang học
này có tính chất hóa lý giống nhau, chỉ khác nhau khả năng làm quay mặt phẳng phân
cực ánh sáng, một sang phải và một sang trái. Do đó tính chất sinh học của chúng hoàn
toàn khác nhau.

Loại L - acid lactic ở dạng tinh thể. Chúng có khả năng tan trong nƣớc, tan trong
cồn, tan trong eter, không tan trong CHCl
3
, nhiệt độ nóng chảy 28
o
C [9]. L - acid
lactic đƣợc ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và dƣợc phẩm. Hầu hết các sinh
vật lên men lactic đồng hình đều tạo ra đƣợc các dạng đồng phân quang học [32].
Loại D - acid lactic là dạng tinh thể, tan trong nƣớc tan trong cồn. Nhiệt độ nóng
chảy 28
o
C.
Nếu D - acid lactic và L - acid lactic có trong một hỗn hợp theo tỉ lệ 50/50 ngƣời
ta gọi là hỗn hợp Raxemic. Trong quá trình lên men không khi nào có một hỗn hợp có
tỉ lệ lý tƣởng này mà chỉ có đƣợc hỗn hợp này khi tiến hành tổng hợp hữu cơ. DL -
acid lactic có khả năng tan trong nƣớc, trong cồn, không tan trong CHCl
3
[9].
2.2. Vi sinh vật trong lên men lactic
Vi khuẩn lactic có thể đƣợc phân lập từ các cây trồng trên thế giới bao gồm hạt
trái cây và rau [24]. Các loài Lactobacillus còn tìm thấy ở dạ dày, ruột non, ruột già và
âm đạo [21].



3

Vi khuẩn lactic là vi khuẩn gram dƣơng, không sinh bào tử, tỉ lệ G+C thấp, cầu
khuẩn hay hình que. Chúng sản xuất ra acid lactic nhƣ là sản phẩm lên men chính.
Chúng không có enzyme catalase mặc dù catalase giả có thể đƣợc tìm thấy trong
những trƣờng hợp rất hiếm vì vậy không phân giải oxi già. Các thành viên của nhóm
này thiếu cytochrome. Tất cả các vi khuẩn lactic phát triển trong điều kiện kị khí. Tuy
nhiên, không giống nhƣ những vi khuẩn kị khí, hầu hết các vi khuẩn acid lactic không
nhạy cảm với oxi và cũng có thể phát triển tốt trong điều kiện có mặt oxi cũng nhƣ
không có mặt oxi. Vì thế chúng là vi khuẩn kị khí tùy ý (Madigan et al. 2000) [30].
Sự phân chia vi khuẩn lactic dựa vào các sản phẩm của quá trình trao đổi chất
của carbohydrate, các loài Lactobacillus có thể phân chia thành 3 nhóm [23], [19].
- Nhóm I: Lên men đồng hình bắt buộc có fructose-1,6-diphosphate aldolase (FDP
aldolase) nhƣng không có phosphoketolase. Chúng lên men đƣợc hexose để tạo acid
lactic nhƣng không lên men đƣợc pentose.)
- Nhóm II: Lên men dị hình tùy ý (có FDP aldolase và cảm ứng phosphoketolase.
Tuy nhiên, hexose là lên men đồng hình và pentose đƣợc chuyển thành acid lactic và
ethanol hoặc acid acetic).
- Nhóm III: Lên men dị hình bắt buộc (Có phosphoketolase nhƣng không có FDP
aldolase, quá trình trao đổi chất cả hexose và pentose lên men dị hình).

4




Bảng 2.1. Phân loại Lactobacillus (Sharpe, 1981; Kandler và Weiss, 1986)
Đặc đểm
Nhóm I
Nhóm II
Nhóm III
Lên men pentose
Tạo CO
2
từ glucose
Tạo CO
2
từ gluconate
Sự hiện diện FDP aldolase
Sự hiện diện phosphoketolase
-
-
-
+
-
+

