Luận văn : NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHUYỂN NẠP GEN CỦA HAI GIỐNG BÔNG VẢI SSR60F VÀ COKER 312 BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens part 5 pptx

41
Trong 7 thí nghiệm sau này, các mô sẹo đƣợc tách nhỏ (khoảng 3 mm) trƣớc
khi cấy chuyển lên môi trƣờng thanh lọc lần 3. Kết quả là các mô sẹo chuyển màu nâu
đen rất nhiều (hình 4.5 B). Đây là các mô sẹo chết. Quan sát trên một số mô sẹo hóa
nâu thấy có xuất hiện các mô sẹo mới. Các mô sẹo này có thể là những mô sẹo đƣợc
chuyển nạp gen.

Hình 4.5. Mô sẹo mẫu lây nhiễm giống Coker 312 sau 2 tuần trên môi trƣờng
thanh lọc lần 3. A: Mô sẹo không tách nhỏ, B: Mô sẹo tách nhỏ

4.1.2. Tỷ lệ hình thành mô sẹo
Trong nuôi cấy mô, sự phát sinh hình thái của mẫu cấy có một ý nghĩa rất quan
trọng. Các mẫu cấy có thể phát sinh hình thái theo các hƣớng: hình thành mô sẹo, phát
sinh phôi hay tái sinh thành cây. Tỷ lệ hình thành mô sẹo là một trong những chỉ tiêu
quan trọng trong nuôi cấy mô thông thƣờng và chuyển gen. Tỷ lệ hình thành mô sẹo
cho chúng ta biết đƣợc khả năng hình thành mô sẹo của mẫu nuôi cấy. Trong thí
nghiệm, tỷ lệ hình thành mô sẹo đƣợc theo dõi ở thời điểm sau 7 ngày.

42
Bảng 4.1. Tỷ lệ hình thành mô sẹo của giống Coker 312 (sau 7 ngày trên môi
trƣờng phục hồi)
Thí
nghiệm
Số mẫu ban đầu
Số mẫu tạo mô sẹo
(sau 7 ngày)
Tỷ lệ (%)
Đối chứng
MLN
Đối chứng

MLN
Đối chứng
MLN
1
60
160
60
158
100
98,75
2
60
130
60
128
100
98,46
3
60
155
60
154
100
99,35
4
60
120
60
120
100

100
Trung bình
100
99,14
Ghi chú: MLN (mẫu lây nhiễm)

Bảng 4.2. Tỷ lệ hình thành mô sẹo của giống SSR60F (sau 7 ngày trên môi
trƣờng phục hồi)
Thí
nghiệm
Số mẫu ban đầu
Số mẫu tạo mô sẹo
(sau 7 ngày)
Tỷ lệ (%)
Đối chứng
MLN
Đối chứng
MLN
Đối chứng
MLN
1
60
185
59
169
98,33
91,35
2
60
176

58
160
96,67
90,91
3
60
190
60
176
100
92,63
4
60
190
59
176
98,33
92,63
5
60
200
57
180
97,67
90,00
Trung bình
96,67
91,50
Ghi chú: MLN (mẫu lây nhiễm)

Tỷ lệ hình thành mô sẹo giữa các giống có sự khác nhau. Sau 7 ngày (sau 10
ngày) trên môi trƣờng phục hồi, mẫu lây nhiễm có tỷ lệ hình thành mô sẹo cao nhất ở
giống Coker 312 đạt 99,14%, giống SSR60F đạt 91,50%. Các mẫu lây nhiễm ở giống
Coker 312 hình thành mô sẹo ngay khi còn trên môi trƣờng phục hồi. Trong khi đó,
các mẫu lây nhiễm của giống SSR60F hình thành mô sẹo chậm hơn (hình 4.6).


43


Hình 4.6. Mô sẹo trên môi trƣờng phục hồi. A: Mô sẹo mẫu đối chứng giống
SSR60F, B: Mô sẹo mẫu lây nhiễm giống SSR60F, C: Mô sẹo mẫu đối chứng
giống Coker 312, D: Mô sẹo mẫu lây nhiễm giống Coker 312

