nghiên cứu ứng dụng và hoàn thiện quy trình thu gom, xử lý, bảo quản tế bào gốc tạo máu dùng cho ghép đồng loại

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI




NGUYỄN QUANG TÙNG





NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VÀ HOÀN THIỆN
QUY TRÌNH THU GOM, XỬ LÝ, BẢO QUẢN
TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU
DÙNG CHO GHÉP ĐỒNG LOẠI




LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC

Hà Nội - 2011
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI




NGUYỄN QUANG TÙNG





NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VÀ HOÀN THIỆN
QUY TRÌNH THU GOM, XỬ LÝ, BẢO QUẢN
TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU
DÙNG CHO GHÉP ĐỒNG LOẠI




LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC

Chuyên ngành: Huyết học
Mã số :
62.72.25.01
Hướng dẫn khoa học:
GS. TSKH. Đỗ Trung Phấn






Hà Nội - 201
1


Luận án là sản phẩm đào tạo của Đề tài nghiên cứu khoa học cấp
Bộ Y tế “Nghiên cứu ứng dụng quy trình thu gom, xử lý và bảo
quản tế bào gốc tạo máu sử dụng cho ghép tủy đồng loại” do
GS.TSKH. Đỗ Trung Phấn làm chủ nhiệm.




LỜI CAM ĐOAN


Tôi xin cam đoan những số liệu trong luận án này là công trình
nghiên cứu của tôi, thuộc đề tài cấp Bộ Y tế.
Các số liệu được trình bày trong luận án là trung thực và chưa

từng được công bố trong bất kỳ bản luận án nào.

Tác giả luận án



Nguyễn Quang Tùng


Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận
được sự giúp đỡ to lớn, nhiệt tâm, đầy trách nhiệm và tình cảm của các
Thày, Cô, các bạn đồng nghiệp, bạn bè và gia đình, đặc biệt là những
người tình nguyện tham gia nghiên cứu, những bà mẹ tình nguyện hiến
mẫu máu dây rốn của con mình trong nghiên cứu này. Với tình cảm và
sự biết ơn sâu sắc, tôi xin kính gửi những lời cảm ơn chân thành nhất
đến:
Đảng ủy, Ban giám hiệu Trường đại học Y Hà Nội, đã tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu.
Vụ Khoa học-Đào tạo Bộ Y tế và tập thể các nhà khoa học tham gia
đề tài NCKH cấp Bộ “Nghiên cứu ứng dụng quy trình thu gom, xử lý và
bảo quản tế bào gốc tạo máu sử dụng cho ghép tủy đồng loại” đã không
quản vất vả, hỗ trợ và cùng tôi triển khai các công việc của đề tài đạt kết
quả tốt.
Phòng Quản lý đào tạo sau đại học, Quản lý nghiên cứu khoa học đã
luôn tạo điều kiện thuận lợi, nhắc nhở, động viên tôi trong quá học tập,
nghiên cứu.
Bộ môn Huyết học-Truyền máu trường Đại học Y Hà Nội, những
Thày, Cô, bạn bè đồng nghiệp luôn dành cho tôi sự hỗ trợ tuyệt vời, những
động viên, chia xẻ giúp tôi vượt qua khó khăn để hoàn thành công việc.
Tập thể Viện Huyết học-Truyền máu Trung ương, các Thày, Cô, anh

chị em trong các khoa Miễn dịch-Di truyền, Thu gom, Sản xuất, Sàng lọc,
Tế bào, Đông máu và các khoa Lâm sàng đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để
tôi thực hiện tốt các quy trình kỹ thuật của nghiên cứu.
Tập thể khoa Huyết học, khoa Truyền máu bệnh viện trung ương
quân đội 108 đã tạo điều kiện và trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện nhiều
quy trình kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu.
Tập thể khoa Sản-bệnh viện Bạch Mai, bệnh viện Phụ sản Hà Nội, đã
tạo điều kiện thuận lợi trong việc thu gom các mẫu máu dây rốn.

