Luận văn : ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT - PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN part 3 pps

2.2.3. Phƣơng pháp phát hiện kháng thể trong huyết thanh (serology)
Phản ứng kháng thể hùynh quang trực tiếp (IFA); SNV (serum virus
neutralization); IMPA (immunoperoxidase monolayer assay) và ELISA (enzyme –
linked immunosorbent assay) tất cả đều có thể được sử dụng cho việc phát hiện kháng
thể đặc hiệu với virus PRRS.
Phản ứng IFA, SNV và ELISA được sử dụng thường xuyên trong hầu hết các
phòng thí nghiệm ở miền nam nước Mỹ trong khi đó, IMPA được sử dụng nhiều hơn ở
Châu Âu.
Yoon và cộng sự trong một nghiên cứu đã cho thấy IFA có độ đặc hiệu cao đến
99,5 %. Theo Frey, Yoon và cộng sự, IFA cho kết quả đáng tin cậy đối với việc phát
hiện kháng thể đặc hiệu đến ba tháng sau nhiễm (19).
Theo Drew, trong một thử nghiệm so sánh của mình, ông cho rằng IMPA có độ
nhạy cao hơn so với ELISA (16). IMPA thường được sử dụng nhằm phát hiện việc
nhiễm virus PRRS từ ngày 7 đến ngày 15 sau khi nhiễm (19). Tuy nhiên, IMPA cũng
cho kết quả đáng tin cậy đối với việc phát hiện kháng thể đặc hiệu sau hai đến ba tháng
nhiễm bệnh.
Theo Albina; và cộng sự, ELISA cho kết quả có độ đặc hiệu và độ nhạy cao đối
với việc phát hiện kháng thể virus PRRS trong huyết thanh. Điều bất lợi của thử nghiệm
này là hay cho kết quả dương tính giả (19).
Nhiều dạng ELISA đã được mô tả: ELISA trực tiếp sử dụng tỉ số S/P
(sample/positive); ELISA trực tiếp sử dụng giá trị OD trực tiếp, ELISA ngăn trở.
Trong một bộ ELISA kit thương mại (HerdChek® PRRS ELISA, IDEXX Laboratories
Inc., Westbrook, Maine), tỉ số S/P ≥ 0,4 thì kết quả là dương tính. Sử dụng tỉ số S/P ≥
0,4 như là một giá trị giới hạn, kháng thể đặc hiệu đối với virus PRRS được phát hiện
đối với những heo nhỏ từ 10 đến 14 ngày sau nhiễm trong những điều kiện thí nghiệm
và cao nhất là 2 đến 3 tháng sau nhiễm (Yoon et al., 1995a). Độ đặc hiệu của
HerdCheck® PRRS ELISA nằm trong khoảng 99,3 % đến 99,5 % (19).

SNV cũng là một phản ứng đặc hiệu cho việc phát hiện kháng thể virus PRRS
trong máu, nhưng những nghiên cứu của Benfield và Morrison từ những năm 1992 đã
cho thấy rằng SNV có độ nhạy thấp hơn so với IFA và ELISA. Độ nhạy thấp của phản
ứng này trước tiên là do kháng thể trung hòa (một dạng kháng thể được phát hiện bởi
phản ứng SNV) kháng virus PRRS phát triển chậm trong 1 đến 2 tháng sau khi nhiễm (19).
10