-
+
a
+
+
b

+
+
+
a

-
+
Một vài đại diện
L. acidophilus
L. delbrueckii
L. helveticus
L. salivarius
L. casei
L. curvatus
L. plantarum
L. sake
L. brevis
L. buchneri
L. fermentum
L. reuteri
a: Khi lên men
b: Cảm ứng khi có pentose
Một đặc điểm quan trọng dùng để phân biệt các giống vi khuẩn acid lactic là sự

lên men glucose dƣới các điều kiện chuẩn nhƣ: nồng độ glucose và các yếu tố tăng
trƣởng (các tiền chất acid amin, vitamin và acid nucleic) thì không giới hạn và giới hạn
sử dụng oxi. Dƣới những điều kiện này, vi khuẩn acid lactic có thể phân thành hai
nhóm: lên men lactic đồng hình thì chuyển hầu hết lƣợng glucose để tạo thành acid
lactic và lên men lactic dị hình thì glucose lên men tạo thành acid lactic, ethanol, acid
acetic và CO
2
. Thật ra việc kiểm tra sản phẩm khí từ glucose sẽ phân biệt đƣợc giữa
hai nhóm này (Sharpe, 1979).
2.2.1. Vi khuẩn lactic dị hình
Khi tiến hành lên men các dung dịch đƣờng, các vi khuẩn lactic dị hình thƣờng
tạo ra lƣợng acid lactic không lớn lắm. Ngoài acid lactic chúng còn tạo ra hàng loạt
các sản phẩm khác nhƣ acid acetic, ethanol, CO
2
[3], [9].
Một số loài vi khuẩn lactic dị hình đƣợc nghiên cứu nhƣ sau:
- Lactobacillus pasteurianus
Trực khuẩn, gram dƣơng, kích thƣớc rộng 0,5 – 1 μm; dài 7,0 – 35 μm. Trong
thiên nhiên chúng tồn tại riêng lẽ, không di động. Có khả năng lên men đƣợc, glucose,
fructose, galactose, maltose, saccharose, mannitol, dextrin. Trong quá trình lên men



5




tạo một số sản phẩm nhƣ CO
2

, alcohol, acid lactic, acid acetic. Nhiệt độ thích hợp 29 -
33
o
C, pH thích hợp 8 [9].
- Lactobacillus brevis
Thuộc trực khuẩn, gram dƣơng, không có khả năng di động, kích thƣớc rộng 0,7
- 1,0 μm, dài 2,0 - 4,0 μm. Trong thiên nhiên chúng liên kết với nhau thành chuỗi.
Trong quá trình phát triển, chúng có thể sử dụng lactat canxi nhƣ nguồn cung cấp
cacbon. Chúng có khả năng lên men các loại đƣờng nhƣ glucose, fructose, galactose,
maltose. Chúng hiếm khi lên men mannitol, glycerol, dextrin, và tinh bột. Chúng
không hóa lỏng gelatin [18].
- Lactobacillus lycopessici
Trực khuẩn, gram dƣơng, trong thiên nhiên chúng tồn tại từng đôi một, có khả
năng tạo bào tử. Trong quá trình lên men đƣờng, chúng tạo ra cồn, acid lactic, acid
acetic và CO
2
.
- Streptococcus cumoris
Thuộc loài cầu khuẩn, trong thiên nhiên chúng tồn tại thành từng chuỗi rất dài.
Thuộc gram dƣơng, nhiệt độ thích hợp phát triển là 30
o
C, không phát triển ở nồng độ
NaCl 4 %. Khi lên men đƣờng tạo ra acid acetic, diacetyl, CO
2
. Chúng có khả năng tạo
ra những chất kháng khuẩn .
- Streptolacticus lactic
Thuộc chồi cầu khuẩn, gram dƣơng, nhiệt độ phát triển từ 10 – 45
o
C, có khả

năng chịu đƣợc nồng độ NaCl 4 %. Khi lên men đƣờng glucose, maltose, lactose,
xylose, saccharose, mannitol, tạo ra acid lactic, acid acetic, diacetyl, CO
2
. Chúng không
có khả năng lên men đƣợc glycerol, sorbitol .
- Streptococcus faecalis
Chúng tạo thành chuỗi tế bào hình cầu, gram dƣơng. Nhiệt độ tối ƣu 37
o
C, nhiệt
độ sinh trƣởng 10 - 45
o
C, có thể phát triển duới hoặc 5
o
C, hiếm khi phát triển ở 50
o
C.
Có khả năng sống sót ở 62,8
o
C trong 30 phút. Phát triển ở pH 9,6. Chịu đƣợc nồng độ
NaCl 2 %, 4 % và 6,5 %. Có khả năng lên men đƣờng glucose, maltose, lactose và
luôn luôn lên men mannitol; có hoặc không thể lên men sucrose, glycerol, sorbitol
[18].