Tôi xin gửi lời cám ơn sâu sắc nhất đến GS.TSKH. Đỗ Trung Phấn,
người Thày kính mến đã dìu dắt tôi từ những ngày đầu học tập theo chuyên
ngành Huyết học-Truyền máu, đã dành cho tôi những tình cảm tốt đẹp,
những kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
PGS.TS. Phạm Quang Vinh, PGS.TS. Nguyễn Anh Trí – những
người Thày, người Anh đã luôn tạo điều kiện thuận lợi nhất, khuyến khích
và chỉ bảo cho tôi trong công việc, học tập và nghiên cứu.
Xin cám ơn các Thày, Cô, các anh chị em đã dành cho tôi những
đóng góp quý báu trong quá trình thực hiện nghiên cứu và hoàn thiện luận
án này.
Cám ơn gia đình, Cha Mẹ, vợ con thân yêu, anh em ruột thịt, đã luôn
tin tưởng, hy sinh và hỗ trợ không mệt mỏi để tôi có thể tập trung và cố
gắng hoàn thành tốt công việc và nghiên cứu khoa học.
Một lần nữa, xin gửi lời cám ơn sâu sắc nhất tới những người bạn đã
tình nguyện tham gia nghiên cứu, vượt qua cảm giác đau đớn để hiến các
mẫu tế bào gốc từ máu ngoại vi, hiến những mẫu dịch tủy quý giá. Xin cảm
ơn các bà mẹ đã tình nguyện hiến những mẫu máu rốn của đứa con mình
với hy vọng sẽ góp phần nhỏ bé để nâng cao chất lượng điều trị cho người
bệnh.
Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm
Tác giả luận án




Nguyễn Quang Tùng




Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Mục lục
Bảng chữ viết tắt
Danh sách các bảng
Danh sách các đồ thị, biểu đồ và sơ đồ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Khái niệm và xếp loại tế bào gốc 3
1.1.1. Khái niệm về tế bào gốc 3
1.1.2. Xếp loại tế bào gốc 3
1.2. Tế bào gốc trong quá trình tạo máu 9
1.2.1. Đặc điểm tế bào gốc tạo máu 9
1.2.2. Nguồn gốc tế bào gốc tạo máu 10
1.2.3. Các phương pháp xác định tế bào gốc tạo máu 11
1.2.4. Ứng dụng lâm sàng của tế bào gốc tạo máu 14
1.3. Nguồn cung cấp và thu gom tế bào gốc tạo máu 16
1.3.1. Tế bào gốc tạo máu sau huy động ra máu ngoại vi 17

1.3.2. Tế bào gốc tạo máu từ tủy xương 24
1.3.3. Tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn 25
1.3.4. Ứng dụng và lựa chọn các nguồn tế bào gốc tạo máu 26
1.4. Xử lý và bảo quản tế bào gốc tạo máu 28
1.4.1. Xử lý tế bào gốc tạo máu sau thu gom 29
1.4.2. Bảo quản tế bào gốc tạo máu 32
1.4.3. Đánh giá và kiểm tra chất lượng chế phẩm tế bào gốc 34
1.4.4. Ngân hàng tế bào gốc tạo máu 35
1.5. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng tế bào gốc tại Việt Nam 36

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Đối tượng nghiên cứu 39
2.1.1. Các mẫu tế bào gốc thu gom từ máu ngoại vi 39
2.1.2. Các mẫu tế bào gốc thu gom từ tủy xương 40
2.1.3. Các mẫu tế bào gốc thu gom từ máu dây rốn 41
2.2. Phương pháp nghiên cứu 43
2.2.1. Vật liệu nghiên cứu và trang thiết bị, sinh phẩm 43
2.2.2. Tiến hành nghiên cứu 47
2.2.3. Các biến số nghiên cứu 53
2.3. Địa điểm tiến hành nghiên cứu 54
2.4. Xử lý số liệu 54
2.5. Khía cạnh đạo đức của nghiên cứu 55

