Nghiên cứu khả năng chuyền nạp Gen của hai giống bông vải SSR60F và COKER 312

1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***000***



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP




NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHUYỂN NẠP GEN CỦA HAI
GIỐNG BÔNG VẢI SSR60F VÀ COKER 312 BẰNG VI
KHUẨN Agrobacterium tumefaciens







Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khoá: 2001 – 2005
Sinh viên thực hiện: PHẠM QUYẾT THẮNG



Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8/2005

2
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***000***






KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP




NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHUYỂN NẠP GEN CỦA HAI
GIỐNG BÔNG VẢI SSR60F VÀ COKER 312 BẰNG VI KHUẨN
Agrobacterium tumefaciens

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8/2005
Giáo viên hƣớng dẫn:
TS. Trần Thị Cúc Hoà

Sinh viên thực hiện:
Phạm Quyết Thắng

3
LỜI CẢM TẠ

Chân thành cảm ơn:
Ban giám hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.
Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học.
Các Thầy cô trong và ngoài Trƣờng Đại Học Nông Lâm.
Đã truyền đạt cho em những kiến thức khoa học trong thời gian em học tập tại
trƣờng.
Đặc biệt xin chân thành cảm ơn:
TS. Trần Thị Cúc Hòa- Trƣởng bộ môn Công Nghệ Sinh Học- Viện Lúa
Đồng Bằng Sông Cửu Long, TS. Trần Thị Dung- Trƣởng bộ môn Công
Nghệ Sinh Học- Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã
tận tình dạy bảo, hƣớng dẫn, giúp đỡ em trong nghiên cứu và thực hiện khóa
luận.
TS. Trần Ngọc Thạch đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo em trong suốt thời gian
em thực hiện khóa luận.
Các anh chị trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học Viện Lúa Đồng Bằng Sông
Cửu Long.
Xin cảm ơn các bạn trong và ngoài lớp đã động viên giúp đỡ trong suốt quá

trình học tập và làm khóa luận tốt nghiệp.
Con xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến bố mẹ, những ngƣời đã sinh thành, nuôi
dƣỡng, dạy dỗ con và luôn bên con trong mọi thời điểm.

Thủ Đức, ngày 15 tháng 09 năm 2005
Phạm Quyết Thắng

4
TÓM TẮT

PHẠM QUYẾT THẮNG, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005.
“NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHUYỂN NẠP GEN CỦA HAI GIỐNG BÔNG VẢI
SSR60F VÀ COKER 312 BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens”

Giảng viên hƣớng dẫn:

TS. TRẦN THỊ CÚC HÒA
Nghiên cứu chuyển nạp gen vào cây bông vải nhằm đƣa vào những đặc tính
mong muốn: kháng sâu bệnh, kháng thuốc diệt cỏ, tăng cƣờng chất lƣợng sợi… là điều
rất cần thiết đối với ngành trồng bông của nƣớc ta hiện nay. Việc ứng dụng hệ thống
thanh lọc bằng đƣờng mannose và chuyển nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens trên cây bông hiện vẫn còn mới mẻ tại Việt nam. Việc sử dụng hệ thống
thanh lọc bằng đƣờng mannose có ƣu điểm vì không tạo ra sự lo ngại về an toàn sinh
học nhƣ đối với hệ thống thanh lọc bằng chất kháng sinh.
Khóa luận “Nghiên cứu khả năng chuyển nạp gen của hai giống bông vảI
SSR60F và Coker 312 bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens” đƣợc thực hiện
nhằm mục đích nhằm tìm hiểu khả năng chuyển nạp gen của hai giống bông vải
SSR60F và Coker 312, trong đó tập trung nghiên cứu về sử dụng hệ thống chọn lọc
bằng mannose để thanh lọc mô sẹo của bông vải sau khi đƣợc chuyển nạp.
Trong nghiên cứu này, véctơ (vector) pManCa đã đƣợc thiết kế mang gen đánh

dấu chọn lọc pmi (để sử dụng hệ thống chọn lọc bằng mannose) và gen gus và đƣợc
chuyển nạp các khúc cắt trụ hạ diệp của cây mầm in vitro 5 - 7 ngày tuổi qua trung
gian vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Sau khi đƣợc chuyển nạp, mẫu cây đƣợc
nuôi cấy trên môi trƣờng tạo mô sẹo có chứa mannose qua 3 vòng thanh lọc. Kết quả
đƣợc ghi nhận nhƣ sau:
Các mô sẹo của hai giống bông phát triển bình thƣờng qua hai vòng thanh lọc
trong môi trƣờng có chứa mannose. Ở vòng thanh lọc thứ 3, hiệu quả chọn lọc bằng
mannose biểu hiện rõ. Ở mẫu đối chứng không chuyển nạp gen, tỷ lệ chết là 100% ở
cả 2 giống; ở mẫu chuyển nạp gen, tỷ lệ sống sót là 1,73% ở giống Coker 312 và
3,67% ở giống SSR60F.
Việc tách nhỏ các khối mô sẹo trƣớc khi cho thanh lọc lần 3 là rất cần thiết để
tránh tình trạng thoát (escape) trong thanh lọc và việc chọn mẫu sống sót do chuyển
nạp gen thành công đƣợc chính xác.
Cần tiếp tục nghiên cứu để chuẩn hoá nồng độ mannose ở các lần thanh lọc,
kích thƣớc mô sẹo, v.v. để nâng cao hiệu quả chọn lọc bằng mannose ờ bông vải. Chú
ý giống bông vải SSR60F để sử dụng trong chƣơng trình tạo giống bông biến đổi gen
ở Việt Nam.
5
ABSRACT

PHAM QUYET THANG, Nong Lam University. August 2005.
“STUDY ON THE ABILITY OF GENE TRANSFORMATION OF TWO COTTON
CULTIVARS SSR60F AND COKER 312 BY USING AGROBACTERIUM
TUMEFACIENS ”

Supervisor: Dr. Tran Thi Cuc Hoa

Study on gene transformation of cotton in order to tranfer of desirable traits like
pest resistance, herbicide reistance, improved fiber quality …is necessary for the
cotton industry of our country at present. The application of mannose selection and

Agrobacterium tumefaciens- mediated transformation method are still new in Vietnam.
The application of mannose selection system has an advantage because it does not
cause concerns on biosafety as the selection systems using antibiotics.
The assignment “Study on the ability of gene transformation of two cotton
cultivars SSR60F and Coker 312 by using Agrobacterium tumefaciens” were carried
out to investigate the reponse ability of two cotton cultivars SSR60F and Coker 312 to
gene transformation, in which the study was focused on the use of mannose to screen
calli of cotton after transformed.
In this study, the vector pManCa was constructed carryring the selective marker
gene pmi (to facilate selection with mannose) and gene gus. The hypocotyl segments
of 5 - 7 old seedlings in vitro of the two cotton cultivars were transformed by using
Agrobacterium tumefaciens. After transformed the explants were cultured on the
medium containing mannose passing three cycles of selection. The results were
recorded as follows.
During the 1
st
and 2
nd
cycle selection with manose, calli of both cotton cultivars
grew normally. At the 3
rd
cycle of selection, the effect of mannose appeared obviously.
It was recorded that all the non-transformed calli died, while with the transformed
calli, the surivial percentage were 1.73% for the cultivar Coker and 3.67% for the
cultivar SSR60F.
The separation of calli into smaller pieces before culturing on the medium at the
3
rd
cycle of selection was necessary to prevent escape of non-transformed calli and to
make the selection of putative transformed calli more precise.

Further studies are needed to standardize the concentrations of mannose at each
cycle of selection, the size of calli, etc. to improve the efficiency of mannose selection
for cotton. Attention should be given to the cultivar SSR60F to be used in the breeding
program to develop transgenic cotton cultivars in Vietnam.


6
MỤC LỤC

CHƢƠNG TRANG
Trang tựa
Lời cảm tạ .......................................................................................................... iii
Tóm tắt ............................................................................................................... iv
Mục lục .............................................................................................................. vi
Danh sách các chữ viết tắt ............................................................................... viii
Danh sách các hình ............................................................................................ ix
Danh sách các bảng .............................................................................................x
1. LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề ..................................................................................................1
1.2. Mục tiêu .....................................................................................................3
1.3. Hạn chế của khoá luận ...............................................................................3
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..............................................................................4
2.1. Cây bông vải ..............................................................................................4
2.1.1. Vị trí và phân loại ..............................................................................4
2.1.2. Tính đa dạng, nguồn gốc và phân bố ................................................4
2.1.2.1. Gossypium hirsutum ....................................................................4
2.1.2.2. Gossypium arboreum ..................................................................5
2.1.2.3. Gosypium barbadense .................................................................5
2.1.3. Tình hình sản xuất bông ở Việt Nam ...............................................6
2.1.4. Tình hình sản xuất bông trên thế giới ...............................................7

2.2. Một số nghiên cứu chuyển nạp gen ở bông vải .......................................10
2.2.1. Hạn chế của phƣơng pháp tạo giống truyền thống..........................10
2.2.2. Một số nghiên cứu chuyển nạp gen trên cây bông vải ....................10
2.3. Chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ..................12
2.3.1. Đặc điểm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens .............................13
2.3.2. Plamid Ti .........................................................................................14
2.3.2.1. Chức năng của T-DNA ..............................................................15
2.3.2.2. Chức năng của gen Vir .............................................................17
2.3.2.3. Cơ chế lây nhiễm .......................................................................19
7
3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ..............................................................22
3.1. Vật liệu ..................................................................................................22
3.2. Địa điểm và thời gian thực hiện ............................................................22
3.3. Phƣơng Pháp .........................................................................................22
3.3.1. Quy trình chuyển nạp gen ...............................................................22
3.3.1.1. Chuẩn bị vật liệu nuôi cấy ........................................................22
3.3.1.2. Nguồn Plasmid ..........................................................................23
3.3.1.3. Chuẩn bị vi khuẩn ......................................................................24
3.3.1.4. Đồng nuôi cấy ...........................................................................24
3.3.1.5. Thanh lọc và tái sinh cây ...........................................................25
3.3.2. Các chỉ tiêu theo dõi ........................................................................26
3.3.2.1. Tỷ lệ hình thành mô sẹo ............................................................26
3.3.2.2. Kết quả thanh lọc .......................................................................26
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .....................................................................28
4.1. Sự hình thành mô sẹo ............................................................................28
4.1.1. Đặc điểm hình thái mô sẹo ..............................................................28
4.1.2. Tỷ lệ hình thành mô sẹo ..................................................................31
4.2 Kết quả thanh lọc ..................................................................................34
4.2.1. Thanh lọc lần 1 ................................................................................34
4.2.2. Thanh lọc lần 2 ................................................................................36

4.2.3. Thanh lọc lần 3 ................................................................................38
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .........................................................................43
5.1. Kết luận .................................................................................................43
5.2. Đề nghị ..................................................................................................43
6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................44
PHỤ LỤC
8
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AMP Adenosine 5’- monophosphate
ATP Adenosine 5’- triphosphate
AS Acetosyringone
CaMV35S Vùng khởi động phiên mã
ctv. cộng tác viên
DNA Deoxyribonucleotic acid
gus gen gus (gen chỉ thị)
GUS enzyme β-glucuronidase
lacZ gen β-galactosidase
LB Bờ trái (Left border)
MLN mẫu lây nhiễm
MS Murashige and Skoog (1962)
MSCo Môi trƣờng đồng nuôi cấy
MSS1, MSS2, MSS3 Môi trƣờng thanh lọc lần 1, 2, 3
OD
600
Độ hấp thụ tối đa ở bƣớc sóng 600 nm
ori Vùng khởi động sự tự tái bản
PEG polyethylene glycol
PMI Enzyme Phosphomannose isomerase
pmi gen pmi

plasmid Ti Plasmid kích thích tạo khối u (pTi)
RB Bờ phải (Right border)
rpm vòng/phút (round per minute)
T-DNA DNA đƣợc chuyển (transferred DNA)
YEP Yeast extract pepton
Vir gen vir
Vir virulence protein
2,4-D 2,4-dichlorophenoxy acetic acid
v/v thể tích/thể tích (volume/volume)
w/v trọng lƣợng/thể tích (weight/volume)
9
DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình Trang
Hình 2.1. Một số khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo ra .........13

Hình 2.2. Một khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo ra ..............14

Hình 2.3. Quá trình tạo phức hợp sợi đơn T-DNA............................................19
Hình 2.4. Quá trình hoà hợp T-DNA vào bộ gen của tế bào cây ......................20
Hình 2.5. Mô hình chuyển nạp T-DNA từ tế bào vi khuẩn vào tế bào cây .......21
Hình 3.1. Cây mầm trên môi trƣờng nảy mầm ..................................................23
Hình 3.2. Sơ đồ vectơ pManCa mang gen pmi .................................................24
Hình 4.1. Các khúc trụ hạ diệp trên môi trƣờng đồng MSCo ...........................28
Hình 4.2. Mô sẹo giống Coker 312 sau 7 ngày trên môi trƣờng MSRe ............29
Hình 4.3. Mô sẹo mẫu lây nhiễm 2 tuần trên môi trƣờng MSS1 ......................29
Hình 4.4. Mô sẹo giống Coker 312 sau 2 tuần trên môi trƣờng MSS2 .............30
Hình 4.5. Mô sẹo giống Coker 312 sau 2 tuần trên môi trƣờng MSS3 .............31
Hình 4.6. Mô sẹo trên môi trƣờng MSRe ..........................................................33
Hình 4.7. Mô sẹo giống Coker 312 sau 14 ngày trên môi trƣờng MSS1 ..........36

Hình 4.8. Các khối mô sẹo giống Coker 312 trên môi trƣờng thanh lọc ..........38
Hình 4.9. Mô sẹo giống Coker 312 trên môi trƣờng MSS3 ..............................39
Hình 4.10. Mô sẹo giống Coker 312 sau 28 ngày trên môi trƣờng MSS3 ........40
Hình 4.11. Mô sẹo giống Coker 312 (tách nhỏ) trên môi trƣờng MSS3 ...........41







10
DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng Trang
Bảng 2.1. Diễn biến tình hình sản xuất bông ở Việt Nam ..................................7
Bảng 2.2. Mƣời nƣớc có diện tích trồng bông lớn nhất thế giới .........................8
Bảng 2.3. Mƣời nƣớc có sản lƣợng bông cao nhất thế giới ................................9
Bảng 3.1. Nồng độ mannose và glucose qua ba lần thanh lọc ..........................25
Bảng 3.2. Tóm tắt quy trình chuyển nạp gen vào cây bông vải ........................27
Bảng 4.1. Tỷ lệ hình thành mô sẹo của giống Coker 312 ................................32
Bảng 4.2. Tỷ lệ hình thành mô sẹo của giống SSR60F .....................................32
Bảng 4.3. Kết quả thanh lọc lần 1 giống Coker 312 .........................................35
Bảng 4.4. Kết quả thanh lọc lần 1 giống SSR60F .............................................35
Bảng 4.5. Kết quả thanh lọc lần 2 giống Coker 312 .........................................36
Bảng 4.6. Kết quả thanh lọc lần 2 các mẫu lây nhiễm giống SSR60F ..............37
Bảng 4.7. Kết quả thanh lọc lần 3 giống Coker 312 .........................................41
Bảng 4.8. Kết quả thanh lọc lần 3 giống SSR60F .............................................41
11
CHƢƠNG 1
LỜI MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Bông vải là cây trồng lấy sợi quan trọng hàng đầu để thỏa mãn nhu cầu bức
thiết của con ngƣời sau ăn là mặc (Lê Quang Quyến, 2004). Cây bông cũng là cây lấy
dầu từ hạt quan trọng thứ hai sau cây đậu tƣơng, hơn nữa hạt bông còn là nguồn cung
cấp protein làm thức ăn cho gia súc (Jiang, 2004). Cây bông vải đƣợc trồng ở khắp nơi
trên thế giới, nhƣng chủ yếu trồng ở điều kiện nhiệt đới và cận nhiệt đới. Trong các
nƣớc trồng bông vải, Ấn Độ là nƣớc có diện tích trồng bông lớn nhất (9,7 triệu ha)
chiếm 32%, kế đến là Mỹ 24%, Trung Quốc 20% (Satyavathi và ctv., 2002).
Ở Việt Nam, nghề trồng bông vải có từ lâu đời. Cây bông vải từng là cây trồng
quan trọng ở vùng Duyên Hải Nam Trung Bộ đặc biệt ở các tỉnh Quảng Trị, Thừa
Thiên Huế, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên trong thời kỳ kháng chiến
chống Pháp (Lê Kim Hỷ, 2003). Sau ngày thống nhất đất nƣớc, chúng ta đã nhiều lần
cố gắng tổ chức trồng bông lại ở các địa phƣơng trên nhƣng các kế hoạch đó đều
không thành công. Hai nguyên nhân chính làm thất bại các nỗ lực trên là: thị trƣờng
giá cả bấp bênh, nông dân không trồng bông vì không trừ đƣợc sâu đục quả bông dẫn
đến ngƣời trồng bông thua lỗ (Lê Quang Quyến, 2004).
Trong những năm gần đây, do áp dụng những tiến bộ khoa học kỹ thuật và công
nghệ nên đã cho ra đời các giống bông lai kháng sâu năng suất cao đƣa vào sản xuất.
Tuy nhiên, sản lƣợng bông xơ chỉ mới đáp ứng một phần nhỏ (10-15%) nhu cầu vật
liệu cho ngành dệt may. Trƣớc thực trạng đó, gia tăng sản lƣợng bông xơ là yêu cầu
cấp thiết. Dự kiến đến năm 2010, sản lƣợng bông xơ đáp ứng 20% nhu cầu trong nƣớc
và diện tích bông đạt 1 triệu ha vào năm 2010, tập trung chủ yếu ở vùng Duyên Hải
Miền Trung, Tây Nguyên, Đông Nam Bộ, Đồng Bằng Sông Cửu Long (Bộ Nông
Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, 2003).
Việc cải thiện di truyền của các loài bông vải nhằm tăng năng suất cũng nhƣ
tăng tính kháng sâu bệnh đã đƣợc quan tâm nhiều. Kết quả là nhiều giống bông vải tốt
đƣợc tạo ra theo các phƣơng pháp lai tạo và chọn lọc truyền thống. Tuy nhiên, việc sử
dụng các phƣơng pháp này khó có thể khai thác đƣợc các nguồn gen có lợi một cách
12

có hiệu quả do rào cản bất tƣơng hợp. Công nghệ sinh học nói chung và công nghệ gen
trên thực vật nói riêng có thể thúc đẩy việc tạo ra các giống bông có nhiều đặc tính ƣu
việt nhƣ: kháng sâu bệnh hại, kháng thuốc diệt cỏ, chống chịu với các điều kiện bất lợi
của môi trƣờng (rét, khô, hạn, phèn, mặn…) và các tính trạng số lƣợng cũng nhƣ chất
lƣợng của bông và sợi (Perlak và ctv., 2001). Tuy nhiên, việc chuyển nạp gen vào cây
bông vải đã gặp phải nhiều khó khăn. Cây bông vải đƣợc xem là cây rất khó chuyển
nạp gen với hiệu quả cao. Hơn nữa, ở Việt Nam các phƣơng pháp nuôi cấy mô hiện tại
dùng để tái sinh cây chuyển gen từ các mô sẹo hoặc từ tế bào có khả năng sinh phôi
chƣa đƣợc xây dựng hoàn chỉnh. Ngoài giới hạn về kiểu gen, một số cây tái sinh từ mô
sẹo có khả năng sinh phôi sẽ có hình dạng dị thƣờng do biến dị soma phát triển trong
quá trình nuôi cấy mô. Hiện nay, việc chuyển nạp gen mới chỉ thành công trên các
giống nhóm Coker, hầu hết các gen mong muốn đều đƣợc chuyển vào các giống Coker
và sau đó đem hồi giao với các giống khác (Nobre và ctv., 2001).
Hiện nay ở Việt Nam, các hệ thống tái sinh cây bông vải qua mô sẹo chƣa thành
công nhiều, việc chuyển nạp gen chỉ đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp vi tiêm vào
ống phấn và chuyển trực tiếp trên đỉnh chồi (Lê Trần Bình, 2001). Tuy nhiên, các
phƣơng pháp chuyển gen này tuy có hiệu quả nhƣng sự biểu hiện của các gen chuyển
nạp trên cây chuyển gen giả định là không đƣợc hoàn toàn, tạo ra các cây thể khảm,
gây khó khăn cho việc phân tích và thu nhận cây chuyển gen sau này. Hơn nữa, ở Việt
Nam hiện nay chƣa có nghiên cứu nào xác định loài bông vải nào đang đƣợc trồng
thích hợp việc chuyển nạp gen. Chính vì thế chúng tôi thực hiện khóa luận: NGHIÊN
CỨU KHẢ NĂNG CHUYỂN NẠP GEN CỦA HAI GIỐNG BÔNG VẢI SSR60F
VÀ COKER 312 BẰNG VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS.

13
1.2. Mục tiêu
Khóa luận: “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHUYỂN NẠP GEN CỦA HAI
GIỐNG BÔNG VẢI SSR60F VÀ COKER 312 BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium
Tumefaciens” nhằm tìm hiểu khả năng chuyển nạp gen của hai giống bông vải
SSR60F và Coker 312 bằng phƣơng pháp vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens,

trong đó tập trung nghiên cứu về sử dụng hệ thống chọn lọc bằng mannose để thanh
lọc mô sẹo của bông vải sau khi đƣợc chuyển nạp.

1.3. Hạn chế của khoá luận
Với quỹ thời gian ngắn (4 tháng) nên khóa luận chỉ có thể thực hiện phần chọn
lọc bằng mannose (qua 3 lần chọn lọc), các bƣớc tiếp theo sau khi chọn lọc chƣa có
điều kiện thực hiện.
Khóa luận cũng chỉ giới hạn nghiên cứu ở hai giống bông vải, trong đó giống
SSR60F là giống bông đang trồng ở Việt Nam.
















14
CHƢƠNG 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Cây bông vải

2.1.1. Vị trí phân loại
Cây bông vải thuộc: Ngành hiển hoa bí tử (Angospermatophyta), Lớp song tử
diệp (Dicotyledoneae), Họ Malvaceae, Chi Gossypium (Phạm Hoàng Hộ, 1997).

2.1.2. Tính đa dạng, nguồn gốc và phân bố
Trong chi Gossypium có khoảng 39 loài và rất đa dạng, trong đó có sáu loài
bông đƣợc canh tác là: G. hirsutum, G. arboreum, G. barbadense, G. herbaceum, G.
tricuspidatum và G. perriri (Bộ GD và ĐT,Trƣờng ĐH Nông Nghiệp I Hà Nội,bộ môn
Cây Công Nghiệp, 1996). Nhƣng theo Jiang (2004), Brubaker và ctv. (2002) chi
Gossypium có khoảng 50 loài và có bốn loài đƣợc canh tác là: G. hirsutum L., G.
barbadense L., G. arboretum L., G. herbaceum L., loài trồng phổ biến nhất thế giới là
G. hirsutum. Cũng theo Brubaker và ctv. (2002) chi Gossypium phân bố ở phía Tây và
Nam Mexico khoảng 18 loài, ở Đông Bắc châu Phi và Arập khoảng 14 loài, và ở
Australia khoảng 17 loài. Trong sáu loài trên, ở Việt Nam trồng phổ biến ba loài đầu.

2.1.2.1. Gossypium hirsutum
Loài G. hirsutum thƣờng đƣợc gọi là bông Luồi hay bông Tàu, có bộ nhiễm sắc
thể 2n = 52 (Jiang, 2004). Bông Luồi có nguồn gốc từ Trung Mỹ, nay đƣợc trồng lan
rộng ra khắp nơi trên thế giới, sản lƣợng xơ bông Luồi chiếm khoảng 70% sản lƣợng
toàn thế giới (Bộ GD và ĐT,Trƣờng ĐH Nông Nghiệp I Hà Nội, bộ môn Cây Công
Nghiệp, 1996). Bông Luồi đƣợc trồng nhiều nhất là ở Mỹ trên 95% (Jiang, 2004), Nga,
Ấn Độ, Mehico, Trung Quốc, Braxin, Achentina, Nam Phi và châu Úc.
Ở Việt Nam, bông Luồi du nhập vào nƣớc ta khoảng cuối thế kỷ XIX đầu thế
kỷ XX. Phần lớn các giống thuộc loài này do ngƣời Pháp đƣa vào nhằm mục đích khai
thác và sản xuất bông hàng hóa. Về sau, loài này đƣợc du nhập vào bằng nhiều con
đƣờng khác nhau, chủ yếu thông qua các chƣơng trình viện trợ của các tổ chức quốc
tế. Qua quá trình thực nghiệm cho thấy loài này có khả năng thích ứng rộng, phù hợp
15
với điều kiện trồng bông nhờ nƣớc trời ở nƣớc ta. Với tiềm năng cho năng suất cao và
có chất lƣợng xơ tốt, các giống bông này dần dần thay thế các giống bông Cỏ trƣớc đó

(Lê Quang Quyến, 2004). Bông Luồi có nhiều loài phụ nhƣ: G. hirsutum ssp.
Mexicanum, G. hirsutum ssp. Punctatum (Achum và Thonn), G. hirsutum ssp.
Panicultum (Balanco)…

2.1.2.2. Gossypium arboreum
Loài G. arboreum thƣờng đƣợc gọi là bông Cỏ. Loài này có lẽ đƣợc trồng lâu
đời nhất, có nguồn gốc từ Tây Nam Ấn Độ, lan truyền sang vùng Đông Nam Á, vùng
có gió mùa khí hậu ẩm ƣớt. Bông Cỏ thƣờng đƣợc trồng ở vùng đồng bằng nhƣng
cũng có trồng ở vùng núi cao 1500-2000 m. Vùng sản suất chính là Ấn Độ, Trung
Quốc,Việt Nam, Myanmar, Lào. Hằng năm sản lƣợng bông Cỏ chiếm 20% tổng sản
lƣợng bông thế giới. Hiện nay, diện tích trồng bông Cỏ ngày càng thu hẹp do chất
lƣợng xơ ngắn.
Ở Việt Nam khoảng thế kỷ XIII- XIV loài bông này đƣợc trồng phổ biến khắp
mọi miền đất nƣớc, từ đồng bằng đến vùng Trung du và Miền núi. Đến năm 1955, loài
bông Cỏ vẫn còn phổ biến trên các vùng trồng bông ở Bắc Bộ và một số vùng thuộc
Bắc Trung Bộ, trong lúc đó ở các vùng bông ở Nam và Trung Bộ đang dần thay thế
bằng các giống bông Luồi.
Các giống bông Cỏ hiện có ở Việt Nam thuộc hai loài phụ: G. arboreum ssp.
Neglectum và G. arboreum ssp. Nanking, kể cả hai dạng bông lâu năm và hằng năm
(Lê Quang Quyến, 2004).

2.1.2.3. Gossypium barbadense
Loài G. barbadense thƣờng đƣợc gọi là bông Hải đảo, bông Ấn Độ. Bông Hải
đảo có nguồn gốc từ Nam Mỹ, nay đƣợc trồng nhiều ở Nga, Mỹ, Ai Cập và một số
nƣớc khác. Bông hải đảo cung cấp khoảng 10% sản lƣợng bông sơ toàn thế giới và
hiện nay diện tích trồng bông Hải đảo đang đƣợc mở rộng do phẩm chất xơ đặc biệt
tốt.
Ở Việt Nam, chƣa tìm thấy tài liệu nào nói về loài bông Hải đảo đƣợc trồng phổ
biến trong sản xuất và bắt nguồn từ đâu. Loài này thƣờng gặp dƣới dạng cây lâu năm ở
trong các vƣờn hoang và bờ giậu. Đến năm 1941- 1945 mới du nhập một số giống nhƣ

16
Ghiza, Pima vào miền Nam, các giống Trƣờng Nhung, Menufi, Tiến Vọt vào miền
Bắc năm 1955-1956 qua chƣơng trình hợp tác và trao đổi giống. Qua quá trình nghiên
cứu và thử nghiệm cho thấy loài bông Hải đảo thích hợp trong vụ khô có tƣới, không
hợp với điều kiện mƣa nhiều độ ẩm cao.
Bông Hải đảo có nhiều loài phụ nhƣ: G. barbadense ssp. Darwwinii (Watt)
Mauner, G. barbadense ssp. redurale Mauner, G. barbadense ssp. Ventifolum (Lam)
và G. barbadense ssp. Eubarbadense Mauner.

2.1.3. Tình hình sản xuất bông ở Việt Nam
Trƣớc thời Pháp thuộc, giống bông đƣợc sử dụng chủ yếu là các giống bông Cỏ
địa phƣơng (Gossypium arboreum L.). Giống bông này cho năng suất thấp. Một số ít
diện tích ở Trung Bộ và Nam Bộ đã đƣợc trồng các giống bông Luồi (Gossypium
hirsutumL.) nhập nội, với năng suất đạt 300 – 500 kg/ha. Đầu thế kỷ 20, nƣớc ta đã
xuất khẩu bông sang Nhật, Hồng Kông. Trong thời kỳ kháng chiến chống Pháp, diện
tích trồng bông đã đƣợc phát triển mạnh trong đó liên khu V đạt khoảng 10.000 ha và
liên khu IV đạt khoảng 13.000 ha.
Sau năm 1954, các giống bông Luồi nhập nội đã thay thế một phần cho các
giống bông Cỏ địa phƣơng. Sau năm 1975, năng suất bông hạt thấp chỉ đạt 3 – 4 tạ/ha.
Nguyên nhân năng suất và diện tích bông giảm ở giai đoạn này là do sâu bệnh phá
hoại nặng và chƣa có các giống bông thích hợp cho các vùng. Do chí phí sản xuất quá
lớn vì đầu tƣ thuốc trừ sâu rất cao, ngƣời trồng bông luôn bị thua lỗ, thêm vào đó môi
trƣờng bị ô nhiễm nặng, ngành bông Việt Nam gặp rất nhiều khó khăn.
Từ sau những năm 1990, ngành bông Việt Nam có những bƣớc thay đổi mạnh
mẽ, chúng ta đã tạo đƣợc các giống bông, đặc biệt là các giống bông lai có năng suất
cao, chất lƣợng xơ tốt, chống chịu đƣợc sâu bệnh. Hàng loạt các tiến bộ kỹ thuật đƣợc
áp dụng nhƣ: áp dụng biện pháp quản lý dịch hại tổng hợp giúp giảm chi phí thuốc bảo
vệ thực vật, các biện pháp kỹ thuật canh tác khác nhƣ hệ thống luân canh xen canh hợp
lý, phủ màng PE cho bông, phun các chất điều hòa tăng trƣởng…chính vì vậy mà năng
suất và chất lƣợng bông xơ tăng, nghề sản xuất bông cho hiệu quả kinh tế cao. Hiện

nay, diện tích đã đạt hơn 35.000 ha, năng suất đạt hơn 11 tạ/ha, tăng gấp hai lần so với
bình quân trƣớc đây.
17
Bảng 2.1. Diễn biến tình hình sản xuất bông ở Việt Nam (Lê Quang Quyến, 2004).
Niên Vụ

Diện tích (ha) Năng suất (tạ/ha) Sản lƣợng (tấn)
1996/1997
1997/1998
1998/1999
1999/2000
2000/2001
2001/2002
2002/2003
10.676
11.716
19.963
17.705
13.250
29.573
35.200
6,0
9,0
8,0
10,0
9,0
11,0
10,5
6.866
10.986

16.245
17.578
20.340
32.530
36.960

2.1.4. Tình hình sản xuất bông trên thế giới
Vụ bông 2001- 2002, tổng diện tích bông trên thế giới là 33,5 triệu ha, trong đó
các nƣớc đang phát triển chiếm 70% diện tích và các nƣớc phát triển chỉ chiếm có 30%
diện tích. Mƣời nƣớc có diện tích trồng bông lớn nhất thế giới đƣợc liệt kê ở bảng 2.2,
trong đó Ấn Độ dẫn đầu với diện tích là 8,7 triệu ha, tiếp theo là Mỹ 5,6 triệu ha,
Trung Quốc 4,8 triệu ha và Pakistan 3,1 triệu ha. Điều đáng chú ý là 70% diện tích
bông thế giới đƣợc trồng ở các nƣớc miền nam và diện tích trồng của ba nƣớc châu Á
là Ấn Độ , Trung Quốc, Pakistan đã chiếm khoảng 50% diện tích trồng bông thế giới
(ISAAA, 2002).
18
Bảng 2.2. Mƣời nƣớc có diện tích trồng bông lớn nhất thế giới năm 2001- 2002
( ISAAA, 2002)
STT


Nƣớc Diện tích (triệu ha)
1
2
3
4
5
6
7
8

9
10
Ấn Đ ộ
M ỹ
Trung Quốc
Pakistan
Uzbekistan
Brazil
Thổ Nhĩ Kỳ
Turkmenistan
Mali
Benin
8,730
5,596
4,824
3,125
1,453
0,75
0,654
0,550
0,516
0,415

Sản lƣợng bông thế giới đã tăng từ 9,8 triệu tấn niên vụ 1960-1961 lên 21,1
triệu tấn niên vụ 2001-2002, tức là tăng hơn 116% sau 40 năm. Danh sách mƣời nƣớc
có sản lƣợng bông xơ lớn nhất thế giới đƣợc liệt kê ở bảng 2.3, trong đó Trung Quốc
dẫn đầu với 5,3 triệu tấn, tiếp theo là Mỹ 4,4 triệu tấn, Ấn Độ 2,5 triệu tấn. Điều đặc
biệt là trong mƣời nƣớc có sản lƣợng bông cao nhất thế giới thì có sáu nƣớc là các
nƣớc đang phát triển. Về năng suất Australia dẫn đầu với năng suất là 1.658 kg bông
xơ/ ha, tiếp theo là Syria 1.303 kg bông xơ/ha và Trung Quốc 1.103 kg bông xơ/ha

(ISAAA, 2002).
19
Bảng 2.3. Mƣời nƣớc có sản lƣợng bông cao nhất thế giới năm 2001 – 2002
(ISAAA, 2002)
STT

Nƣớc Sản lƣợng (triệu tấn) Năng suất xơ
(kg/ha)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Trung Quốc
M ỹ
Ấn Độ
Pakistan
Uzbekistan
Thổ Nhĩ Kỳ
Brazil
Australia
Syria
Ai cập
5,320
4,420

2,508
1,853
1,055
0,880
0,750
0,670
0,335
0,314
1.103
790
287
593
726
1.345
999
1.658
1.303
994

Trong khi đó, diện tích trồng bông chuyển gen trên thế giới ngày càng gia tăng.
Diện tích trồng bông trên thế giới năm 2004 là 32 triệu ha (ISAAA, 2004), trong đó
bông chuyển gen chiếm 28% (9 triệu ha). So với năm 2003 diện tích bông chuyển gen
tăng 11% (9 triệu ha trong năm 2004 so với 7,2 triệu ha trong năm 2003). Trong số các
nƣớc trồng bông chuyển gen, Ấn Độ là nƣớc có diện tích trồng bông chuyển gen tăng
nhanh nhất thế giới (tăng 400% so với năm 2003). Năm 2003, Ấn Độ chỉ có 100 ngàn
ha bông chuyển gen nhƣng năm 2004 diện tích bông chuyển gen tăng lên 500 ngàn ha.
Trung Quốc cũng là nƣớc có sự gia tăng diện tích trồng bông chuyển gen đáng chú ý:
năm 2003 có 2,8 triệu ha nhƣng năm 2004 đã tăng lên 3,7 triệu ha (chiếm 60% diện
tích bông). Theo dự báo của các chuyên gia diện tích trồng bông chuyển gen trên thế
giới sẽ tiếp tục gia tăng trong những năm tới và hƣớng chuyển gen vào cây bông sẽ tập

trung vào việc tạo ra các giống bông kháng sâu bệnh là chủ yếu nhƣng bên cạnh đó
chất lƣợng sợi bông cũng đƣợc quan tâm nhiều (ISAAA, 2004).

20
2.2. Một số nghiên cứu chuyển nạp gen ở bông vải
2.2.1. Những hạn chế của phƣơng pháp tạo giống truyền thống
Cây bông đóng một vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp dệt may thế
giới. Chính vì vậy mà việc cải thiện giống bông để nâng cao năng suất cũng nhƣ chất
lƣợng sợi bông thì rất đƣợc chú ý. Các phƣơng pháp tạo giống truyền thống nhƣ: lai
đơn, lai với loài hoang dại, hồi giao, đột biến... đã đƣợc sử dụng để đƣa các tính trạng
nhƣ: năng suất cao, chất lƣợng sợi cao và kháng bệnh vào các giống bông. Kết quả là
tạo ra những giống bông có năng suất cao và phẩm chất sợi tốt. Tuy nhiên, các phƣơng
pháp tạo giống truyền thống đã không đáp ứng đƣợc yêu cầu ngày càng cao về chất
lƣợng sợi bông, về sản lƣợng bông cũng nhƣ về khả năng kháng sâu bệnh. Thêm vào
đó, hiện nay trong các giống bông chƣa tìm thấy các gen kháng sâu bệnh chính vì thế
mà rất khó tạo ra một giống bông kháng sâu bệnh bằng phƣơng pháp lai tạo truyền
thống.

2.2.2. Một số nghiên cứu chuyển nạp gen trên cây bông vải
Hiện nay, trong nghiên cứu chuyển nạp gen với nhiều phƣơng pháp khác nhau
nhƣ: phƣơng pháp xung điện, phƣơng pháp vi tiêm, phƣơng pháp sử dụng PEG
(polyethylene glycol), phƣơng pháp bắn gen và phƣơng pháp chuyển nạp gen bằng vi
khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Nhƣng phổ biến là chuyển nạp gen trực tiếp bằng
súng bắn gen với vật liệu nuôi cấy là đỉnh chồi phân sinh hoặc từ tế bào huyền phù đã
đƣợc báo cáo (McCabe và Martinell, 1993, Rajasekaran và ctv., 2000), phƣơng pháp
chuyển nạp gen bằng Agrobacterium tumefaciens (Rajasekaran, 1996, Satyawathi và
ctv., 2002, Umbeck và ctv., 1987).
Nghiên cứu chuyển nạp gen thành công bằng Agrobacterium tumefaciens trên
cây bông vải đƣợc công bố lần đầu tiên vào những năm 1980 (Firoozabady và ctv.,
1987, Umbeck và ctv., 1987) với mẫu cấy là trụ hạ diệp và tử diệp. Trong nghiên cứu