6

2.2.2. Vi khuẩn lactic đồng hình
Khi tiến hành lên men các dung dịch đƣờng thì vi khuẩn lactic đồng hình thƣờng
tạo ra acid lactic là chủ yếu [3], [9].
Một số loài vi khuẩn lactic điển hình đƣợc nghiên cứu kỹ nhƣ sau:
- Lactobacillus acidophilus
Lần đầu tiên đƣợc phân lập bởi Moro (1900) đƣợc phân lập từ phân của trẻ sơ
sinh đã qua phẩu thuật và bê mới đẻ . Có dạng hình que, chịu nhiệt, quá trình lên men
tạo ra 2,2 % acid lactic [4], [17]. Chúng có kích thƣớc rộng 0,6 - 0,9 μm, dài 1,5 - 6,0
μm. Trong thiên nhiên chúng tồn tại riêng lẽ. Đôi khi chúng tạo thành những chuỗi
ngắn. Trên môi trƣờng gelatin: chúng không phát triển ở 20
o
C, không có khả năng hóa
lỏng. Trên môi trƣờng khoai tây thì không phát triển. Chúng thuộc nhóm vi khuẩn
gram dƣơng và không di động. Chúng có khả năng lên men đƣờng nhƣ glucose,
fructose, galactose, maltose, lactose, để tạo acid lactic. Chúng không có khả năng lên
men glycerol, mannitol, sorbitol. Không thể phát triển đƣợc trong môi trƣờng không
có carbohydrate. Nhiệt độ tối ƣu 37
o
C. Nó phát triển từ 20 - 22
o
C. Nhiệt độ phát triển
tối đa 43 - 48
o
C [18].
- Lactobacillus bulgaricus
Chúng đƣợc tìm ra do Mesnhicov ở sữa chua Bungari [14]. Thuộc loại trực
khuẩn có kích thƣớc rất dài, liên kết với nhau tạo thành chuỗi, gram dƣơng. Chúng
không có khả năng di động, có khả năng lên men các loại đƣờng nhƣ glucose, lactose,
galactose. Có thể hoặc không thể lên men fructose, maltose và sucrose. không lên men

đƣợc xylose, mannitol, dextrin. Chúng không có khả năng tạo ra nitrit từ nitrate [9].
Quá trình lên men tạo 3,7 % acid lactic [14]. Trên môi trƣờng khoai tây, có khuẩn lạc
trắng vàng [18]. pH thích hợp cho sự phát triển là pH = 5,2 - 5,6 [7]. Nhiệt độ tối ƣu
45 - 50
o
C. Tối thiểu 22
o
C [20]. Trong sản xuất qui mô lớn, chúng thƣờng đƣợc chọn
để lên men Whey để tạo acid lactic, sau đó dùng Ca(OH)
2
để trung hòa lƣợng acid
lactic tạo thành. Nhiệt độ lên men 43
o
C, với nhiệt độ này đủ để ức chế các vi sinh vật
gây nhiễm mà không ức chế L. bulgaricus [22].
- Lactobacillus bifidus
Trực khuẩn rất nhỏ, kích thƣớc trung bình khoảng 4 μm, không có khả năng di
động, thuộc gram dƣơng. Chúng có thể đứng riêng lẽ, cặp và chuỗi ngắn. Có khả năng



7




lên men đƣợc các loại đƣờng nhƣ glucose, fructose, galactose, saccharose, dextrin, tinh
bột và maltose [18].
- Lactobacillus casei
Vi khuẩn đƣợc phân lập từ sữa, sản phẩm của sữa, ủ xylo- thức ăn xanh dùng