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3
.1. Kết quả thu gom tế bào gốc tạo máu từ các nguồn khác nhau 56
3.1.1. Kết quả thu gom từ máu ngoại vi 56
3.1.2. Kết quả thu gom từ dịch hút tủy xương 71
3.1.3. Kết quả thu gom từ máu dây rốn 74
3.2. Kết quả xử lý các mẫu sản phẩm tế bào gốc tạo máu 80

3.2.1. Kết quả loại bỏ hồng cầu 80
3.2.2. Kết quả thu hồi tế bào CD34 sau xử lý 84
3.3. Kết quả nghiên cứu bảo quản tế bào gốc tạo máu ở - 196
0
C 87
3.3.1. Số lượng tế bào có nhân sau rã đông 87
3.3.2. Tỷ lệ tế bào sống theo thời gian sau khi rã đông 87
3.4. Đặc điểm tế bào huyết học-miễn dịch và tế bào gốc tạo máu
của các sản phẩm từ các nguồn cung cấp khác nhau
89
3.4.1. Đặc điểm tế bào máu của các sản phẩm 89
3.4.2. Đặc điểm tế bào miễn dịch của các sản phẩm 91
3.4.3. Đặc điểm về tế bào gốc tạo máu của các sản phẩm 92



Chương 4. BÀN LUẬN
4.1. Về quy trình và kết quả thu gom tế bào gốc tạo máu 95
4.1.1. Thu gom tế bào gốc từ máu ngoại vi không huy động 95
4.1.2. Thu gom tế bào gốc từ máu ngoại vi huy động bằng G-CSF 99
4.1.3. Thu gom tế bào gốc từ tủy xương 105
4.1.4. Thu gom tế bào gốc từ máu dây rốn 109
4.2. Về quy trình và kết quả xử lý các mẫu tế bào gốc tạo máu 115
4.2.1. Loại hồng cầu bằng phương pháp ly tâm đơn thuần 116
4.2.2. Loại hồng cầu có sử dụng dung dịch cao phân tử 117
4.2.3. Hiệu quả giảm thể tích mẫu và thu hồi tế bào gốc 120
4.3. Về quy trình và kết quả bảo quản tế bào gốc tạo máu 122
4.3.1. Quy trình bảo quản 122
4.3.2. Kết quả bảo quản và những biến đổi tế bào 123
4.4. Về đặc điểm huyết học, miễn dịch và khả năng tạo máu 125

4.4.1. Một số đặc điểm tế bào máu của các mẫu tế bào gốc 126
4.4.2. Một số đặc điểm tế bào miễn dịch của các mẫu tế bào gốc 128
4.4.3. Tế bào gốc và khả năng tạo máu của các mẫu tế bào gốc 131
KẾT LUẬN 136
KIẾN NGHỊ 138
ĐÓNG GÓP CỦA LUẬN ÁN
Danh mục các bài báo và công trình nghiên cứu
Tài liệu tham khảo
Phụ lục







CHỮ VIẾT TẮT


ACD
Adenosin citrate dextrose
Activated partial thromboplastin time (thời gian hoạt hóa thromboplastin
từng phần)
APTT
ASC
adult stem cells (tế bào gốc người trưởng thành)
BCRP
breast cancer-resistance protein (protein chống ung thư phế quản)
BFU-E
Burst forming unit-erythrocyte (đơn vị tạo ồ ạt hồng cầu)

BMSC
Bone marrow stem cells (tế bào gốc tủy xương)
CBSC
Cord blood stem cells (tế bào gốc máu dây rốn)
CD
Cluster of differenciation (cụm kháng nguyên biệt hóa)
CFC
colony-forming cells (kỹ thuật tạo cụm tế bào)
CFU-G
Colony forming unit-granulocyte (đơn vị tạo cụm dòng bạch cầu hạt)
CFU-
GEMM
Colony forming unit-granulocyte, erythrocyte, monocyte and marcophage
(đơn vị tạo cụm đa dòng)
CFU-S
colony forming unit-spleen (đơn vị tạo cụm lách)
CPD
Citrat-phosphat-dextrose (thành phần của dung dịch bảo quản hồng cầu)
CSC
cancer stem cell (tế bào gốc ung thư)
DLI
Donor lymphocyte infusion (truyền lympho của người cho)
DMSO
Dimethylsulfoxide
E-LTC-IC
Extended-long-term culture-initiating cell
(kỹ thuật nuôi cấy tế bào dài hạn cải tiến)
EPC
endothelial stem/progenitor cell (tế bào gốc/định hướng nội mạc)
ES

