Luận văn : ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT - PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN part 4 docx

Ly trích/tách chiết RNA

AA(A)
n

Tổng hợp cDNA
Primer đặc
hiệu
Primer
oligo dT
Random hexamer
primer
AA(A)
n
AA(A)
n
GSP
AA(A)
n
Oligo dT
N
6
N
6
AA(A)
n

AA(A)
n
AA(A)
n
Chu kỳ I của PCR
Chu kỳ I của PCR
Chu kỳ I của PCR
AA(A)
n
AA(A)
n
AA(A)
n
Primer xuôi
Primer xuôi
Primer xuôi
AA(A)
n
AA(A)
n
AA(A)
n
Chu kỳ II của PCR
Chu kỳ II của PCR
Chu kỳ II của PCR
Primer ngược
Primer xuôi
Tiếp tục chu kỳ nhiệt
Sơ đồ 2.1. Quá trình hoạt động của các primer trong phiên mã ngược(13)
19

Phần III. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP

3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian thực hiện khoá luận tốt nghiệp kéo dài từ ngày 01/03/2005 đến ngày
15/08/2005 tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm trường Đại Học Nông Lâm Thành
Phố Hồ Chí Minh.

3.2. Nội dung nghiên cứu
Xây dựng quy trình RT-PCR phát hiện virus PRRS từ ba nguồn Taq khác nhau.
Xây dựng quy trình điện di để phát hiện RNA tổng số.
Ly trích RNA từ dịch nuôi cấy tế bào và huyết thanh của heo nghi nhiễm PRRSV
bằng cách sử dụng hai phương pháp ly trích theo bộ kit và sử dụng TRIzol.
Chẩn đoán virus PRRS từ mẫu thu nhận bằng quy trình RT-PCR đã thiết lập.

3.3. Vật liệu và hoá chất
3.3.1. Mẫu xét nghiệm
Mẫu RNA chuẩn được cung cấp từ Trung tâm chẩn đoán xét nghiệm Ploufragan
(Pháp).
Mẫu nuôi cấy tế bào (trước đó đã kiểm tra cho kết quả ELISA dương tính) được
cung cấp từ Trung Tâm Thú Y Vùng Thành Phố Hồ Chí Minh: 10 mẫu
Mẫu huyết thanh và mẫu phổi được thu nhận từ các trại heo: 71 lượt mẫu. Trong đó
mẫu huyết thanh là 41 mẫu, mẫu phổi là 6 mẫu.

3.3.2. Cặp primer trong phản ứng RT-PCR
Cặp primer theo tác giả Rovira được thiết kế dựa vào trình tự của vùng đọc mở
số 7 (ORF7) của virus PRRS giống Olot/91 (Rovira và cộng sự) và được cung cấp bởi

công ty sản xuất primer: Proligo Primers and Probe. Đây là primer đặc hiệu cho virus
PRRS, chúng có khả năng khuếch đại đặc hiệu một đoạn có kích thước khoảng 400bp.
Cặp primer P1, P2 theo tác giả Meritxel Donadeu, 1999 được thiết kế có khả
năng khuếch đại đoạn có kích thước 271bp đối với chủng PRRSV Châu Âu và 280bp
đối với chúng PRRSV Châu Mỹ. Trình tự các cặp primer này như sau:
20




Bảng 3.1. Các cặp primer sử dụng trong phản ứng
Tên
Trình tự nucleotide (5’ đến 3’)
Vị trí trên genome
P1
CCA GCC AGT CAA TAC RCT GTG
14647 đến 14667 (Lelystad)
2948 đến 2968 (VR2332)
P2
GCG AAT CAG GCG CAC WGT ATG
14938 đến 14918 (Lelystad)
3248 đến 3228 (VR2332)
Rovira 1
CCT CGT CAA GTA TGG CCG GTA
Độ dài đoạn gene nhân lên:
400bp
Rovira 2
GAC TGT CAA ATT AGC TTG CAC CC