trong chăn nuôi, vi khuẩn dạng hình que, kích thƣớc 0,7 - 1,1 μm; 2,0 - 4,0 μm, trực
khuẩn nhỏ thƣờng gặp ở dạng chuỗi dài hay chuỗi ngắn [4]. Chúng thuộc gram dƣơng,
không có khả năng lên men đƣợc các loại đƣờng nhƣ glucose, fructose, galactose,
maltose, lactose và mannitol; có hoặc không thể lên men sucrose. Nhiệt độ phát triển
tối ƣu là 30
o
C, thấp nhất 10
o
C. Tối đa 37 - 40
o
C và vài chủng có thể 45
o
C. Quá trình
lên men tạo khoảng 1,5 % acid lactic [18].
- Lactobacillus causaciccus
Trực khuẩn ngắn, không có khả năng di động, gram dƣơng. Chúng có khả năng
lên men các loại đƣờng nhƣ glucose, fructose, galactose, maltose, lactose, mannitol.
Nhiệt độ phát triển tối ƣu là 48 - 55
o
C [9].
- Lactobacillus delbrueckii
Thƣờng gặp chúng trên hạt đại mạch [14]. Vi khuẩn chịu nhiệt, đƣợc tìm thấy ở
các loài hạt ngũ cốc và tinh bột, đây là một giống vi khuẩn có khả năng đồng hóa đƣợc
tinh bột. Trực khuẩn dài, kích thƣớc 0,5 - 0,8 μm; 2,0 - 9,0 μm, không di động, gram
dƣơng. Quá trình lên men tạo 2,5 % acid lactic. Chúng có khả năng lên men đƣợc
glucose, fructose, maltose, sucrose, galactose và dextrin. Chúng không có khả năng lên
men xylose, lactose, tinh bột, mannitol. Nhiệt độ tối ƣu 45
o
C [9], [18].
-Lactobacillus leichmannii

Trực khuẩn gram dƣơng. Kích thƣớc tế bào 0,6 – 2 μm. Vi khuẩn này có khả
năng tạo thành chuỗi ngắn, không di động, gram dƣơng. Nhiệt độ tối ƣu 36
o
C. Tối đa
40 - 46
o
C. Chúng không có khả năng tạo nitrit từ nitrate. Có khả năng lên men
glucose, fructose, maltose, saccharose. Trong môi trƣờng khoai tây chúng tạo 1,3 %
acid lactic [18].
- Lactobacillus helveticcus
Thuộc trực khuẩn có kích thƣớc 0,7 - 0,9 μm; 2,0 - 6,0 μm. Trong thiên nhiên
chúng có thể tồn tại riêng từng tế bào, cũng có thể tồn tại thành từng chuỗi tế bào.
Nhiệt độ phát triển 40 - 42
o
C. Chúng có khả năng lên men đƣợc glucose, fructose,
galactose, maltose và lactose [9].



8




- Lactobacillus thermophillus
Trực khuẩn, gram dƣơng, kích thƣớc tế bào 0,5 - 3,0 μm, không có khả năng di
động. Lên men đƣợc glucose, lactose, sucrose, tinh bột và dạng glycerol. Không tạo
acid từ mannitol. Lên men đƣợc fructose, galactose, maltose và dextrin. Không tạo
nitrit từ nitrate. Nhiệt độ tối ƣu 50 - 62,8
o

C. Nhiệt độ tối thiểu 30
o
C, nhiệt độ tối đa
65
o
C. Điểm nhiệt độ chết khoảng 71
o
C trong 30 phút [18].
- Lactobacillus plantanrum
Trực khuẩn, gram dƣơng, kích thƣớc tế bào 0,7 - 1,0 μm; 3,0 - 8,0 μm. Nhiệt độ
tối ƣu 30
o
C. Tối thiểu 10
o
C, tối đa 40
o
C. Điểm nhiệt độ chết từ 65 - 75
o
C trong 15
phút. Có khả năng chịu nồng độ NaCl 5,5 %. Chúng có khả năng lên men glucose,
fructose, galactose, sucrose, maltose và lactose. Tinh bột thì không lên men. Không tạo
đƣợc nitrit từ nitrate [18].
- Lactobacillus sporogenes
Thuộc giống Lactobacillus dựa trên các đặc tính bởi Nakayama và Yanoshi
(1967). Chúng thuộc Gram dƣơng, có khả năng sinh bào tử, có dạng hình que, kích
thƣớc 3 – 5 μm, thuộc vi khuẩn hiếu khí, là vi khuẩn lactic đồng hình sản xuất ra axít
lactic L(+) - (dextrorotraytory), phát triển ở nhiệt độ dao động từ 35 - 50
o
C, pH tối ƣu
dao động từ 5,5 - 6,5, phản ứng với catalase dƣơng tính. Tạo acid từ glucose,