Kháng thể đặc hiệu đối với virus PRRS thường không kéo dài trong thời gian
sống của thú. Đối với những thú gây nhiễm virus PRRS thực nghiệm, kháng thể đặc
hiệu đối với virus đầu tiên được phát hiện bởi IgG-IFA, IPMA, ELISA và SNV trong
thời gian từ 5 đến 9 ngày, 9 đến 11 ngày, 9 đến 13 ngày, và 9 đến 28 ngày sau nhiễm.
Kháng thể IgM đặc hiệu đối với virus PRRS được phát hiện từ ngày thứ 5 sau nhiễm
và kéo dài từ 21 đến 28 ngày sau nhiễm. Tùy thuộc vào thử nghiệm, những đơn vị
kháng thể đạt đến giá trị cao nhất khoảng 30 ngày đến 50 ngày (IFA), 35 ngày đến 50
ngày (IPMA), 30 ngày đến 50 ngày (ELISA), và 60 ngày đến 90 ngày (SNV) sau
nhiễm, sau đó bị giảm dần. Yoon và cộng sự trong một thí nghiệm đã chứng minh rằng
không thể phát hiện kháng thể trong khoảng 4 đến 5 tháng đối với IFA, 4 đến 10 tháng
đối với ELISA 11 đến 12 tháng đối với IMPA và khoảng 12 tháng đối với SNV sau
nhiễm.
Những kết quả huyết thanh dương tính từ mẫu máu thu nhận từ heo có biểu
hiện lâm sàng đối với virus PRRS thì không đủ cơ sở cho việc chẩn đoán virus PRRS
(Van Alstine và cộng sự, 1993). Có thể đó chính là sự hiện diện của kháng thể mẹ
truyền cho heo con. Albina trong một nghiên cứu năm 1994 cho thấy rằng kháng thể
truyền từ mẹ được phát hiện trong huyết thanh của lợn con 4 ngày sau khi sinh và
không phát hiện thấy ở 3 tuần sau đó.
Kháng thể đặc hiệu từ mẹ đối với virus PRRS tồn tại trong cơ thể heo con từ 4
đến 10 tuần tuổi và đôi khi tồn tại đến 16 tuần tuổi đối với heo bú sữa mẹ đã được

miễn dịch. Vì kháng thể thường không kéo dài trong suốt thời gian sống của thú và vì
sự liên kết trong thời gian ngắn của kháng thể IFA và ELISA, điều khuyên nhủ đầu
tiên là heo nhỏ và tốt hơn hết là đàn heo giống cần được kiểm tra để phát hiện tình
trạng nhiễm virus PRRS của đàn.

2.2.4. Kỹ thuật PCR để phát hiện PRRSV
Kỹ thuật PCR được phát triển để phát hiện RNA của virus PRRS trong các mẫu
bệnh phẩm. Vì không cần phải phân lập virus trong môi trường nuôi cấy tế bào nên
PCR sẽ ít tốn thời gian để phát hiện hơn so với phương pháp nuôi cấy tế bào. PCR còn
được xem là một phương pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu cao.
11




Nhiều dạng khác nhau của PCR được sử dụng, hầu hết chúng được sử dụng để
phát hiện các vùng ORF7, ORF6 hay ORF1b và có thể sử dụng một cách trực tiếp
trong việc phân tích các mẫu bệnh phẩm.
Fun In Wang (1994) đã sử dụng kỹ thuật RT-PCR trực tiếp để phát hiện sự tồn
tại của virus PRRS trong xác heo thương phẩm và trong tinh dịch con đực. Trong thí
nghiệm này với tỉ lệ huyết thanh dương tính là 85,4 % (205/240), nhưng chỉ có 11/140
mẫu máu chứa lượng virus có thể phát hiện được bằng RT-PCR. Ông kết luận kết quả
phản ứng RT-PCR phụ thuộc rất nhiều vào mẫu phân tích (7).Wagstrom và cộng sự
trong nghiên cứu của mình đã chứng minh kỹ thuật RT-PCR trực tiếp có khả năng
phát hiện RNA virus PRRS với độ đặc hiệu cao (99,4 %) (14).
Christopher-Hennings và cộng sự đã phát hiện ra sự hiện diện RNA của PRRS
virus trong cả hai loại mẫu: dịch tinh thanh và phần chứa tế bào (7).
Kết quả của phản ứng PCR giữa các phòng thí nghiệm khác nhau có thể sẽ khác
nhau, phụ thuộc vào các điều kiện về mẫu; qui trình thu nhận và trữ mẫu; qui trình
chiết tách, tinh sạch; trang thiết bị phòng thí nghiệm; kỹ năng và kinh nghiệm của

người thực hiện việc phân tích.