embryonic stem cell (tế bào gốc
phôi)
FSC
fetal stem cells (tế bào gốc bào thai)
G-CSF
Granulocyte-colony stimulating factor
(yếu tố kích thích tạo cụm dòng bạch cầu hạt)
GM-CFU
Granulocyte, Monocyte-colony forming unit
(đơn vị tạo cụm dòng bạch cầu hạt và bạch cầu mono)
GM-CSF
Granulocyte, Monocyte-colony stimulating factor
(yếu tố kích thích tạo cụm dòng bạch cầu hạt và bạch cầu mono)
GMP
granulocyte-monocyte precursors (tế bào đầu dòng hạt-mono).
GVHD
Graft versus host disease (bệnh ghép chống chủ)
HGF
hepatocyte growth factor (yếu tố kích thích tế bào gan)

HLA
Human Leukocyte Antigen (kháng nguyên bạch cầu người)
HPC
Hematopoietic proliferation cell (tế bào gốc tăng sinh tạo máu)
HPPCFC
high proliferation potential colony-forming cells
(kỹ thuật tạo cụm các tế bào có khả năng tăng sinh cao)
HSC
hematopoietic stem cells (tế bào gốc tạo máu)
iPS

Induced pluripotent stem cell (tế bào gốc cảm ứng)
LTC-IC
long-term culture-initiating cell (kỹ thuật nuôi cấy tế bào dài hạn)
LT-HSC
long-term hematopoietic stem cell (tế bào gốc sinh máu dài hạn)
LVL
Large volume leukapheresis (tách bạch cầu thể tích lớn)
M-CSF
Macrophage-colony stimulating factor
(yếu tố kích thích tạo cụm dòng
đại thực bào)
MDR1
multidrug-resistance 1 (yếu tố đa kháng thuốc 1)
MEP
megakaryocyte-erythrocyte precursors
(tế bào đầu dòng mẫu tiểu cầu -hồng cầu
MSC
mesenchymal stem cells (tế bào gốc trung mô)
NK
Natural killer cell (tế bào diệt tự nhiên)
PBSC
Peripheral blood stem cell (tế bào gốc máu ngoại vi)
PT
Prothrombin time (thời gian prothrombin)
SCF
stem cell factor (yếu tố tế bào gốc)
ST-HSC
short-term hematopoietic stem cell (tế bào gốc sinh máu ngắn hạn)
TBCN
Tế bào có nhân

TBG
Tế bào gốc
TPO
Thrombopoietin
TT
Thrombin time (thời gian thrombin)
UCSC
Umbilical cord stem cells (tế bào gốc dây rốn)
USSC
Unrestricted somatic stem cell (tế bào gốc đệm biệt hóa không giới hạn)


DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1.
Thể tích và các chỉ số CD34 của các mẫu thu gom từ máu ngoại vi
không huy động
56
Bảng 3.2.
Một số chỉ số huyết học của các mẫu thu gom từ máu ngoại vi
không huy động
57
Bảng 3.3.
Một số chỉ số tế bào miễn dịch của các mẫu thu gom từ máu
ngoại vi không huy động
58
Bảng 3.4.
Các chỉ số tế bào máu trước và sau tách không huy động
59
Bảng 3.5.

Số lượng CD34 thu gom được từ máu ngoại vi sau huy động
62
Bảng 3.6.
63
Hiệu quả thu gom tế bào CD34 sau huy động ra máu
Bảng 3.7.
Thể tích và các chỉ số CD34 của các mẫu thu gom từ máu ngoại vi
không huy động
64
Bảng 3.8.
Một số chỉ số tế bào máu của đơn vị tế bào thu gom từ máu ngoại
vi sau huy động (n= 10)
64
Bảng 3.9.
Một số chỉ số tế bào miễn dịch trong đơn vị tế bào thu gom từ máu
ngoại vi sau huy động.
65
Bảng 3.10.
Thay đổi các chỉ số tế bào máu trong quá trình huy động
66
Bảng 3.11.
Mối tương quan giữa chỉ số CD34 huy động và các thành phần
bạch cầu máu ngoại vi
68
Bảng 3.12.
Biểu hiện lâm sàng trong quá trình huy động và tách tế bào
70
Bảng 3.13.
Các chỉ số đông máu trước và sau khi tách tế bào (n = 10)
70

Bảng 3.14.
Các chỉ số hóa sinh trước và sau khi tách tế bào (n = 10)
71
Bảng 3.15.
Số
lượng tế bào có nhân và CD34 của mẫu tế bào thu gom từ tuỷ
xương
72
72
Bảng 3.16.
Một số chỉ số tế bào máu của mẫu thu gom từ tuỷ xương.
Bảng 3.17.
Số lượng và tỷ lệ % TB MD của mẫu thu gom từ tuỷ xương
73
Bảng 3.18.
Thể tích và các chỉ số tế bào máu của máu dây rốn
74
Bảng 3.19.
Phân bố thể tích mẫu máu dây rốn sau thu gom
75
Bảng 3.20.
Số lượng bạch cầu đơn nhân và CD34 của mẫu máu dây rốn.
75

76
Bảng 3.21.
Một số chỉ số tế bào máu của mẫu máu dây rốn
Bảng 3.22.
Một số chỉ số tế bào miễn dịch của mẫu máu dây rốn
77

Bảng 3.23.
Một số chỉ số lâm sàng của mẹ và trẻ sơ sinh
78
Bảng 3.24.
Liên quan giữa cân nặng trẻ và số lượng tế bào có nhân, tế bào
CD34 thu được từ máu dây rốn
79
Bảng 3.25.
Kết quả xử lý mẫu TB gốc máu ngoại vi sau huy động (n=10)
80
Bảng 3.26.
Kết quả xử lý mẫu dịch tủy bằng hai phương pháp
81
Bảng 3.27.
Kết quả loại hồng cầu và bạch cầu của đơn vị máu dây rốn bằng ly
tâm
83
Bảng 3.28.
Kết quả xử lý máu dây rốn có sử dụng HES
83
Bảng 3.29.
Thể tích và số lượng TB có nhân của đơn vị máu dây rốn trước và
sau xử lý.
84
84
Bảng 3.30.
Kết quả thu hồi CD34 sau xử lý loại huyết tương của mẫu tế bào
gốc máu ngoại vi sau huy động (n=10)
Bảng 3.31.
Kết quả thu hồi CD34 sau xử lý mẫu dịch tủy xương (n = 10)

85
Bảng 3.32.
Kết quả thu hồi tế bào CD34 sau xử lý MDR có sử dụng HES
85
Bảng 3.33.
Tổng hợp kết quả thu hồi CD34 sau quá trình xử lý
85
Bảng 3.34.
Tỷ lệ tế bào sống của các đơn vị tế bào gốc sau bảo quản.
87
Bảng 3.35.
Đặc điểm tế bào máu từ các nguồn cung cấp tế bào gốc
89
Bảng 3.36.
Thành phần bạch cầu của chế phẩm từ các nguồn cung cấp
90
Bảng 3.37.
Các dưới nhóm lympho từ các nguồn cung cấp
91
Bảng 3.38.
Các chỉ số CD34 từ các nguồn cung cấp
92
Bảng 3.39.
Số lượng và loại cụm tế bào
92
Bảng 3.40.
Khả năng tạo cụm của tế bào gốc từ các nguồn cung cấp
94
Bảng 4.1.
So sánh thể tích thu gom máu dây rốn