galactose, fructose, maltose và sucrose. Không có thủy phân tinh bột hoặc casein,
không hóa lỏng gelatin. phản ứng indol âm tính và không tạo khí [31].
2.3. Cơ chế tạo ra acid lactic [20]
Kluyver chia vi khuẩn lactic thành 2 nhóm dựa vào sản phẩm cuối của quá trình
chuyển hóa glucose. Quá trình này tạo acid lactic là sản phẩm chính từ lên men
glucose đƣợc gọi là lên men đồng hình. Số lƣợng acid lactic đồng hình thu đƣợc nhiều
hơn lactic dị hình khoảng 2 lần. Vi khuẩn lactic dị hình lên men từ hexose tạo số lƣợng
mole lactat, CO
2
và ethanol bằng nhau.



9




Bảng 2.2 Vi khuẩn lên men lactic đồng hình và dị hình [20]
Lên men đồng hình
Lên men dị hình
Sinh vật
Dạng
lactat
% G+C
Sinh vật
Dạng
lactat
% G+C
Lactobacillus

Lactobacillus


L. acidophilus
DL
36,7
L. brevis
DL
42,7 - 46,4
L. bulgaricus
D(-)
50,3
L. buchneri
DL
44,8
L. casei
L(+)
46,4
L. cellobiosus
DL
53
L. coryniformis
DL
45
L. coprophilus
DL
41,0
L. curvatus

DL
43,9
L. fermentum
DL
53,4
L. delbrueckii
D(-)
50
L. hilgardii
DL
40,3
L. helveticus
DL
39,3
L. sanfrancisco
DL
38,1 - 39,7
L. jugurti
DL
36,5-39,0
L. trichoides
DL
42,7
L. jensenii
D(-)
36,1
L. fructivorans
DL
38 - 41
L. lactis

D(-)
50,3
L. pontis
DL
53 - 56
L. leichmannii
D(-)
50,8
Leuconostoc


L. plantarum
DL
45
L.cremoris
D(-)
39 - 42
L. salivarius
L(+)
34,7
L.dextranicum
D(-)
38 - 39
Pediococcus


L.lactis
D(-)
43 - 44
P.acidilactici

DL
44,0
L.mesenteroides
D(-)
39 - 42
P.cerevisiae
DL

L.gelidum
D(-)
37
P.pentosaceus
DL
38
L.carnosum
D(-)
39
Streptococcus


Carnobaterium


S.bovis
D(-)
38 – 42
C.divergens

33,0 - 36,4
S.thermophilus

D(-)
40
C.mobile

35,5 - 37,2
Lactococcus


C.gallinarum

34,3 - 36,4
L.lactis subsp. lactis
D(-)
38,4 - 38,6
C.piscicola

33,7 - 36,4
L.lactissubsp.cremoris
D(-)
38,0 - 40,0
Weissella


L.lactissubsp.hordniae

35,2
W.confusa
DL
44,5 - 45,0
L.garvieae

38,3 - 38,7
W.hellenica
D(-)
37 - 47
L.plantarum

36,9 - 38,1
W.halotolerans
DL
45
L.raffinolactis

40,0 - 43
W.kandler
DL
39
Vagococcus


W.minor
DL
44
V.fluvialis

33,6
W.paramesenteroides
D(-)
38 - 39
V.salmoninarum

36,0 - 36,5
W.viridescens
DL
43



Oenococcus





O.oeni
DL
38 - 42




10




2.3.1. Vi khuẩn lactic dị hình [9]
Tất cả các vi khuẩn lactic dị hình thƣờng thiếu hai loại enzym quan trọng đó là
aldolase và hexose isomerase. Do đó trong giai đoạn đầu của quá trình lên men, chúng
thƣờng đƣợc tiến hành theo con đƣờng hexose monophosphate hay gọi là con đƣờng

pentose phosphate (PP ) . Quá trình chuyển hóa đƣờng đƣợc trình bày nhƣ sau:


2.3.2.Vi khuẩn lactic đồng hình
Quá trình lên men lactic đồng hình nhờ có enzyme aldolase và hexose isomerase
nhƣng thiếu phosphoketolase. Chúng sử dụng con đƣờng Embden-Meyerhof-Parnas
(EMP) để tạo 2 phân tử lactat từ 1 phân tử glucose [9], [19], [20]. Quá trình chuyển
hóa đƣợc trình bày nhƣ sau: