Luận văn : NGHIÊN CỨU HIỆN TRẠNG NHIỄM BỆNH TSWV (Tomato spotted wilt virus) TRÊN CÂY ỚT BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BẰNG KỸ THUẬT RT - PCR part 4 ppt

19

Yêu cầu chung đối với mẫu
Toàn bộ hoặc một phần của lá đều có thể đƣợc dùng làm mẫu phân tích. Nguyên
liệu đòi hỏi phải còn tƣơi, lá lớn và còn non, không sử dụng lá già. Chọn những lá có
biểu hiện bệnh để thực hiện thí nghiệm chẩn đoán bệnh TSWV. Trƣờng hợp cây có sự
phân bố không đều mầm bệnh thì phải thu thập những phần mà có biểu hiện bệnh
mạnh nhất.
(Theo Lê Lƣơng Tề - Vũ Triệu Mân, 1999).
2.11.2 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử
 Virus thực vật có những đặc điểm sinh vật sống, chúng tự nhân lên trong cây
trồng và di truyền tính gây bệnh, chúng tự phân chia thành các phân tử nhỏ
nhƣng cũng có thể tạo thành những tinh thể giống nhau chứa đựng những phân
tử protein
 Chúng ta không thể thấy virus dƣới kính hiển vi quang học, nhƣng chúng ta có
thể quan sát đƣợc chúng trên kính hiển vi điện tử với độ phóng đại 500.000 lần.
 Phƣơng pháp đơn giản là sử dụng dung dịch chứa virus chiết từ lá cây bệnh hay
thông qua làm tinh khiết cố định bằng hoá chất trên lƣới đồng để quan sát trên
kính hiển vi điện tử. Đây là phƣơng pháp trực tiếp và đơn giản nhất.
 Có thể sử dụng kháng huyết thanh khi dùng phƣơng pháp xem trực tiếp để phân
biệt trong trƣờng hợp nghi là mẫu bị lẫn virus khác. Phƣơng pháp này giúp ta
xác định đƣợc hai virus khác nhau trong cùng một mẫu.
 Ngƣời ta còn dùng lát cắt cực mỏng bằng Ultramicrotom và nhuộm mẫu đƣợc
cắt, quan sát sự hiện diện của virus trong các tế bào thực vật bị nhiễm bệnh.
(Phạm Đức Toàn, 1996 – 2001)
(Nguyễn Văn Tuất, 2002)
2.12 ELISA
2.12.1 Khái niệm về ELISA
 Nguyên tắc: dựa vào phản ứng ngƣng kết giữa kháng nguyên và kháng thể.
Cụ thể ở virút TSWV thì kháng nguyên là cấu trúc vỏ protein Nucleocapsid
(N); glycoprotein (GP) G1.

20


(Trích từ Chemicon International)
2.12.2 Phân loại ELISA
2.12.2.1 Direct ELISA (ELISA trực tiếp)












Sơ đồ 2.1: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA trực tiếp


Cho kháng nguyên vào đĩa ELISA

Đem ủ các đĩa chứa kháng nguyên

Rửa

Thêm kháng thể có gắn enzyme

Rửa

Ủ ở 37
o
C

Thêm cơ chất

Ủ ở 37
o
C

Đọc kết quả

21

2.12.2.2 ELISA gián tiếp











Sơ đồ 2.2: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA gián tiếp
2.12.2.3 Sandwich ELISA
Sandwich ELISA có thể đƣợc chia làm hai hệ thống:

 Sandwich ELISA trực tiếp












Sơ đồ 2.3: Tiến trình thực hiện ELISA Sandwich trực tiếp



Cho kháng nguyên vào đĩa

Đem ủ, rửa

Thêm kháng thể

Ủ, rửa

Bổ sung kháng kháng thể có gắn enzyme

Ủ, rửa

Thêm cơ chất tạo màu

Ủ, đọc kết quả


Cho kháng thể vào mỗi đĩa ELISA

Ủ, rửa

Thêm kháng nguyên vào

Ủ, rửa

Bổ sung kháng thể có gắn enzyme

Ủ, rửa

Thêm cơ chất tạo màu

Ủ, đọc kết quả
22

 Sandwich ELISA gián tiếp

Sơ đồ 2.4: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA Sandwich gián tiếp
2.12.2.4 Phản ứng ức chế /cạnh tranh
C-ELISA (competition ELISA)















(John R. Crowther, 2001).
Cho kháng thể thứ I vào giếng ELISA

Ủ, rửa

Thêm kháng nguyên

Ủ, rửa

Thêm kháng thể thứ II

Ủ, rửa

Bổ sung kháng kháng thể thứ II có gắn enzyme vào

Ủ, rửa

Thêm cơ chất tạo màu

Ủ, đọc kết quả




Trƣờng hợp I Trƣờng hợp II

Cho kháng nguyên vào Cho kháng nguyên vào

Ủ, rửa Ủ, rửa

Bổ sung kháng nguyên Không bổ sung kháng nguyên

Thêm kháng thể có gắn enzyme Thêm kháng thể có gắn enzyme

Ủ, rửa Ủ, rửa

Bổ sung cơ chất tạo màu Bổ sung cơ chất tạo màu

Ủ Ủ

Đọc kết quả (không màu): 100% Đọc kết quả (màu): 0%


 Tuỳ theo độ đậm nhạt của màu mà ta có phần trăm mức độ cạnh tranh từ
đó kết luận mức độ nhiễm bệnh.

cạnh tranh
cạnh tranh

23

2.12.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến độ nhạy của phản ứng ELISA
 Số lƣợng kháng thể thứ nhất đƣợc gắn vào đáy giếng
 Ái lực của kháng thể thứ nhất đối với kháng nguyên
 Ái lực của kháng thể thứ hai đối với kháng nguyên
 Hoạt tính chuyên biệt của kháng thể thứ hai
(Chemicon International)
2.12.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả ELISA
 Nếu các đối chứng âm cho kết quả dƣơng tính thì có thể do sự nhiễm từ chất tạo
màu hoặc từ kháng thể đƣợc đánh dấu hoặc chính các đối chứng bị nhiễm.
 Nếu màu không xuất hiện đối với đối chứng dƣơng hoặc đối với mẫu thì phải
kiểm tra lại tất cả hoá chất bao gồm: hạn sử dụng, nồng độ, điều kiện bảo quản
 Nếu màu xuất hiện quá thấp đối với đối chứng dƣơng và cả mẫu kiểm tra thì
phải kiểm tra lại kháng thể đƣợc gắn enzyme và nồng độ của chất tạo màu
 Nếu có tạo màu đối với mẫu nhƣng không tạo màu với đối chứng dƣơng thì có
thể kiểm tra lại nguồn gốc đối chứng, hạn sử dụng và điều kiện bảo quản.
 Khi chạy lại một thử nghiệm trong điều kiện đang gặp sự cố thì chỉ nên thay đổi
một yếu tố thí nghiệm. (Trích từ Chemicon International).

2.13 Giới thiệu về kỹ thuật PCR
2.13.1 Nguyên tắc của kỹ thuật PCR
PCR đƣợc thực hiện trên cơ sở sinh tổng hợp DNA theo nhiều chu kỳ nối tiếp
nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 trình tự nhƣ sau :
 Bƣớc 1: Biến tính sợi đôi thành sợi đơn (denature)
Giai đoạn này đƣợc thực hiện ở nhiệt độ cao (94-95
o
C) trong vòng 30
giây đến 1 phút, làm cho phân tử DNA mạch kép tách thành 2 mạch đơn. Chính 2
mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp 2 mạch bổ sung mới.
 Bƣớc 2: Phản ứng của primer gắn vào đầu dây chuỗi mã đối xứng với
chuỗi mã trên dây template (gọi là tiến trình bắt cặp) để có phân tử DNA
mới.
Ở giai đoạn này nhiệt độ đƣợc hạ thấp cho phép các primer bắt cặp với
DNA khuôn mẫu, nhiệt độ này dao động trong khoảng 30-70
o
C, kéo dài trong khoảng
30 giây đến 1 phút, tùy thuộc vào nhiệt độ nóng chảy Tm (melting temperature) của
các primer sử dụng. Giai đoạn này gọi là giai đoạn bắt cặp.
 Bƣớc 3: Kéo dài dây mới nhờ primer (extension)
24

Nhiệt độ đƣợc tăng lên 72
o
C giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt
nhất. Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA khuếch đại,
thƣờng kéo dài từ 30 giây đến vài phút.
Kết quả cuối cùng là một đoạn mã hóa di truyền đặc biệt nào đó đƣợc
khuếch đại lên rất nhiều lần. Sự khuếch đại này có thể đƣợc tính nhƣ sau:
Tổng lƣợng DNA khuếch đại = m x 2

n
m : là số bản sao của chuỗi mã hóa.
n : là số chu kỳ.

Hình 2.6: Nguyên tắc phản ứng PCR
Ba tiến trình này xảy ra theo chu kỳ rất nhanh để khuếch đại DNA. Trong chu kỳ
thứ nhất và thứ hai của phản ứng khuếch đại, chỉ có sản phẩm chuỗi dài đƣợc hình
thành, còn trong những chu kỳ tiếp theo khuếch đại cả những sản phẩm chuỗi dài và
chuỗi ngắn. Sản phẩm chuỗi dài đƣợc tích tụ theo hƣớng tuyến tính, còn sản phẩm
chuỗi ngắn tích tụ theo logarit.Ngƣời ta hy vọng có khoảng 10
5
lƣợng sản phẩm chuỗi
ngắn sau khoảng 25-30 chu kỳ. Theo nguyên tắc PCR đƣợc áp dụng để khuếch đại các
đoạn DNA có chiều dài 200-2000bp.
Những phản ứng trên đƣợc thực hiện nhờ polymerase nhƣ Taq polymerase, và sự
thay đổi chu kỳ nhiệt một cách hợp lý, đặc biệt là nhiệt độ cho sự biến tính và nhiệt độ
cho bắt cặp.
Một polymerase của DNA và bốn loại nucleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
đƣợc dùng để khuếch đại một đoạn nào đó của DNA.
Primer bên trái tác động trên dây DNA 3’-5’ còn đƣợc gọi là forward primer, kí
hiệu là F. Primer bên phải tác động trên dây 5’-3’ còn đƣợc gọi là reverse primer, kí
hiệu là R. Sự sắp xếp nhƣ vậy đảm bảo vùng bị can thiệp đƣợc tăng cƣờng hoạt động,
theo 3 trình tự đã nói ở trên. Tóm lại khi các primer kết hợp với sợi DNA bổ sung của
25

nó trong điều kiện một khoảng cách đã đƣợc kích hoạt, các đoạn DNA này có thể sẽ
đƣợc khuếch đại lên theo phản ứng dây chuyền với polymerase.
2.13.2.Tối ƣu hóa các điều kiện cho phản ứng PCR
 DNA mẫu
PCR là một công cụ rất mạnh để khuếch đại DNA, vì thế trong phản ứng PCR chỉ

cần một lƣợng rất nhỏ là đủ. Nhƣng để giảm bớt lỗi gây ra bởi Taq DNA polymerase
thì một nồng độ cao hơn có thể đƣợc sử dụng, tuy nhiên nếu nồng độ DNA khuôn mẫu
quá cao thì sẽ làm gia tăng mức độ nhiễm đồng thời có thể làm giảm hiệu quả phản
ứng.
Phản ứng khuếch đại tối ƣu xảy ra trên DNA thật tinh sạch. Tuy nhiên, những kỹ
thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn cho kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch
chiết tế bào.
Thông thƣờng, nhiễm protein trong mẫu DNA trong quá trình ly trích DNA sẽ
không ảnh hƣởng xấu đến sự nhân DNA. Tuy nhiên nhiễm DNA lạ sẽ dẫn đến kết quả
PCR bị sai lệch.
Đối với những DNA có kích thƣớc quá lớn (>50kb), sự biến tính có thể không
hữu hiệu và năng suất PCR thấp. Trong trƣờng hợp này, cần phải cắt DNA trƣớc bằng
enzyme cắt hạn chế mà enzyme đó không cắt trong chuỗi đích; hoặc có thể tách DNA
bằng cách dùng nhiệt độ tới 100
o
C trong 2-5 phút.
 Enzyme DNA polymerase
Ngƣời ta thƣờng sử dụng Taq polymerase, đây là enzyme chịu nhiệt ly trích từ
vi khuẩn suối nƣớc nóng Thermus aquaticus (Bùi Trang Việt, 2002). Với enzyme này,
PCR cho hiệu quả cao nhất, Taq có thể xúc tác kéo dài khoảng 35-100 nucleotide
trong 4 giây ở nhiệt độ 70-80
o
C. Đây là giới hạn nhiệt độ thích hợp nhất cho enzyme
này hoạt động (Newton và Graham, 1997).
Nồng độ Taq polymerase đƣợc sử dụng thông thƣờng là 0.5-5 đơn vị/100μl
dung dịch phản ứng. Nếu nồng độ Taq quá cao, những sản phẩm không chuyên tính có
thể nhảy vào làm sai lệch kết quả. Nếu nồng độ Taq quá thấp, chúng ta sẽ không có đủ
số lƣợng men để xúc tác tạo ra sản phẩm PCR theo ý muốn.
Trong phản ứng PCR thì Taq polymerase có khuynh hƣớng thêm một
nucleotide loại “A” vào đầu tận cùng 3’ của sản phẩm PCR, điều này rất quan trong

trong việc tạo dòng (TA- cloning) và nó sẽ bị loại thải đi nếu sự gắn kết xảy ra ở đầu
26

tận cùng là đầu bằng (blunt end ligation). Ngoài ra có thể làm gia tăng hoạt tính của
Taq polymerase bằng cách sử dụng kết hợp với một số enzyme khác: Tli hoặc Pfu. Use
Tli, Pfu và một số enzyme polymerase khác.
 Lựa chọn Enzyme polymerase cho phản ứng PCR
DNA Polymerase
Tự nhiên hoặc tái tổ
hợp
Nguồn gốc
Taq
Tự nhiên
Thermus aquaticus
Amplitaq®
Tái tổ hợp
T. aquaticus
Amplitaq (Stoffel fragment)®
Tái tổ hợp
T. aquaticus
Hot Tub™
Tự nhiên
Thermus flavis
Pyrostase™
Tự nhiên
T. flavis
Vent™
Tái tổ hợp
Thermococcus litoralis
Deep Vent™

Tái tổ hợp
Pyrococcus GB-D
Tth
Tái tổ hợp
Thermus thermophilus
Pfu
Tự nhiên
Pyrococcus furiosus
ULTma™
Tái tổ hợp
Thermotoga maritima

 Đặc tính của từng loại DNA polymerase đƣợc sử dụng trong PCR
(Michael Blaber, 1998)

Taq/Amplitaq®
Stoffel
fragment
Vent™
Deep
Vent™
Pfu
Tth
ULTma™
95 °C half-life
40 phút
80 phút
400
phút
1380

phút
>120
phút
20
phút
>50 phút
5'3' exo
+




+

3'5' exo


+
+
+

+
Tỉ lệ kéo dài
(nucleotide/giây)
75
>50
>80
?
60
>33

?
Hoạt tính
Reverse
transcription
Yếu
Yếu
?
?
?
Tốt
?
Tạo ra đầu tận
cùng
3' A
3' A
>95%
đầu
bằng
>95%
đầu
bằng
đầu
bằng
3' A
đầu bằng
Sự đổi chỗ sợi


+
+

Trọng lƣợng
phân tử (kDa)
94
61
?
?
92
94
70
27

 Primer
Một số chỉ tiêu cơ bản trong thiết kế- lựa chọn Primer:
 Thông thƣờng các primer có chiều dài 20- 30 mer
 Không nên thiết kế các primer có polybase (chuỗi base cùng loại) hay
những trình tự lặp lại
 Kiểm tra lại primer để tránh hiện tƣợng primer- dimer
 Thêm một cặp GC vào đầu tận cùng 5’ nếu thấy có vị trí cắt giới hạn ở
đó
 Các trình tự bổ sung với các primer khác sử dụng trong PCR nên đƣợc
tránh để ngăn chặn sự lai giữa các primer với nhau
 Khoảng cách giữa các primer nên thấp hơn 10 kb
 Thêm một hoặc hai G / C vào đầu tận cùng 3’ thì tốt nhƣng tránh thêm
quá nhiều vì điều này có thể cho kết quả là sẽ tạo ra các sản phẩm PCR không đặc hiệu
 Tm của mồi xuôi và mồi ngƣợc không cách biệt nhau quá xa. Thành phần
nucleotide của các primer cân bằng, tránh các cặp G, C lặp lại nhiều
lần.

 Các primer đƣợc chọn phải đặc trƣng cho trình tự DNA cần khuếch đại,
không trùng với các trình tự lặp lại trên genome.
 Trình tự DNA nằm giữa hai mồi “xuôi” và “ngƣợc” không quá lớn. Phản
ứng sẽ tối ƣu trên những trình tự DNA nhỏ hơn 1 kb.
Tính toán nhiệt độ nóng chảy (Tm) của primer:
 Cách 1: Cách này chỉ sử dụng khi chiều dài primer không quá 20
nucleotide
Tm = [(A+T) x 2 °C] + [(G+C) x 4 °C]
 Cách 2: Hiệu quả đối với primer có chiều dài từ 14 – 70 nucleotide
Tms = 81.5 + 16.6(log10[J
+
]) + 0.41(%G+C) - (600/l)
+ [J
+
] : nồng độ mol các cation hoá trị I
+ (%G+C) : % nucleotide loại G và C
 Cách 3: Hiệu quả nhất đối với các primer có chiều dài từ 20 – 35 base
Tmp = 22 + 1.46([2 x (G+C)] + (A+T))

28

 Nhiệt độ bắt cặp
Kỹ thuật PCR rất mẫn cảm với nhiệt độ. Vì thế bất cứ sự thay đổi nhiệt độ nào
của phản ứng cũng có thể ảnh hƣớng mạnh đến năng suất và độ chuyên biệt.
Suggs và ctv.(1981) đã đề nghị một công thức để ƣớc đoán nhiệt độ T
m
, mà ở
nhiệt độ ấy, một nửa các primer sẽ lai với DNA mục tiêu. Công thức đƣợc sử dụng
trong điều kiện primer có khoảng 20 oligonucleotide:
T

m
= 4 (G + C) + 2 (A + T)
A, T, C, G là số lƣợng các base có trong oligonucleotide.
Tuy nhiên, việc tính toán này chỉ có tính chất tạm thời, chúng ta phải điều chỉnh
lại nhiệt độ này để có sự khuếch đại cao nhất và thu nhận tần suất đa hình cao nhất.
Bằng kinh nghiệm và thực hiện xét nghiệm nhiều lần, chúng ta mới có thể có số liệu
đúng về nhiệt độ lai. Số base càng ít nhiệt độ này càng thấp và ngƣợc lại.
Nếu nhiệt độ bắt cặp quá thấp dẫn đến sản phẩm đƣợc nhân lên quá mức do sự
bắt cặp các primer không chuyên biệt có thể xảy ra. Nếu nhiệt độ lai quá cao, năng
suất của sản phẩm mong muốn sẽ giảm.
Nếu primer bắt cặp một cách chính xác với đoạn DNA mẫu, nhiệt độ bắt cặp
nên thấp hơn nhiệt độ lý thuyết T
m
khoảng 5
o
C. Thông thƣờng, với một
oligonucleotide có 20 nucleotide có thể dùng nhiệt độ lai 50-55
o
C. Nếu chuỗi dài hơn
(25 nucleotide hay nhiều hơn) hoặc có thể nhiều base G, C, nhiệt độ lai có thể đến 55-
65
o
C. Trong vài phản ứng, oligonucleotide lớn (từ 30 bp trở lên), giai đoạn bắt cặp và
kéo dài có thể đƣợc kết hợp và thực hiện ở 68-72
o
C. Khi dùng dƣ oligonucleotide với
khả năng bắt cặp sai, nhiệt độ bắt cặp có thể giảm còn 37-45
o
C (Hồ Bích Liên,2003).
 Tỉ lệ primer/DNA khuôn mẫu

Một trong những yếu tố quan trọng nhất của PCR là tỉ lệ tối ƣu giữa primer và
DNA mẫu. Nếu tỉ lệ này quá cao, hiện tƣợng primer-dimer sẽ xuất hiện, giống nhƣ
trƣờng hợp DNA mẫu quá loãng. Nếu tỉ lệ này quá nhỏ, kết quả sản phẩm PCR sẽ
không nhiều.
Hầu hết các trƣờng hợp áp dụng PCR, đều dùng một nồng độ primer không quá
0.5μM (12.5 pmol/25 μl phản ứng), không tính đến nồng độ DNA mẫu, để tránh hiện
tƣợng primer-dimer.