3.3.3. Vật liệu và hóa chất cho chiết tách RNA

a. Bộ kit chiết tách RNA của công ty QIAGEN: QIAamp
®
Viral RNA Mini Kit
b. Vật liệu và hóa chất trong phương pháp Sử dụng TRIzol
- Chất phản ứng TRIzol (Tripure Isolation Reagent, Boehringer Mannheim)
- Chloroform
- Glycerol
- Isopropanol
- Ethanol 75 %
- Nước cất hai lần khử ion và khử RNase bằng cách xử lý với DEPC (diethyl
pyrocarbonate)

3.3.4. Vật liệu và hóa chất điện di RNA
- Gel biến tính
- Dung dịch biến tính và đặt mẫu
- Dung dịch MOPS dùng cho điện di RNA

3.3.5. Vật liệu và hóa chất sử dụng cho RT-PCR
- Nước không có RNase
- TaqBeat
™
Hot Start Polymerase wax beads (Promega)
- Taq polymerase (Biorad)
- Taq DNA Polymerase (ABgene)
- dATP, dTTP, dGTP, dCTP (Promega )
- Cặp mồi
- RNA mẫu chuẩn
21

- RNA thu được từ mẫu ly trích
- AMV reverse transcriptase (Promega)
- MgCl
2
(Promega)
- Recombinant RNasin
®
Ribonuclease Inhibitor (Promega)
- Reverse transcription 10X buffer (Promega)

3.3.6. Vật liệu và hoá chất cho điện di sản phẩm RT - PCR
- Agarose (Biorad)
- TBE 0.5X (Tris HCl, acid boric, Na
2
EDTA, Nước cất hai lần khử ion đã hấp
khử trùng)
- Loading dye (Bromophenol blue, sucrose, TE)
- Ladder 100bp
- Ethidium bromide

3.4. Thiết bị và dụng cụ
- Tủ cấy vô trùng
- Máy ly tâm (Mikro Z2K/ Sigma 3K30C)
- Tủ -70
0
C ( Sanyo Ultra Low)
- Tủ - 20
0

C ( CFC Free Sanyo Brandt)
- Tủ mát 4
0
C
- Máy vi sóng (Electrolux)
- Máy chụp gel (Biorad)
- Máy PCR (BioRad)
- Máy vortex
- Bộ nguồn và bồn điện di
- Micropipet, đầu tip và eppendorf

3.5. Các phƣơng pháp
3.5.1. Bảo quản mẫu dịch nuôi cấy tế bào
Quá trình nuôi cấy tế bào giúp gia tăng số lượng virus nhằm tạo điều kiện thuận
lợi cho quá trình ly trích và thu nhận RNA. Dịch nuôi cấy tế bào được thu nhận từ
Trung Tâm Thú Y Vùng sau khi rã đông nhiều lần để giải phóng virus ra khỏi tế bào
nuôi cấy. Dịch nuôi cấy được giữ ở -70
0
C cho đến khi tiến hành quá trình ly trích.
22




3.5.2. Chuẩn bị và bảo quản mẫu huyết thanh
Mẫu máu được thu nhận từ những heo có biểu hiện lâm sàng nghi nhiễm virus
PRRS (sẩy thai, heo con sinh ra chết). Sau đó, mẫu máu được để đông tự nhiên và thu
lấy phần huyết thanh bên trên. Phần huyết thanh được trữ đông ở -70
0
C cho đến khi ly

trích.

