Luận văn : NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHUYỂN NẠP GEN CỦA HAI GIỐNG BÔNG VẢI SSR60F VÀ COKER 312 BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens part 1 doc

1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***000***



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP




NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHUYỂN NẠP GEN CỦA HAI
GIỐNG BÔNG VẢI SSR60F VÀ COKER 312 BẰNG VI
KHUẨN Agrobacterium tumefaciens







Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khoá: 2001 – 2005
Sinh viên thực hiện: PHẠM QUYẾT THẮNG



Thành phố Hồ Chí Minh

Tháng 8/2005

2
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***000***






KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP




NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHUYỂN NẠP GEN CỦA HAI
GIỐNG BÔNG VẢI SSR60F VÀ COKER 312 BẰNG VI KHUẨN
Agrobacterium tumefaciens

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8/2005
Giáo viên hƣớng dẫn:
TS. Trần Thị Cúc Hoà

Sinh viên thực hiện:
Phạm Quyết Thắng


3
LỜI CẢM TẠ

Chân thành cảm ơn:
Ban giám hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.
Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học.
Các Thầy cô trong và ngoài Trƣờng Đại Học Nông Lâm.
Đã truyền đạt cho em những kiến thức khoa học trong thời gian em học tập tại
trƣờng.
Đặc biệt xin chân thành cảm ơn:
TS. Trần Thị Cúc Hòa- Trƣởng bộ môn Công Nghệ Sinh Học- Viện Lúa
Đồng Bằng Sông Cửu Long, TS. Trần Thị Dung- Trƣởng bộ môn Công
Nghệ Sinh Học- Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã
tận tình dạy bảo, hƣớng dẫn, giúp đỡ em trong nghiên cứu và thực hiện khóa
luận.
TS. Trần Ngọc Thạch đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo em trong suốt thời gian
em thực hiện khóa luận.

Các anh chị trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học Viện Lúa Đồng Bằng Sông
Cửu Long.
Xin cảm ơn các bạn trong và ngoài lớp đã động viên giúp đỡ trong suốt quá
trình học tập và làm khóa luận tốt nghiệp.
Con xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến bố mẹ, những ngƣời đã sinh thành, nuôi
dƣỡng, dạy dỗ con và luôn bên con trong mọi thời điểm.

Thủ Đức, ngày 15 tháng 09 năm 2005
Phạm Quyết Thắng


4
TÓM TẮT

PHẠM QUYẾT THẮNG, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005.
“NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHUYỂN NẠP GEN CỦA HAI GIỐNG BÔNG VẢI
SSR60F VÀ COKER 312 BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens”

Giảng viên hƣớng dẫn:

TS. TRẦN THỊ CÚC HÒA
Nghiên cứu chuyển nạp gen vào cây bông vải nhằm đƣa vào những đặc tính
mong muốn: kháng sâu bệnh, kháng thuốc diệt cỏ, tăng cƣờng chất lƣợng sợi… là điều
rất cần thiết đối với ngành trồng bông của nƣớc ta hiện nay. Việc ứng dụng hệ thống
thanh lọc bằng đƣờng mannose và chuyển nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens trên cây bông hiện vẫn còn mới mẻ tại Việt nam. Việc sử dụng hệ thống
thanh lọc bằng đƣờng mannose có ƣu điểm vì không tạo ra sự lo ngại về an toàn sinh
học nhƣ đối với hệ thống thanh lọc bằng chất kháng sinh.
Khóa luận “Nghiên cứu khả năng chuyển nạp gen của hai giống bông vảI
SSR60F và Coker 312 bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens” đƣợc thực hiện

nhằm mục đích nhằm tìm hiểu khả năng chuyển nạp gen của hai giống bông vải
SSR60F và Coker 312, trong đó tập trung nghiên cứu về sử dụng hệ thống chọn lọc
bằng mannose để thanh lọc mô sẹo của bông vải sau khi đƣợc chuyển nạp.
Trong nghiên cứu này, véctơ (vector) pManCa đã đƣợc thiết kế mang gen đánh
dấu chọn lọc pmi (để sử dụng hệ thống chọn lọc bằng mannose) và gen gus và đƣợc
chuyển nạp các khúc cắt trụ hạ diệp của cây mầm in vitro 5 - 7 ngày tuổi qua trung
gian vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Sau khi đƣợc chuyển nạp, mẫu cây đƣợc
nuôi cấy trên môi trƣờng tạo mô sẹo có chứa mannose qua 3 vòng thanh lọc. Kết quả
đƣợc ghi nhận nhƣ sau:
Các mô sẹo của hai giống bông phát triển bình thƣờng qua hai vòng thanh lọc
trong môi trƣờng có chứa mannose. Ở vòng thanh lọc thứ 3, hiệu quả chọn lọc bằng
mannose biểu hiện rõ. Ở mẫu đối chứng không chuyển nạp gen, tỷ lệ chết là 100% ở
cả 2 giống; ở mẫu chuyển nạp gen, tỷ lệ sống sót là 1,73% ở giống Coker 312 và
3,67% ở giống SSR60F.
Việc tách nhỏ các khối mô sẹo trƣớc khi cho thanh lọc lần 3 là rất cần thiết để
tránh tình trạng thoát (escape) trong thanh lọc và việc chọn mẫu sống sót do chuyển
nạp gen thành công đƣợc chính xác.
Cần tiếp tục nghiên cứu để chuẩn hoá nồng độ mannose ở các lần thanh lọc,
kích thƣớc mô sẹo, v.v. để nâng cao hiệu quả chọn lọc bằng mannose ờ bông vải. Chú
ý giống bông vải SSR60F để sử dụng trong chƣơng trình tạo giống bông biến đổi gen
ở Việt Nam.

5
ABSRACT

PHAM QUYET THANG, Nong Lam University. August 2005.
“STUDY ON THE ABILITY OF GENE TRANSFORMATION OF TWO COTTON
CULTIVARS SSR60F AND COKER 312 BY USING AGROBACTERIUM
TUMEFACIENS ”

Supervisor: Dr. Tran Thi Cuc Hoa

Study on gene transformation of cotton in order to tranfer of desirable traits like
pest resistance, herbicide reistance, improved fiber quality …is necessary for the
cotton industry of our country at present. The application of mannose selection and
Agrobacterium tumefaciens- mediated transformation method are still new in Vietnam.
The application of mannose selection system has an advantage because it does not
cause concerns on biosafety as the selection systems using antibiotics.
The assignment “Study on the ability of gene transformation of two cotton
cultivars SSR60F and Coker 312 by using Agrobacterium tumefaciens” were carried
out to investigate the reponse ability of two cotton cultivars SSR60F and Coker 312 to
gene transformation, in which the study was focused on the use of mannose to screen
calli of cotton after transformed.
In this study, the vector pManCa was constructed carryring the selective marker
gene pmi (to facilate selection with mannose) and gene gus. The hypocotyl segments
of 5 - 7 old seedlings in vitro of the two cotton cultivars were transformed by using
Agrobacterium tumefaciens. After transformed the explants were cultured on the
medium containing mannose passing three cycles of selection. The results were
recorded as follows.
During the 1
st
and 2
nd
cycle selection with manose, calli of both cotton cultivars
grew normally. At the 3
rd
cycle of selection, the effect of mannose appeared obviously.
It was recorded that all the non-transformed calli died, while with the transformed
calli, the surivial percentage were 1.73% for the cultivar Coker and 3.67% for the
cultivar SSR60F.

The separation of calli into smaller pieces before culturing on the medium at the
3
rd
cycle of selection was necessary to prevent escape of non-transformed calli and to
make the selection of putative transformed calli more precise.
Further studies are needed to standardize the concentrations of mannose at each
cycle of selection, the size of calli, etc. to improve the efficiency of mannose selection
for cotton. Attention should be given to the cultivar SSR60F to be used in the breeding
program to develop transgenic cotton cultivars in Vietnam.



6
MỤC LỤC

CHƢƠNG TRANG
Trang tựa
Lời cảm tạ iii
Tóm tắt iv
Mục lục vi
Danh sách các chữ viết tắt viii
Danh sách các hình ix
Danh sách các bảng x
1. LỜI MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu 3
1.3. Hạn chế của khoá luận 3
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
2.1. Cây bông vải 4
2.1.1. Vị trí và phân loại 4

2.1.2. Tính đa dạng, nguồn gốc và phân bố 4
2.1.2.1. Gossypium hirsutum 4
2.1.2.2. Gossypium arboreum 5
2.1.2.3. Gosypium barbadense 5
2.1.3. Tình hình sản xuất bông ở Việt Nam 6
2.1.4. Tình hình sản xuất bông trên thế giới 7
2.2. Một số nghiên cứu chuyển nạp gen ở bông vải 10
2.2.1. Hạn chế của phƣơng pháp tạo giống truyền thống 10
2.2.2. Một số nghiên cứu chuyển nạp gen trên cây bông vải 10
2.3. Chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 12
2.3.1. Đặc điểm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 13
2.3.2. Plamid Ti 14
2.3.2.1. Chức năng của T-DNA 15
2.3.2.2. Chức năng của gen Vir 17
2.3.2.3. Cơ chế lây nhiễm 19

7
3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 22
3.1. Vật liệu 22
3.2. Địa điểm và thời gian thực hiện 22
3.3. Phƣơng Pháp 22
3.3.1. Quy trình chuyển nạp gen 22
3.3.1.1. Chuẩn bị vật liệu nuôi cấy 22
3.3.1.2. Nguồn Plasmid 23
3.3.1.3. Chuẩn bị vi khuẩn 24
3.3.1.4. Đồng nuôi cấy 24
3.3.1.5. Thanh lọc và tái sinh cây 25
3.3.2. Các chỉ tiêu theo dõi 26
3.3.2.1. Tỷ lệ hình thành mô sẹo 26
3.3.2.2. Kết quả thanh lọc 26

4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28
4.1. Sự hình thành mô sẹo 28
4.1.1. Đặc điểm hình thái mô sẹo 28
4.1.2. Tỷ lệ hình thành mô sẹo 31
4.2 Kết quả thanh lọc 34
4.2.1. Thanh lọc lần 1 34
4.2.2. Thanh lọc lần 2 36
4.2.3. Thanh lọc lần 3 38
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 43
5.1. Kết luận 43
5.2. Đề nghị 43
6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 44
PHỤ LỤC

8
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AMP Adenosine 5’- monophosphate
ATP Adenosine 5’- triphosphate
AS Acetosyringone
CaMV35S Vùng khởi động phiên mã
ctv. cộng tác viên
DNA Deoxyribonucleotic acid
gus gen gus (gen chỉ thị)
GUS enzyme β-glucuronidase
lacZ gen β-galactosidase
LB Bờ trái (Left border)
MLN mẫu lây nhiễm
MS Murashige and Skoog (1962)
MSCo Môi trƣờng đồng nuôi cấy

MSS1, MSS2, MSS3 Môi trƣờng thanh lọc lần 1, 2, 3
OD
600
Độ hấp thụ tối đa ở bƣớc sóng 600 nm
ori Vùng khởi động sự tự tái bản
PEG polyethylene glycol
PMI Enzyme Phosphomannose isomerase
pmi gen pmi
plasmid Ti Plasmid kích thích tạo khối u (pTi)
RB Bờ phải (Right border)
rpm vòng/phút (round per minute)
T-DNA DNA đƣợc chuyển (transferred DNA)
YEP Yeast extract pepton
Vir gen vir
Vir virulence protein
2,4-D 2,4-dichlorophenoxy acetic acid
v/v thể tích/thể tích (volume/volume)
w/v trọng lƣợng/thể tích (weight/volume)

9
DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình Trang
Hình 2.1. Một số khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo ra 13

Hình 2.2. Một khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo ra 14

Hình 2.3. Quá trình tạo phức hợp sợi đơn T-DNA 19
Hình 2.4. Quá trình hoà hợp T-DNA vào bộ gen của tế bào cây 20
Hình 2.5. Mô hình chuyển nạp T-DNA từ tế bào vi khuẩn vào tế bào cây 21

Hình 3.1. Cây mầm trên môi trƣờng nảy mầm 23
Hình 3.2. Sơ đồ vectơ pManCa mang gen pmi 24
Hình 4.1. Các khúc trụ hạ diệp trên môi trƣờng đồng MSCo 28
Hình 4.2. Mô sẹo giống Coker 312 sau 7 ngày trên môi trƣờng MSRe 29
Hình 4.3. Mô sẹo mẫu lây nhiễm 2 tuần trên môi trƣờng MSS1 29
Hình 4.4. Mô sẹo giống Coker 312 sau 2 tuần trên môi trƣờng MSS2 30
Hình 4.5. Mô sẹo giống Coker 312 sau 2 tuần trên môi trƣờng MSS3 31
Hình 4.6. Mô sẹo trên môi trƣờng MSRe 33
Hình 4.7. Mô sẹo giống Coker 312 sau 14 ngày trên môi trƣờng MSS1 36
Hình 4.8. Các khối mô sẹo giống Coker 312 trên môi trƣờng thanh lọc 38
Hình 4.9. Mô sẹo giống Coker 312 trên môi trƣờng MSS3 39
Hình 4.10. Mô sẹo giống Coker 312 sau 28 ngày trên môi trƣờng MSS3 40
Hình 4.11. Mô sẹo giống Coker 312 (tách nhỏ) trên môi trƣờng MSS3 41








10
DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng Trang
Bảng 2.1. Diễn biến tình hình sản xuất bông ở Việt Nam 7
Bảng 2.2. Mƣời nƣớc có diện tích trồng bông lớn nhất thế giới 8
Bảng 2.3. Mƣời nƣớc có sản lƣợng bông cao nhất thế giới 9
Bảng 3.1. Nồng độ mannose và glucose qua ba lần thanh lọc 25
Bảng 3.2. Tóm tắt quy trình chuyển nạp gen vào cây bông vải 27
Bảng 4.1. Tỷ lệ hình thành mô sẹo của giống Coker 312 32

Bảng 4.2. Tỷ lệ hình thành mô sẹo của giống SSR60F 32
Bảng 4.3. Kết quả thanh lọc lần 1 giống Coker 312 35
Bảng 4.4. Kết quả thanh lọc lần 1 giống SSR60F 35
Bảng 4.5. Kết quả thanh lọc lần 2 giống Coker 312 36
Bảng 4.6. Kết quả thanh lọc lần 2 các mẫu lây nhiễm giống SSR60F 37
Bảng 4.7. Kết quả thanh lọc lần 3 giống Coker 312 41
Bảng 4.8. Kết quả thanh lọc lần 3 giống SSR60F 41