2.3. Phƣơng pháp PCR
Kỹ thuật nhân DNA đặc hiệu, còn gọi là phản ứng chuỗi trùng hợp hay kỹ thuật
PCR (polymerase chain reaction) được Karl Mullis và cộng sự phát minh vào năm
1985 đã đưa lại một cuộc cách mạng trong di truyền học phân tử.

2.3.1. Nguyên tắc
Kỹ thuật PCR Sử dụng các đặc điểm của quá trình sao chép DNA, về thực chất
nó được xem như là phương pháp tạo dòng in vitro, không cần có sự hiện diện của tế
bào. Phản ứng PCR là một chuỗi những chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai
đoạn.
Giai đoạn 1: Đây là giai đoạn biến tính (denaturation). Ở giai đoạn này thường sử
dụng điều kiện nhiệt độ biến tính, thường ở 94
0
C - 95
0
C trong 30 – 60 giây, làm đứt
các cặp base và tách DNA sợi đôi tạo thành các sợi đơn để đóng vai trò như khuôn
mẫu quá trình tổng hợp DNA.
12




Giai đoạn 2: Đây là giai đoạn bắt cặp (annealation). Giai đoạn này thường được tiến
hành ở điều kiện nhiệt độ 40
0
C

– 70
0
C trong 30 – 60 giây tùy thuộc vào primer sử
dụng cho phản ứng. Ở nhiệt độ này, primer sẽ tiến hành gắn kết với DNA mẫu. Việc
xác định nhiệt độ lai ở giai đoạn này là rất quan trọng, nó quyết định đến độ nhạy và
độ đặc hiệu của phản ứng PCR. Nếu nhiệt độ lai trong giai đoạn này quá thấp sẽ dẫn
đến sự bắt cặp không đặc hiệu dẫn đến kết quả khuếch đại sản phẩm bị sai. Nếu nhiệt
độ lai quá cao sẽ dẫn đến độ nhạy của phản ứng kém vì primer sẽ không bắt cặp được.
Cách tính nhiệt độ lai (5)
Nhiệt độ này có thể được tính thông qua Tm. Tm là nhiệt độ mà ở đó việc lai
bắt cặp đúng phân ly. Thông thường nhiệt độ lai thường sử dụng ở điều kiện nhiệt độ
thấp hơn 1 – 2
0
C so với Tm.
Tm có thể được xác định bằng thí nghiệm nhưng thường được tính theo công
thức sau :
Tm = 4 * (G + C) + 2 * (A + T)
Trong đó:
G+C là số nucleotide G và C trong trình tự primer
A+T là số nucleotide A và T trong trình tự primer
Giai đoạn 3: Đây là giai đoạn kéo dài (elongation). Giai đoạn này thường được tiến
hành ở nhiệt độ 72
0
C

– 74
0
C trong 30 giây đến vài phút tùy thuộc vào chiều dài đoạn
DNA cần tổng hợp. Điều kiện nhiệt độ này sẽ giúp cho Taq polymerase hoạt động và
tiến hành tổng hợp sợi DNA mới.

Một phản ứng PCR thường không vượt quá 40 chu kỳ là tốt nhất.Trong phản
ứng PCR, sản phẩm được tạo ra theo cấp số nhân trên cơ sở những sản phẩm ban đầu
nên nếu số chu kỳ khuếch đại quá lớn sẽ làm cho sản phẩm ngày càng bị sai lệch so
với sản phẩm ban đầu.