của mình, Firoozabady đã sử dụng mẫu cấy tử diệp 12 ngày tuổi để đồng nuôi cấy với
vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang plasmid có chứa gen kháng kanamycin.
Sau ba ngày đồng nuôi cấy, các mẫu cấy sẽ đƣợc chuyển lên môi trƣờng tạo mô sẹo có
chứa kanamycin. Kết quả là có hơn 80% các mô sẹo sống sót trên môi trƣờng có chứa
yếu tố chọn lọc kanamycin. Từ đó nhiều gen đƣợc chuyển thành công vào cây bông
nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, bao gồm các gen kháng côn trùng, gen
21
kháng thuốc diệt cỏ (Chen và ctv., 1994; Perlak và ctv., 1990). Các loại mẫu cấy nhƣ
trụ hạ diệp, tử diệp, mô sẹo từ trụ hạ diệp và tử diệp cũng nhƣ phôi non đã đƣợc dùng
trong việc chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens hay nhờ súng bắn gen
(Firoozabady và ctv., 1987, Perlak và ctv., 1990). Gould và Cedeno (1998) đã sử dụng
đỉnh chồi làm mẫu cấy phục vụ cho việc chuyển nạp gen thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens. Ngoài ra còn có các mô phân sinh phân lập từ trục phôi
đã đƣợc sử dụng cho việc chuyển gen bằng súng bắn gen ở bông vải (Chlan và ctv.,
1995). Chuyển gen bằng súng bắn gen đã đƣợc Finer và McMullen (1990) thực hiện
trên dịch huyền phù tế bào và kết quả là thu đƣợc cây chuyển gen. Trƣớc đó Finer và
Smith (1984) đã thực hiện nghiên cứu tạo mô sẹo và phôi soma từ mẫu cấy là thân và
cuống lá. Súng bắn gen cũng đƣợc sử dụng để chuyển gen vào các mô thu đƣợc từ việc
tái sinh phôi soma (Rajasekaran, 1996, Reichert và ctv., 2002).
Tuy nhiên tỉ lệ chuyển gen thƣờng khá thấp, biến động 20 – 30% khi trụ hạ diệp
đƣợc dùng làm mẫu cấy (Firoozabady và ctv., 1987, Rajasekaran, 1996). Một hiệu quả
chuyển gen cao hơn có ý nghĩa (đến 60%) đã đƣợc công bố khi trụ hạ diệp đƣợc dùng
làm mẫu cấy và gen onc (mã hóa cho enzyme tổng hợp octopin-octopin synthase)
đƣợc dùng làm gen chỉ thị (Firoozabady và ctv., 1987). Chaudhary và ctv. (2003) cũng
báo cáo với mẫu lây nhiễm là phôi soma sau khi thanh lọc tỉ lệ mẫu biểu hiện GUS là
75%. Nhƣng chỉ là kết quả của thử nghiệm sự biểu hiện gen tạm thời của gen onc và
gen gus. Một báo cáo gần đây cho rằng hiệu quả chuyển nạp ở song tử diệp chỉ khoảng
20-30%, hiệu quả chuyển nạp gen thậm chí còn thấp hơn khi sử dụng phƣơng pháp
bắn gen. Nhiều công trình nghiên cứu đã công bố sự khác biệt giữa các loại mẫu cấy
đƣợc dùng trong chuyển nạp gen có ảnh hƣởng đến hiệu quả của chuyển nạp gen và tái

sinh cây. Ví dụ ngƣời ta cho rằng để giảm thiểu các thể chuyển nạp dƣơng tính giả, tử
diệp là mẫu cấy tốt hơn trụ hạ diệp (Firoozabady và ctv., 1987). Nghiên cứu về chuyển
nạp gen trên cây bông vải, Sunilkumar và Rathore (2001) đã nghiên cứu các yếu tố ảnh
hƣởng đến hiệu quả chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
Nghiên cứu này cho thấy các yếu tố nhƣ chủng vi khuẩn, acetosyringone và nhiệt độ
trong chuyển gen có ảnh hƣởng đáng kể đến hiệu quả chuyển gen. Thêm vào đó kích
thƣớc mẫu cấy cũng ảnh hƣởng đến sự sống sót của các mẫu cấy trên môi trƣờng chọn
lọc (Sunilkumar và Rathore, 2001). Theo Chen và ctv. (2000) để chuyển nạp gen có
hiệu quả nhiệt độ trong giai đoạn đồng nuôi cấy không lớn hơn 28
0
C, thời gian chiếu
22
sáng 16h sáng/8h tối là thích hợp cho tất cả các giai đoạn chuyển nạp gen và tái sinh.
Ngoài ra, pH môi trƣờng nuôi cấy cũng ảnh hƣởng đáng kể đến hiệu quả chuyển nạp
gen.
Sự chuyển nạp gen cũng phụ thuộc vào kiểu gen. Chỉ có một số giống nhất định
mới có khả năng tái sinh và chuyển nạp gen nhƣ bông Luồi Coker 312 và Jin 7, còn
hầu hết các giống khác thƣờng khó có thể tái sinh và chuyển nạp đƣợc. Sự thiếu một
phƣơng pháp tái sinh cây hiệu quả đã đƣợc xem nhƣ là một rào cản chính cho việc áp
dụng phƣơng pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens ở bông vải (Firoobady
và ctv., 1987). Để cải tiến phƣơng pháp chuyển nạp, một quy trình chuyển gen hiệu
quả cao dùng cuống lá và trụ hạ diệp cây mầm làm mẫu cấy phải đƣợc phát triển, cùng
với môi trƣờng cải tiến thích hợp. Hiện nay, Trung Quốc thành công trong việc chuyển
nạp gen vào cây bông vải bằng phƣơng pháp tiêm DNA qua ống phấn, nhƣng phƣơng
pháp này gặp khó khăn trong việc xác định cây chuyển gen vì rất nhiều cây đƣợc tạo
thành nhƣng chỉ một số ít cây đƣợc chuyển nạp gen (Chen và ctv., 2000).

2.3. Chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
Chuyển nạp gen là kỹ thuật chuyển gen ngoại lai vào bộ gen sinh vật đang
nghiên cứu. Những thành tựu của kỹ thuật nuôi cấy mô và kỹ thuật tái tổ hợp DNA đã

mở ra triển vọng đối với chuyển nạp gen ở thực vật bậc cao, tạo ra các cây trồng mang
những tính trạng di truyền mong muốn. Chuyển nạp gen thành công trên cây trồng đã
đƣợc ghi nhận bằng cách sử dụng vectơ plasmid Ti, thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens để đƣa gen mong muốn vào trong bộ gen cây trồng.
Phƣơng pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để chuyển nạp gen còn
đƣợc gọi là phƣơng pháp chuyển nạp gen gián tiếp (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang,
2000).

23
2.3.1. Đặc điểm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Chi Agrobacterium đƣợc chia làm một số loài dựa trên triệu chứng gây bệnh và
kí chủ. Một số loài thuộc chi Agrobacterium nhƣ: A. radiobacter (loài này không gây
bệnh cho cây), A. tumefaciens và A. rhizogens gây bệnh khối u và bệnh cổ rễ, A. rubi
gây bệnh khối u trên cây mía. Gần đây nhất một loài mới vừa đƣợc đề nghị là A. vitis,
loài này gây bệnh khối u trên cây nho và một số loài cây khác (Ophel và Kerr, 1990).

Hình 2.1. Một số khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo ra. A: một
khối u lớn trên thân cây hoa Hồng, B: các khối u trên cành Nho
(Deacon và ctv., 2005).

Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn hình que, gram âm, có khả năng di
động, không sinh bào tử và có quan hệ gần gũi với vi khuẩn cố định đạm Rhizobium.
(Deacon và ctv., 2005). Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn hiếu khí, có
5-11 lông roi. Vi khuẩn này phát triển tối ƣu ở nhiệt độ 29
0
C trong môi trƣờng có bổ
sung một chút mangan và succinate nhƣ là nguồn cacbon duy nhất. Agrobacterium
tumefaciens là tác nhân gây bệnh cho cây bằng cách tạo khối u trên cây hai lá mầm do
nó có khả năng chuyển DNA vào tế bào cây (Hansen và Chilton, 1999, Gelvin, 2000).
Khi rễ cây xuất hiện vết thƣơng, tế bào vi khuẩn sẽ di chuyển về phía vết thƣơng và

xâm nhập vào cây qua vết thƣơng đó. Vi khuẩn độc mang một hoặc nhiều plasmid,
một trong số đó có mang gen tạo khối u và đƣợc biết đến với tên gọi là pTi. Plasmid Ti
cũng mang các gen để xác định kí chủ và triệu chứng khi nhiễm vào cây. Những vi
khuẩn không mang pTi đƣợc xem nhƣ là vi khuẩn không độc và không có khả năng
gây bệnh khối u cho cây. Khối u đầu tiên xuất hiện nhỏ mầu trắng, ban đầu đƣợc tìm
thấy ở gốc cây. Các khối u lớn dần và xuất hiện các vết lốm đốm nâu đen do các tế bào
ngoại biên chết đi (hình 2.1 và 2.2). Các khối u có thể mềm và xốp, có thể bị vỡ vụn
24
khi chạm vào, nhƣng cũng có thể cứng và xuất hiện các u nhỏ hoặc nhiều mấu. Các
khối u có đƣờng kính đến 30 cm nhƣng phổ biến là 5-10 cm. Cây bị nhiễm vi khuẩn sẽ
trở nên còi cọc, lá úa vàng và rất nhạy cảm với các điều kiện môi trƣờng. Khi xâm
nhiễm vào cây, một phần gen trên pTi sẽ gắn vào nhiễm sắc thể của cây làm cho các tế
bào phát triển mạnh và sản xuất ra một chất đặc biệt gọi là Opine. Vi khuẩn sẽ sử dụng
chất này nhƣ một nguồn cacbon cho các hoạt động biến dƣỡng(Zhu và ctv., 2000).

Hình 2.2. Một khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
tạo ra (nguồn

Bộ nhiễm sắc thể vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens dạng vòng có kích thƣớc
là 2,6 Mb. Ngoài ra vi khuẩn còn mang plasmid lớn có kích thƣớc 200-800 kbp
(Gelvin, 2003), chính plamid này là nguyên nhân gây ra khối u trên cây khi vi khuẩn
này xâm nhập. Plasmid này có tên gọi là plasmid Ti , hầu hết các gen gây khối u đều
nằm trên plasmid này (Deacon và ctv., 2005).

2.3.2. Plamid Ti
Plasmid Ti là một DNA vòng tách rời với nhiễm sắc thể và có khả năng nhân
lên một cách độc lập trong tế bào vi khuẩn. Việc xác định pTi nhƣ một nguyên lý tạo
bƣớu TIP (tumor inducing principle) đã đánh dấu bƣớc khởi động của một giai đoạn
mới trong nghiên cứu về Agrobacterium tumefaciens. Điều này đã mở ra khả năng
nghiên cứu cấu trúc và chức năng của plasmid bằng kỹ thuật di truyền phân tử (Bùi

Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2000).
25
Plasmid Ti có cấu trúc bao gồm: đoạn T-DNA-trình tự mã hoá đƣợc chuyển vào
trong cây, vùng vir-vùng trực tiếp tham gia tạo T-DNA sợi đơn và chuyển T-DNA này
vào tế bào cây, vùng rep-cần cho sự tái bản của pTi, vị trí tra và trb- tham gia vào quá
trình chuyển tiếp hợp của pTi, các gen cần cho việc hấp thu và chuyển hoá các opine
(Zhu và ctv., 2000). Trong cấu trúc của pTi, hai yếu tố quan trọng cần cho sự chuyển
gen vào cây là đoạn T- DNA bao gồm cả trình tự 25 bp ở hai cánh của đoạn T- DNA
và gen Vir (Gelvin, 2003).

2.3.2.1. Chức năng của T-DNA
T-DNA đã đƣợc nghiên cứu rất kỹ. Đó là một đoạn DNA có kích thƣớc 10-30
kbp (Gelvin, 2003), trong đó có chứa gen mã hoá cho việc tổng hợp auxin, cytokinin,
opine và các gen gây khối u. Trong pTi, vị trí của T-DNA đƣợc giới hạn bởi bờ phải
và bờ trái. Trình tự nucleotid của bờ phải và bờ trái tƣơng tự nhau và đều có kích
thƣớc 25 bp (Gelvin, 2003). Tuy nhiên, bờ trái của T-DNA có thể đƣợc bỏ qua trong
chuyển nạp T-DNA, trong khi đó bờ phải lại cần thiết và đƣợc đề nghị rằng tiến trình
chuyển nạp diễn ra với bờ phải trƣớc rồi tiến dần về phía trái. Việc đảo ngƣợc bờ phải
sẽ làm yếu đi khả năng tạo khối u (Miranda và ctv., 1992, Gelvin, 2003). Các trình tự
bờ không chỉ là mục tiêu của của VirD1/VirD2 endonuclease mà còn là vị trí gắn của
protein VirD2.
T-DNA mã hóa một vài protein, protein này biểu hiện trong tế bào cây đƣợc
chuyển gen làm kiểu hình cây thay đổi lớn. Các gen trên T-DNA có thể biểu hiện
trong tế bào cây bằng cách mô phỏng các gen của cơ thể đa bào. Theo Binns và
Costantino (1998), T-DNA mã hóa cho 13 protein và những vùng không sao mã của
các gen đƣợc chuyển mang nhiều đặc điểm của các gen trong cây bao gồm kiểu hộp
TATA (TATA box) và hộp CAAT (CAAT box), yếu tố tăng cƣờng sao mã, các vị trí
gắn đuôi poly A của cơ thể đa bào. Một nhóm các gen của T-DNA điều khiển tổng
hợp các hormon sinh trƣởng của cây, những hormon này làm các tế bào tăng sinh và
làm thay đổi hình dạng bên ngoài. Sản phẩm của gen iaaM và gen iaaH điều khiển sự

chuyển hoá tryptophan thông qua indolacetamin thành indolacetic axit (auxin). Sản
phẩm của gen ipt giúp gắn kết isopentenyl pyrophosphat với AMP (Binns và
Costantino, 1998) và các enzyme trong cây đƣợc cho là chuyển hoá isopentenyl-AMP
thành cytokinin zeatin bằng cách loại bỏ nhóm phosphoribosyl và loại bỏ phân tử