111
Bảng 4.2.
Kết quả xử lý mẫu máu dây rốn
119
Bảng 4.3.
Hiệu quả thu hồi tế bào đơn nhân và CD34 máu dây rốn
121




DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ, BIỂU ĐỒ VÀ SƠ ĐỒ

Hình 1.1.
Nguồn cung cấp tế bào gốc bào thai 5
Hình 1.2.
Các vị trí thu gom tế bào gốc từ dây rốn 6
Hình 1.3.
Sơ đồ biệt hoá tạo máu 11


Sơ đồ 3.1.
Tóm tắt quy trình xử lý TBG: Giảm HC và thể tích sản phẩm 86
Sơ đồ 3.2.
Tóm tắt quy trình bảo quản tế bào gốc 88


Đồ thị 3.1.
Thay đổi số lượng bạch cầu khi tách không huy động 60
Đồ thị 3.2.

Thay đổi số lượng tiểu cầu khi tách không huy động 60
Đồ thị 3.3.
Thay đổi SLCD34 máu ngoại vi khi huy động bằng G-CSF 61
Đồ thị 3.4.
Thay đổi số lượng bạch cầu ở máu ngoại vi trong quá trình huy
động bằng G-SCF và tách tế bào gốc
67
Đồ thị 3.5.
Thay đổi số lượng tiểu cầu ở máu ngoại vi trong quá trình huy
động bằng G-SCF và tách tế bào gốc
67
Đồ thị 3.6.
Mối tương quan giữa tế bào CD34 với số lượng bạch cầu và bạch
cầu trung gian dòng hạt.
69
Đồ thị 3.7.
Mối tương quan giữa cân nặng trẻ sơ sinh và thể tích máu dây
rốn thu đựoc
79
Đồ thị 4.1.
Mối tương quan giữa số lượng CD34 ở máu ngoại vi và trong
sản phẩm sau thu gom
101
Đồ thị 4.2.
Tỷ lệ tế bào chết theo thời gian bảo quản 123
Đồ thị 4.3.
Tỷ lệ tế bào sống sau khi phá đông ở các điều kiện nhiệt độ 124


Biểu đồ 3.1.

Tỷ lệ tế bào chết theo thời gian sau khi rã đông 87
Biểu đồ 3.2
Tỷ lệ các loại cụm tế bào tạo thành từ các nguồn cung cấp 93



1
ĐẶT VẤN ĐỀ

Ghép tế bào gốc tạo máu là phương pháp điều trị hiện đại, có hiệu
quả đối với các bệnh lý cơ quan tạo máu và một số bệnh lý khác. Nguồn tế
bào để sử dụng cho ghép chủ yếu được thu gom từ tuỷ xương, từ máu ngoại
vi sau khi kích thích và từ máu dây rốn.
Ghép tế bào gốc đồng loại (allograft) là quá trình truyền tế bào gốc từ
người cho (có hoặc không có mối quan hệ huyết thống) nhằm tái lập khả
năng tạo máu ở người bệnh. Phương pháp này thường được áp dụng trong
những bệnh lý: Lơxêmi cấp dòng tuỷ, lơxêmi cấp dòng lympho, suy giảm
miễn dịch nặng, suy tuỷ xương, bệnh lý huyết sắc tố, bệnh hồng cầu hình
liềm do mô tạo máu bị tổn thương nặng nề, không có khả năng tự hồi phục.
Quá trình ghép có thể được tiến hành sau điều trị làm giảm khối tế bào ung
thư và tạo điều kiện cho các tế bào ghép có thể mọc được dễ dàng (quá trình
điều kiện hoá). Thời gian mọc ghép và khả năng duy trì tạo máu dài hạn phụ
thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó sự khác nhau về đặc điểm của các tế bào gốc
tạo máu giữa các nguồn cung cấp có vai trò quan trọng.
Bên cạnh tác dụng hồi phục mô tạo máu, gần đây, hiệu quả hồi phục
và duy trì khả năng miễn dịch của cơ thể nhận ghép đã được chứng minh và
ứng dụng trên lâm sàng. Các tế bào có thẩm quyền miễn dịch, có trong chế
phẩm tế bào gốc hoặc được biệt hóa từ các tế bào gốc của người cho, sau khi
truyền vào cơ thể nhận là thành phần chủ yếu của phản ứng ghép chống chủ
nhưng đồng thời là phản ứng ghép chống ung thư/lơxêmi. Các tế bào miễn