2.3.2. Các thành phần tham gia phản ứng PCR
Mồi (primer)
Tất cả các DNA polymerase đều cần những mồi chuyên biệt để tổng hợp một
mạch DNA mới từ mạch khuôn. Mạch khuôn là mạch được tạo ra từ mẫu DNA ban
đầu.
13




Mồi là các trình tự oligonucleotide có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu
của mạch khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn mồi này được nối dài để
hình thành mạch mới.
Các mồi này gồm một mồi xuôi (sens primer) và mồi ngược (antisens primer).
Mồi là yếu tố quan trọng quyết định tính đặc hiệu của phản ứng PCR. Mồi cũng có vai
trò khởi động hoạt động của enzyme DNA polymerase khi đã ở trạng thái bắt cặp ở
đầu 3’.
dNTP (deoxynucleotide triphosphate)
dNTP là một dung dịch gồm bốn thành phần deoxynucleotide (dATP, dGTP,
dCTP, dTTP). Thông thường dung dịch dNTP được pha và bảo quản ở dạng dung dịch
mẹ (10X) với nồng độ các deoxynucleotide thành phần từ 20 - 200µM. Nồng độ sử
dụng dung dịch dNTP trong phản ứng sẽ tùy thuộc vào các điều kiện phản ứng chung.
DNA polymerase
Enzyme này có vai trò kéo dài mạch mới bổ sung với mạch khuôn từ các mồi
khởi đầu. Có nhiều loại DNA polymerase Sử dụng cho phản ứng PCR. Nhìn chung,

các DNA polymerase có chung đặc điểm là chịu nhiệt, không bị biến tính hay bị huỷ ở
nhiệt độ biến tính DNA.
Dung dịch đệm cho phản ứng PCR
Dung dịch đệm bao gồm các thành phần sau: Tris HCl (pH 8.3), KCl, MgCl
2
,
gelatin. Thành phần và nồng độ dung dịch đệm sử dụng tùy thuộc vào loại DNA
polymerase. Trong thành phần dung dịch đệm cho phản ứng PCR đôi khi người ta bổ
sung MgCl
2
ở nồng độ 0.5 – 5.0 mM. Dung dịch đệm có vai trò trong việc tạo sự kết
hợp giữa các dNTP, kích hoạt DNA polymerase. Dung dịch đệm có ảnh hưởng mạnh
đến tính đặc hiệu và hiệu suất của phản ứng PCR.

2.3.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng PCR
DNA mẫu
Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch. Nhiều kỹ thuật chẩn
đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào.
Lượng DNA mẫu sử dụng cũng có xu hướng giảm (1µg xuống còn 100ng) với việc sử
dụng các DNA polymerase có hiệu quả cao.
14




Enzyme
Taq polymerase chịu nhiệt được tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus, sống
ở các suối nước nóng. Enzyme này không bị phá hủy ở nhiệt độ biến tính. Ngày nay,
nhiều polymerase chịu nhiệt khác được đưa ra thị trường với nhiều chức năng chuyên
biệt và hoàn thiện hơn. Tth polymerase, một enzyme tách chiết từ Thermus

themophilus có khả năng hoạt động như một enzyme phiên mã ngược khi có mạch
RNA khuôn và ion Mg
++
, nhưng với sự hiện diện của DNA khuôn và Mg
++
, Tth
polymerase lại xúc tác cho phản ứng khuếch đại DNA.
Primer và nhiệt độ lai
Primer là chìa khóa quan trọng cho sự thành công hay thất bại của một thí
nghiệm PCR. Nếu primer được thiết kế một cách chính xác thì thí nghiệm sẽ mang lại
kết quả về sự khuếch đại của một mảnh DNA đơn. Việc lựa chọn primer cần tuân theo
một số nguyên tắc sau:
- Trình tự primer được chọn sao cho không thể có sự bắt cặp giữa mồi “xuôi”
và mồi “ngược”, cũng không có cấu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp khác nhau của một mồi.
- Nhiệt độ nóng chảy của mồi xuôi và mồi ngược không nên cách nhau quá xa.
Thành phần các nucleotide của các mồi cần cân bằng, tránh các cặp G – C lặp đi lặp lại
quá nhiều lần.
- Các mồi được chọn cần phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại,
không trùng với trình tự lặp lại trên gene.
- Đoạn gene cần khuếch đại không nên lớn hơn 3 kb và chiều dài lý tưởng là
nhỏ hơn 1 kb.
Các thành phần khác của phản ứng PCR
- Bốn loại nucleotide thường được sử dụng ở nồng độ 20 – 200 µM/mỗi
nucleotide. Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh”. Sự mất cân bằng
trong thành phần các nucleotide lại làm tăng các lỗi sao chép của polymerase.
- Nồng độ ion Mg
++
cũng là nhân tố ảnh hưởng mạnh đến phản ứng PCR. Nồng
độ tối ưu phải được xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm.