Tất cả các mẫu đối chứng của giống Coker 312 đều hình thành mô sẹo ngay khi
còn ở trên môi trƣờng phục hồi và đạt tỷ lệ 100%. Trong khi đó mẫu đối chứng của
giống SSR60F hình thành mô sẹo chậm hơn và chỉ đạt tỷ lệ 96,67%. Các mẫu đối
chứng hình thành mô sẹo mạnh hơn các mẫu lây nhiễm. Điều này có thể giải thích là
do mẫu lây nhiễm bị tổn thƣơng do các tác nhân nhƣ: vật lý (thao tác khi cấy, va chạm
giữa các mẫu, rửa mẫu…), hóa học (nƣớc, kháng sinh, môi trƣờng…). Tuy nhiên, sau
khi chuyển lên môi trƣờng thanh lọc lần một tất cả các mẫu đều hình thành mô sẹo.
Những mẫu chƣa tạo mô sẹo trên môi trƣờng phục hồi đều đƣợc cấy chuyển lên môi
trƣờng thanh lọc lần 1 và sau 14 ngày trên môi trƣờng thanh lọc lần 1, tất cả những
mẫu này đều hình thành mô sẹo.
Kết quả bảng 4.1 và bảng 4.2 cho thấy hai giống đáp ứng hình thành mô sẹo
tốt. Trong khi đó Chaudhary và ctv. (2003) báo cáo một tỷ lệ hình thành mô sẹo thấp
hơn (78% của mẫu lây nhiễm sau 10-15 ngày). Tỷ lệ hình thành mô sẹo khác nhau này
có thể là do Chaudhary và ctv. (2003) đã chuyển các mẫu lây nhiễm lên môi trƣờng
thanh lọc (tác nhân thanh lọc là kanamycin) ngay. Hơn nữa, giống bông vải sử dụng
cũng khác nhau (giống Coker 310). Tuy nhiên, tỷ lệ hình thành mô sẹo ở mẫu đối

44
chứng lại giống nhau (100%). Điều này có nghĩa là sự khác nhau trong tỷ lệ hình thành
mô sẹo của mẫu lây nhiễm là do thời điểm quan sát khác nhau và việc mẫu ngay lên
môi trƣờng thanh lọc có ảnh hƣởng tới tỷ lệ hình thành mô sẹo.
Theo Firoozabady (1987) và Rajasekaran (1996) khả năng tái sinh của cây bông
còn phụ thuộc rất lớn vào kiểu gen và mẫu nuôi cấy. Điều này cho thấy rằng sự khác
nhau trong tỷ lệ hình thành mô sẹo giữa các giống bông vải ở trên một phần cũng do
ảnh hƣởng của kiểu gen. Ngoài ra không loại trừ khả năng sự khác nhau trong tỷ lệ
hình thành mô sẹo giữa các giống còn do thác tác trong thí nghiệm. Các thao tác giữa
các lần thí nghiệm về mặt chi tiết có thể khác nhau. Ví dụ nhƣ trong thao tác rửa vi
khuẩn chỉ cần để các mẫu lây nhiễm lâu hơn một chút trong nƣớc là cũng có thể làm
cho mẫu thâm đen và do đó làm kéo dài thời gian hình thành mô sẹo.

4.2. Kết quả thanh lọc
Trong chuyển nạp gen, thanh lọc mẫu là điều rất quan trọng. Thanh lọc các
mẫu giúp loại bỏ bớt các mẫu không đƣợc chuyển nạp gen. Các mẫu không chuyển
nạp gen đƣợc loại bỏ bằng cách đặt các mẫu trên môi trƣờng chứa tác nhân thanh lọc.
Những mẫu không chuyển nạp gen sẽ không phát triển hoặc phát triển chậm trên môi
trƣờng có tác nhân thanh lọc. Trong khi đó, các mẫu đƣợc chuyển nạp lại sống sót và
phát triển tốt trên môi trƣờng có tác nhân thanh lọc. Kết quả thanh lọc đƣợc đánh giá
dựa trên số mẫu sống sót trên môi trƣờng thanh lọc.

4.2.1. Thanh lọc lần 1
Sau bảy ngày trên môi trƣờng phục hồi, các mẫu đƣợc chuyển lên môi trƣờng
thanh lọc lần 1 (MSS1). Môi trƣờng MSS1 có chứa 1% glucose và 2,5% mannose.


45
Bảng 4.3. Kết quả thanh lọc lần 1 giống Coker 312 (sau 14 ngày trên MSS1)

Thí
nghiệm
Số mẫu ban đầu
Số mẫu sống sót
Tỷ lệ (%)
Đối chứng
MLN
Đối chứng
MLN
Đối chứng
MLN
1
60
160
60
157
100
98,13
2
60
130
60
126
100
96,92
3
60
155
60
153

100
98,71
4
60
120
60
115
100
95,83
Trung bình
100
97,40
Ghi chú: MLN (mẫu lây nhiễm)

Bảng 4.4. Kết quả thanh lọc lần 1 giống SSR60F (sau 14 ngày trên MSS1).
Thí
nghiệm
Số mẫu ban đầu
Số mẫu sống sót
Tỷ lệ (%)
Đối chứng
MLN
Đối chứng
MLN
Đối chứng
MLN
1
60
185
60

180
100
97,29
2
60
176
60
173
100
98,29
3
60
190
60
185
100
97,36
4
60
190
60
188
100
98,94
5
60
200
60
197
100

98,50
Trung bình
100
98,08
Ghi chú: MLN (mẫu lây nhiễm)

Nhận xét:
- Sau 14 ngày trên môi trƣờng MSS1, các mô sẹo hình thành tốt. Giữa mẫu đối
chứng và mẫu lây nhiễm không có sự khác biệt (hình 4.7). Nguyên nhân chính là do
trong môi trƣờng MSS1 có chứa 1% (w/v) đƣờng glucose nên các mẫu cả đối chứng
và lây nhiễm đều sử dụng dạng đƣờng này trƣớc để phát triển.
- Một số mẫu chết trong lần thanh lọc thứ nhất có mầu nâu đen và gần nhƣ
không hình thành mô sẹo. Các mẫu này chết là do các tác nhân lý hóa học.
- Sau 14 ngày trên môi trƣờng thanh lọc lần 1 MSS1, mô sẹo của các mẫu lây
nhiễm có kích thƣớc nhỏ hơn so với mô sẹo của các mẫu đối chứng.

46
- Tỷ lệ mẫu mô sẹo sống sót giữa mẫu đối chứng và mẫu lây nhiễm của mỗi
giống lần lƣợt là:
- Giống Coker312: 100% và 97,40%.
- Giống SSR60F: 100% và 98,08%.


Hình 4.7. Mô sẹo giống Coker 312 sau 14 ngày trên môi trƣờng
MSS1. A: mẫu đối chứng, B: mẫu lây nhiễm.

4.2.2. Thanh lọc lần 2
Sau 14 ngày trên môi trƣờng MSS1, các mẫu đƣợc cấy chuyển lên môi trƣờng
thanh lọc lần 2 (MSS2). Môi trƣờng MSS2 là môi trƣờng thanh lọc lần 2 có chứa 0,5%
glucose và 3% mannose.

Bảng 4.5. Kết quả thanh lọc lần 2 giống Coker 312 (sau 14 ngày trên MSS2)
Thí
nghiệm
Số mẫu ban đầu
Số mẫu sống sót
Tỷ lệ (%)
Đối chứng
MLN
Đối chứng
MLN
Đối chứng
MLN
1
60
157
60
150
100
98,12
2
60
126
60
125
100
96,92
3
60
153
60

147
100
98,71
4
60
119
60
117
100
99,17
Trung bình
100
97,28
Ghi chú: MLN (mẫu lây nhiễm)

47
Bảng 4.6. Kết quả thanh lọc lần 2 các mẫu lây nhiễm giống SSR60F (sau 14 ngày
trên MSS2).
Thí
nghiệm
Số mẫu ban đầu
Số mẫu sống sót
Tỷ lệ (%)
Đối chứng
MLN
Đối chứng
MLN
Đối chứng
MLN
1

60
180
60
179
100
99,44
2
60
173
60
172
100
99,42
3
60
185
60
180
100
97,29
4
60
188
60
183
100
97,34
5
60
197

60
193
100
97,97
Trung bình
100
98,29
Ghi chú: MLN (mẫu lây nhiễm)

Nhận xét:
- Sau 14 ngày trên môi trƣờng thanh lọc lần 2 (MSS2), các mô sẹo ra tăng kích
thƣớc rất nhanh và theo quan sát thì kích thƣớc khối mô sẹo ra tăng gấp đôi so với kích
thƣớc khi mới đặt lên trên môi trƣờng thanh lọc lần 1 (hình 4.8 A, B).
- Giữa mô sẹo mẫu đối chứng và mô sẹo mẫu lây nhiễm vẫn chƣa có sự khác
biệt rõ ràng (hình 4.8 C, D). Các khối mô sẹo của mẫu đối chứng và mẫu lây nhiễm
trên môi trƣờng có tác nhân thanh lọc phát triển nhƣ nhau.
- Trên môi trƣờng thanh lọc lần 2, các mẫu đối chứng chƣa có dấu hiệu chậm
phát triển lại, điều này có thể giải thích do trên môi trƣờng thanh lọc lần 2 có 0,5%
(w/v) glucose nên các mẫu đối chứng vẫn phát triển đƣợc.
- Tỷ lệ mô sẹo sống sót giữa mẫu đối chứng và mẫu lây nhiễm của mỗi giống
lần lƣợt:
- Giống Coker312: 100% và 97,28%.
- Giống SSR60F: 100% và 98,295.
- So sánh tỷ lệ sống sót của mô sẹo mẫu đối chứng và mẫu lây nhiễm thì thấy
rằng tỷ lệ sống sót của mô sẹo mẫu đối chứng cao hơn mô sẹo mẫu lây nhiễm. Điều
này có thể do tác nhân thanh lọc chƣa có ảnh hƣởng nhiều tới mô sẹo. Hơn nữa, các
mẫu lây nhiễm phải chịu các tổn thƣơng trƣớc khi cấy chuyển lên môi trƣờng thanh
lọc.

48

Hình 4.8. Các khối mô sẹo giống Coker 312 trên môi trƣờng thanh lọc. A:
trên môi trƣờng thanh lọc lần 2, B: trên môi trƣờng thanh lọc lần 1, C, D:
mẫu lây nhiễm và mẫu đối chứng 2 tuần trên môi trƣờng thanh lọc lần 2.

4.2.3. Thanh lọc lần 3
Trên môi trƣờng thanh lọc MSS3, trong 2 thí nghiệm đầu tiên, các khối mô
sẹo không đƣợc tách nhỏ, sau 14 ngày trên môi trƣờng MSS3 thì thấy rằng:
- Ở các khối mô sẹo lây nhiễm xuất hiện hai loại mô sẹo: một có màu trắng xám
và một có màu xanh vàng mọc ra ngay bên cạnh các mô sẹo màu trắng xám. Các mô
sẹo màu trắng xám có thể do hai nguồn gốc: một là từ các tế bào già chết và một từ các
tế bào không chuyển nạp gen chết. Các khối mô sẹo của mẫu lây nhiễm có nhiều mô
sẹo màu trắng xám hơn các khối mô sẹo của mẫu đối chứng.
- Không có sự khác biệt rõ ràng giữa mẫu đối chứng và mẫu lây nhiễm về mặt
hình thái (hình 4.9 A, B). Nguyên nhân có thể do các khối mô sẹo không đƣợc tách
nhỏ trƣớc khi chuyển lên môi trƣờng MSS3 nên trong các khối mô sẹo của mẫu đối
chứng có thể có sự tích tụ đƣờng glucose. Tuy nhiên, sau 28 ngày trên môi trƣờng

49
MSS3, trên mẫu lây nhiễm có một số khối mô sẹo chuyển sang màu nâu xám và sậm
màu dần, mẫu đối chứng cũng chuyển màu tƣơng tự (hình 4.10 A, B). Các khối mô sẹo
này đƣợc cho kết luận đã chết. Ở mẫu đối chứng cũng có các khối mô sẹo tƣơng tự.
Nhƣ vậy, có thể thấy rằng thanh lọc lần 3 chỉ có hiệu quả khi các mẫu đƣợc nuôi cấy ít
nhất khoảng 28 ngày trên môi trƣờng MSS3. Tuy vậy, nồng độ mannose vẫn đƣợc đề
nghị tăng lên ở các lần thanh lọc. Nồng độ mannose có thể bắt đầu là 3% (w/v) và
thanh lọc lần 3 sẽ là 4% (w/v). Bởi vì hiệu quả thanh lọc chƣa cao. Hơn nữa, trƣớc khi
đƣợc cấy chuyển lên môi trƣờng thanh lọc lần 3 (MSS3) các khối mô sẹo nên đƣợc
tách nhỏ để rút ngắn thời gian thanh lọc.

Hình 4.9. Mô sẹo giống Coker 312 (không tách nhỏ, sau 14 ngày) trên môi
trƣờng thanh lọc lần 3 (A: mẫu lây nhiễm, B: mẫu đối chứng, C, D: khối mô
sẹo có các tế bào hóa nâu và các cụm mô sẹo mới)


50

Hình 4.10. Mô sẹo giống Coker 312 sau 28 ngày trên môi trƣờng
thanh lọc lần 3. A: mẫu lây nhiễm, B: mẫu đối chứng chết.

Trong 7 thí nghiệm sau , sau 14 ngày trên môi trƣờng thanh lọc MSS2, các khối
mô sẹo đƣợc tách nhỏ (khoảng 3 mm) và chuyển lên môi trƣờng MSS3 có 3,5%
mannose và 0% glucose. Kết quả thanh lọc lần 3 các mẫu lây nhiễm (sau 14 ngày trên
MSS3) đƣợc tóm tắt ở bảng 4.7 và bảng 4.8.
Kết quả cho thấy, hiệu quả chọn lọc mannose có biểu hiện rõ. Các cụm mô sẹo
đều chuyển sang màu nâu đen (cả đối chứng và mẫu lây nhiễm). Các cụm mô sẹo này
không phát triển gia tăng kích thƣớc và chết (hình 4.11 A và B). Tuy nhiên một số mô
sẹo sau khi hoá đen lại phát triển các mô sẹo mới ở các mẫu chuyển nạp gen. Ở mẫu
đối chứng không chuyển nạp gen, tỷ lệ chết là 100% ở cả 2 giống; ở mẫu chuyển nạp
gen, tỷ lệ sống sót là 1,73% ở giống Coker 312 và 3,67% ở giống SSR60F. Việc tách
nhỏ các khối mô sẹo trƣớc khi cho thanh lọc lần 3 là rất cần thiết để tránh tình trạng
thoát (escape) trong thanh lọc.