dịch này sẽ “nhận diện” các tế bào ung thư của người bệnh và gây đáp ứng
miễn dịch nhằm “diệt” các tế bào này. Kết quả của phản ứng ghép chống ung
thư sẽ giúp kéo dài thời gian sống thêm không bệnh của người nhận ghép.
Từ những nguồn cung cấp chủ yếu, quá trình thu gom, xử lý và bảo
quản các tế bào gốc đòi hỏi những quy trình kỹ thuật khác nhau. Hiệu quả thu
được những chế phẩm tế bào gốc mang những đặc điểm sinh học cũng khác
nhau không những về mặt thành phần, số lượng tế bào gốc tạo máu mà còn


2
Hiện tại ở Việt Nam, phương pháp ghép tế bào gốc tạo máu đã được
triển khai từ nhiều năm tại một số trung tâm trong cả nước, tuy nhiên các
công trình nghiên cứu công bố về quy trình thu gom, xử lý và bảo quản dài
hạn các mẫu tế bào gốc tạo máu từ các nguồn cung cấp chủ yếu còn ít và
chưa hệ thống. Xuất phát từ thực tế này, đề tài “Nghiên cứu ứng dụng và
hoàn thiện quy trình thu gom, xử lý, bảo quản tế bào gốc tạo máu dùng
cho ghép đồng loại” được tiến hành với các mục tiêu:

1.
Ứng dụng và hoàn thiện quy trình thu gom, xử lý và bảo quản dài
ngày tế bào gốc tạo máu từ máu ngoại vi, dịch tủy xương và máu dây
rốn.
2.
Đánh giá khả năng tạo cụm của tế bào gốc tạo máu và đặc điểm tế bào
miễn dịch của các mẫu tế bào gốc từ máu ngoại vi, dịch tủy xương và
máu dây rốn



3

Chương 1. TỔNG QUAN

1.1.
KHÁI NIỆM VÀ XẾP LOẠI TẾ BÀO GỐC
1.1.1. Khái niệm về tế bào gốc
Đặc điểm cơ bản của tế bào gốc là khả năng tự tái tạo (self-renewal)
và biệt hoá thành các dòng tế bào trưởng thành. Thực nghiệm đầu tiên của
McCulloch và Till [158] vào những năm 1960 trên chuột đã xác định những
đặc điểm này ở một quần thể tế bào, được đặt tên là đơn vị tạo cụm lách
(CFU-S) và sau này được chứng minh là các tế bào gốc tạo máu (HSC). Về
lý thuyết, hiện tại có nhiều cách xếp loại tế bào gốc dựa vào các đặc điểm cơ
bản khác nhau: khả năng biệt hoá, thời điểm có thể thu gom được trong quá
trình hình thành và phát triển cá thể, theo chức năng và mô đích
[13],[25],[103].
1.1.2. Xếp loại tế bào gốc
1.1.2.1. Xếp loại theo khả năng tăng sinh và biệt hoá:
− Tế bào gốc toàn năng (totipotent): Có khả năng biệt hoá thành mọi dòng
tế bào của một cơ thể. Về lý thuyết, từ một tế bào gốc có thể hình thành
một cơ thể hoàn chỉnh nếu được phát triển trong môi trường cơ thể mẹ.
− Tế bào gốc vạn tiềm năng (pluripotent) hay tế bào gôc đa tiềm năng
(multipotent): Có khả năng biệt hoá thành nhiều loại tế bào khác nhau
của các mô trong cơ thể nhưng không thể hình thành một cơ thể hoàn
chỉnh.
− Tế bào gốc đơn tiềm năng (unipotent): Chỉ còn khả năng biệt hoá thành
các tế bào trưởng thành trong một mô xác định.
1.1.2.2. Xếp loại theo quá trình phát triển cá thể:
Dựa vào thời điểm có thể phân lập được trong quá trình phát triển cá
thể tế bào gốc được xếp thành 3 loại: tế bào gốc phôi (ES), tế bào gốc bào
thai (FSC) và tế bào gốc trưởng thành (ASC) [146]. Một số tác giả còn xếp