15




2.3.4. Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng PCR
Thiết bị quan trọng nhất dùng cho phương pháp PCR là máy luân nhiệt. Yêu
cầu quan trọng nhất của thiết bị này là việc thay đổi nhiệt độ phải diễn ra nhanh và
chính xác. Ngoài ra, các eppendorf dùng cho phản ứng phải cùng một kiểu.

2.4. Phƣơng pháp RT - PCR
RT-PCR ( reverse transcriptase polymerase chain reaction) là một phương pháp
dùng để khuếch đại cDNA được tạo ra từ RNA dựa vào đặc tính phiên mã ngược. RT-
PCR thường được sử dụng để tạo ra thư viện cDNA lớn từ một lượng rất nhỏ mRNA;
sử dụng trong việc nhận biết các đột biến và đa hình dựa vào những trình tự phiên mã
ngược và sử dụng trong việc định lượng mức độ biểu hiện của gene. Ngoài ra, RT-
PCR còn có một ứng dụng quan trọng nữa đó là chúng được sử dụng trong việc chẩn
đoán các bệnh do virus RNA.

2.4.1 Nguyên tắc của phản ứng RT-PCR
Về nguyên tắc, bước đầu tiên của phản ứng RT-PCR là quá trình phiên mã
ngược từ khuôn mẫu mRNA để tạo ra sợi đơn cDNA. Một primer
oligodeoxynucleotide sẽ gắn vào mRNA và sau đó chúng sẽ được kéo dài nhờ một
enzyme phiên mã ngược có hoạt tính polymerase để tạo thành bản sao cDNA, bản sao
này sau đó sẽ được khuếch đại nhờ vào phản ứng PCR ở bước thứ hai. Tùy thuộc vào
mục đích của xét nghiệm, primer sử dụng để tạo cDNA đầu tiên có thể được thiết kế
đặc hiệu để lai vào một vị trí xác định trên mRNA hay có thể được thiết kế để gắn kết
vào nhiều vị trí trên mRNA

2.4.2. Các enzyme sử dụng cho phiên mã ngƣợc

Sự phát hiện enzyme phiên mã ngược vào năm 1970 đã giải thích tại sao bộ
gene RNA của virus tạo khối u có thể chuyển thành dạng DNA trong tế bào bị nhiễm.
Ngày nay, có ba loại enzyme phiên mã ngược được sử dụng để tổng hợp cDNA
invitro tương ứng với RNA mẫu.
16




Enzyme phiên mã ngược của avian myeloblastosis virus (AMV) và dòng Moloney
của virus murine leukemia (Mo-MLV). Cả hai loại enzyme này đều đòi hỏi primer sử
dụng cho quá trình phiên mã ngược phải có nhóm 3’ OH. Loại enzyme này không có
hoạt tính 3’ – 5’ exonuclease. Khi sử dụng loại enzyme này đòi hỏi trong phản ứng
phải có nồng độ dNTP cao.
- Enzyme được mã hóa bởi AMV, có hoạt tính RNase nên có thể cắt nửa phần
của RNA-DNA và có thể dính chặt vào đầu 3’ của sợi DNA nếu phản ứng phiên mã
ngược bị dừng lại giữa chừng trong quá trình tổng hợp (dẫn liệu từ Rotawicz và cộng
sự,1988).Vì vậy sự hoạt động ở mức độ cao của RNase H cùng với việc phiên mã
ngược có xu hướng ngặn chặn việc tạo ra cDNA và làm giảm chiều dài của nó.
- Enzyme murine phù hợp cho RT-PCR hơn vì hoạt tính RNase của nó yếu
hơn. Tuy nhiên, Mo-MLV sẽ hoạt động tối ưu ở điều kiện nhiệt độ thấp (37
0
C) hơn so
với enzyme AMV (42
0
C), chính đặc điểm này làm cho Mo-MLV không thuận lợi
trong các phản ứng mà RNA có nhiều cấu trúc bậc hai.
Những dạng biến thể của enzyme phiên mã ngược Mo-MLV không có hoạt tính
RNase: nhiều dạng enzyme loại này đã được thương mại hóa, chúng có thể được sử
dụng để biến đổi một lượng mẫu lớn và tổng hợp cDNA dài hơn so với các dòng