3.5.3. Phƣơng pháp tách chiết RNA virus từ huyết thanh và từ dịch nuôi cấy
tế bào theo TRIzol
Bước 1: Đồng nhất mẫu, phá vỡ tế bào
- Cho 100 l huyết thanh/dịch nuôi cấy tế bào vào ống eppendorf, sau đó cho
thêm 1 ml chất phản ứng TRIzol vào ống.
- Vortex để trộn đều, sau đó để ổn định trong 5 phút ở điều kiện nhiệt độ phòng.
Bước 2: Phân tách và tinh sạch RNA
- Thêm 0.2 ml chloroform và vortex để trộn đều. Để ổn định trong 10 phút ở
nhiệt độ phòng.
- Ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút trong 15 giây ở 4
0
C để phân tách thành
các phần khác nhau.
Bước 3: Kết tủa RNA
- Thu lấy phần dịch không màu bên trên và cho vào một eppendorf mới. Thêm
0.5ml isopropanol và 1µl glycerol vào eppendorf có chứa dịch thu được.
- Vortex để trộn đều, sau đó để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Ly tâm với tốc
độ 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 4
0
C. Loại bỏ phần dịch nổi và thu lấy phần tủa có
chứa RNA.
Bước 4: Rửa RNA
- Cho 500μl ethanol 75 % vào phần tủa, tiến hành đảo nhẹ và đều khắp ống. Ly
tâm với tốc độ 12000 vòng/phút trong 5 phút ở 4
0
C.
- Loại bỏ phần dịch bên trên, cố gắng loại bỏ hết ethanol. Làm khô khối RNA
trong không khí trong 5 đến 10 phút sao cho bốc hơi hết ethanol .

Bước 5: Hòa tan RNA
- Hoà tan khối RNA trong 10 l nước không có chứa RNase. Giữ ở -20
0
C cho
đến khi sử dụng

23




3.5.4. Điện di RNA trên gel biến tính
Dung dịch dùng đặt mẫu 2X
Dung dịch dùng đặt mẫu là một dung dịch có màu xanh với các thành phần
bromophenol blue 0,1 %, EDTA 1,6mM, formaldehyde 0,36M, glycerol 8 %,
formamide 12,04 %, FA (formaldehyde agarose) gel buffer 1,6M. Dung dịch này có
thể giữ trong 3 tháng ở điều kiện 2
0
C - 8
0
C.
Dung dịch điện di
Dung dịch sử dụng cho điện di là dung dịch MOPS 1M, bao gồm FA gel buffer
1X, formaldehyde 2,5M, nước không có RNase, pH = 7.
Chuẩn bị gel biến tính cho quá trình điện di
Cân 0,3 g agarose, cho thêm 16 ml nước cất hai lần khử ion đã được xử lý với
DEPC, đun trong lò vi sóng ở mức sóng 650W cho đến khi agarose tan hoàn toàn
(thông thường trong khoảng 2,5 phút). Để nguội khoảng 60
0
C, tiếp tục cho vào 4ml

FA gel buffer và 360μl formaldehyde 37 – 40 %, lắc đều. Sau đó tiến hành đổ gel vào
giá nằm ngang có sẵn lược. Chờ gel đông đặc trong khoảng 45 phút, rút lược ra khỏi
gel và cho vào dung dịch điện di sẵn sàng cho việc đặt mẫu.
Tiến hành điện di














Cho 5 l dịch mẫu thu nhận được sau quá trình ly trích vào 5 l dung dịch buffer
biến tính 2X. Ủ hỗn hợp trên trong 5 phút ở 65
0
C
Cho nhanh hỗn hợp dung dịch trên vào nước đá trong khoảng 1 phút.
Cho 0,5 l ethidium bromide 10 mg/ml vào hỗn hợp trên và để ổn định trong
khoảng 1 phút.
Đặt mẫu vào gel biến tính đã được cho sẵn vào dung dịch điện di trong 15 phút.

Tiến hành quá trình điện di với hiệu điện thế 30 volt cho đến khi buffer đặt mẫu di
chuyển khoảng 3/4 gel.
Quan sát kết quả điện di dưới tia UV nhờ phần mềm Quantity one của công ty

Biorad.

24




3.5.5. Kỹ thuật RT-PCR trên RNA của virus
Để thực hiện phản ứng phiên mã ngược và khuếch đại đoạn cDNA sau phiên
mã ngược với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, chúng tôi sử dụng kỹ thuật RT-PCR một
bước nhằm hạn chế sự lây nhiễm. Trong phản ứng này, đầu tiên mồi Rovira 2 sẽ tiến
hành phiên mã ngược để tổng hợp cDNA nhờ vào enzyme AMV reverse transcriptase,
sau đó tiến hành sự khuếch đại đoạn cDNA vừa được tạo ra. Thành phần và chu kỳ
nhiệt cho phản ứng được trình bày sau đây.
Thành phần phản ứng RT-PCR:

Thành Phần
DDung dịch gốc
Thể tích
Nồng độ cuối
TaqBeat
®
Hot Start
MgCl
2
dNTPs
RNAsin
®
inhibitor
AMV reverse transcriptase

Reverse transcriptase buffer
Primer Rovira 1
Primer Rovira 2
Nước không chứa RNase
RNA mẫu
1,25 U/viên
25 mM
10 mM
20 U/µl
50 U/µl
10 X
5 µM
5 µM

1 viên
2,5 µl
0,75 µl
0,5 µl
0,25 µl
2,5 µl
0.2 µl
0,2 µl
13,1 µl
5.0 µl
1,25 U/viên
2,5 mM
0,3 mM
10 U
12,5 U
1 X

0.04 µM (1 pmol)
0.04 µM (1 pmol)

Tổng thể tích

25 µl


Ngoài ra, chúng tôi còn thay thế TaqBeat
®
Hot Start bằng Taq DNA
polymerase của công ty Biorad và Taq DNA polymerase của công ty ABgene để chạy
cùng một quy trình nhiệt.
Bảng 3.2. Thành phần phản ứng RT-PCR
25




Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RT-PCR
Bảng 3.3: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RT-PCR
Bƣớc
Hoạt động
Nhiệt độ
Thời gian
1
Phiên mã ngược
48
0
C

30 phút
2
Tiền biến tính
95
0
C

10 phút
3
Biến tính
95
0
C
15 giây
4
Bắt cặp và kéo dài
60
0
C

2 phút
5
lặp lại bước 3 và 4 trong 40 chu kỳ
6
Hoàn thành
72
0
C

7 phút

7
Giữ sản phẩm
4
0
C


Sau khi thiết kế thành công quy trình RT-PCR trên mẫu RNA chuẩn, chúng tôi
đã sử dụng quy trình trên để phát hiện sự hiện diện của virus PRRS trong các mẫu
RNA ly trích được.
3.5.6. Điện di sản phẩm RT-PCR
Hoá chất dùng đặt mẫu vào gel (loading dye)
Hóa chất dùng để đặt mẫu vào gel là một dung dịch có màu xanh với các thành
phần bromphenol blue (0,25 %), sucrose (40 %), TE vừa đủ.
Dung dịch điện di
Dung dịch sử dụng cho điện di là dung dịch TBE 0,5X, bao gồm Tris HCl (3,94
mg), acid boric (1,39g), Na
2
EDTA (93,06mg), nước cất vô trùng (500ml). Dung dịch
được điều chỉnh đến pH = 8.3 với NaOH 0,1 %.
Dung dịch nhuộm gel
Dung dịch nhuộm gel gồm có TBE (1X), ethidium bromide (10mg/ml)
Chuẩn bị gel cho quá trình điện di
Dùng điện di ngang với gel agarose có nồng độ 1 %. Cách chuẩn bị gel như sau:
Cân 0,25g agarose, thêm 25ml TBE (0,5X), đun trong lò vi sóng ở mức sóng
650W cho đến khi agarose tan hoàn toàn (thông thường đun trong 2 phút). Để nguội
đến khoảng 60
0
C (đến khi nào cầm được mà không quá nóng) thì đổ gel vào giá nằm
ngang có sẵn lược. Chờ gel đông đặc (khoảng 30 phút), rút lược ra khỏi gel và cho vào

dung dịch TBE sẵn sàng cho việc đặt mẫu.
26





Tiến hành điện di
Trộn dung dịch gồm 10µl mẫu và 2µl loading dye 6X. Cho dung dịch này vào giếng
trên gel. Điện di trong 30 phút với cường độ dòng điện là 250mA và hiệu điện thế 100V.
Nhuộm mẫu
Sau khi điện di, gel được lấy ra khỏi buồng điện di và ngâm vào dung dịch
ethidium bromide trong khoảng 30 phút.
Quan sát kết quả điện di
Kết quả điện di được quan sát dưới tia UV nhờ vào máy chụp ảnh DNA, được
quan sát nhờ phần mềm Quantity one của công ty Biorad


27