hoang dại ( dẫn liệu từ Gerard và cộng sự. 1988). Thêm vào đó, chúng có thể hoạt động
ở nhiệt độ cao (trên 50
0
C), điều này sẽ thuận lợi khi RNA có nhiều cấu trúc bậc hai.
Tth DNA polymerase chịu nhiệt: Loại enzyme này được mã hóa bởi vi khuẩn chịu
nhiệt Thermus thermophilus. Chúng thực hiện phản ứng phiên mã ngược khi có sự
hiện diện của Mn
2+
(Myers và Gelfand, 1991. dẫn liệu). Đặc điểm thuận lợi của loại
enzyme này là ta có thể thực hiện cả hai quá trình của RT-PCR trong cùng một tube
phản ứng . Tuy nhiên loại enzyme này chỉ tổng hợp cDNA có kích thước khoảng từ 1-
2 kb, thêm vào đó việc sử dụng Mn
2+
trong phản ứng sẽ làm cho quá trình tổng hợp
cDNA có độ đặc hiệu thấp. Enzyme Tth không thể cùng sử dụng với primer oligo dT
và random hexamer vì quá trình bắt cặp không thể xảy ra ở điều kiện nhiệt độ mà tại
đó enzyme phiên mã ngược hoạt động.


17




2.4.3 Các primer trong phiên mã ngƣợc
Có ba loại primer thường được sử dụng cho quá trình phiên mã ngược của phản
ứng RT-PCR.
Oligo T (dT): Đây là loại primer được thiết kế dựa vào đặc tính của mRNA là
thường tồn tại đuôi poly A tận cùng ở đầu 3’. Khi thực hiện phản ứng phiên mã ngược,
primer oligo T sẽ gắn kết vào đuôi poly A của mRNA theo nguyên tắc bổ sung. Mồi

oligo T thường được sử dụng như là một “mồi phổ dụng” cho việc tổng hợp ra một
cDNA thông thường.
Oligonucleotide antisense: Primer này sẽ lai lên các vị trí có chọn lọc trên một trình
tự đích đặc biệt của mRNA. Tuy nhiên, khi sử dụng oligonucleotide làm mồi cho quá
trình phiên mã ngược thì cặp primer sử dụng cho phản ứng PCR sau đó cần được thiết
kế sao cho primer trên sợi antisense sẽ bắt cặp ở phía trên đối với vị trí của
oligonucleotide sử dụng làm primer cho việc tổng hợp cDNA.
Random hexanucleotide: Loại primer này thường được sử dụng khi mRNA đích có
kích thước lớn hay có quá nhiều cấu trúc bậc hai. Khi đó việc tổng hợp cDNA không
thể được thực hiện một cách hiệu quả bằng cách sử dụng mồi oligo dT hay mồi
oligonucleotide antisense (Lee và Caskey, 1990, dẫn liệu từ tài liệu tham khảo 13).
Trong đa số các trường hợp sử dụng kỹ thuật RT-PCR những primer
oligonucleotide antisense được thiết kế để gắn kết vào vùng 3’ không dịch mã của
mRNA đích là những primer được ưu tiên chọn lựa. Primer oligo dT là lựa chọn tốt
nhất kế sau và random hexamer là lựa chọn cuối cùng vì random hexamer thường
không đặc hiệu và tạo ra cDNA có kích thước không đồng đều, chúng thường được sử
dụng khi các primer trước sử dụng không thành công.
18