4
Tế bào gốc phôi (ES) được nghiên cứu từ vài chục năm trở lại đây
[63],[168]. Trong môi trường nuôi cấy in vitro, các tế bào này phân chia
không ngừng nhưng vẫn bảo tồn được khả năng biệt hoá in vitro và in
vivo. Được thu thập từ giai đoạn rất sớm trong quá trình hình thành cá thể,
các tế bào này có khả năng biến đổi thành mọi dòng tế bào của cả ba lá
phôi, đặc biệt các tế bào có khả năng ứng dụng quan trọng trên lâm sàng
là các neuron thần kinh và các tế bào beta ở tiểu đảo Langerhans tiết
insuline của tuyến tuỵ nội tiết.
−
Tế bào gốc bào thai (FSC) có thể được thu thập từ chính bào thai hay các
thành phần phụ của bào thai (bánh rau, dây rốn ). Đây là nguồn cung
cấp tế bào gốc rất phong phú và thực sự mang nhiều hứa hẹn cho ngành y
học tái tạo [1],[96],[100]. Được nghiên cứu đầu tiên và nhiều nhất trong
nhóm này chính là các tế bào gốc tạo máu thu gom từ máu rốn. Các tế bào
này thể hiện khả năng biệt hoá dài hạn thành tế bào trưởng thành của tất
cả các dòng tế bào máu và trường hợp ghép tế bào gốc máu rốn đầu tiên
đã được tiến hành thành công vào năm 1988 [62]. Đặc biệt trong khoảng
10 năm trở lại đây, hướng nghiên cứu tập trung vào việc xác định, phân
lập và nuôi cấy biệt hoá các tế bào gốc từ các thành phần phụ của bào thai
như dây rốn, bánh rau, màng ối và dịch ối (Hình 1.1). Các tế bào gốc thu
thập từ những cấu trúc này có khả năng biệt hóa đa dạng thành những tế
bào của cả ba lá phôi là tế bào mỡ, tế bào xương, sụn, tế bào cơ, cơ tim và
các neuron thần kinh trong điều kiện nuôi cấy có bổ sung những yếu tố
kích thích thích hợp. Từ những vị trí khác nhau có thể thu được những
quần thể tế bào gốc sau:
−

Màng ối

RDịch ối
D
â
yr
ố
n

5













+ Tế bào gốc từ máu dây rốn (CBSC): Được thu gom từ nguồn máu dây
rốn. Bên cạnh quần thể tế bào gốc tạo máu còn có nhiều loại tế bào gốc
khác như tế bào định hướng nội mạc (EPC), tế bào gốc trung mô
(MSC) [33],[126].
+ Tế bào gốc từ mô dây rốn (UCSC): Được thu thập từ những vùng giải
phẫu khác nhau của dây rốn, đều thể hiện khả năng của tế bào gốc điển
hình, với khả năng biệt hoá đa dạng ở các mức độ khác nhau (Hình 1.2).
Trong đó quần thể tế bào gốc có khả năng biệt hoá không giới hạn
(USSC) có thể biệt hoá thành các nguyên bào xương, nguyên bào sụn,

các tế bào mô mỡ, các tế bào thần kinh (cả neuron và tế bào thần kinh
đệm) và tế bào tạo máu cũng đã được xác định trên thực nghiệm
[22],[41],[112].
+ Tế bào gốc thu gom từ các cấu trúc khác: Gan phôi, bánh rau, màng ối
và dịch ối [107],[166]



6
Vùng ngoại mạch
Máu rốn
Nội mô tĩnh mạch
Màng lót
Vùng gian mạch
Dưới màng lót
Hình 1.2. Các vị trí thu gom tế bào gốc từ dây rốn [100]










− Tế bào gốc trưởng thành (ASC) được thu thập từ cá thể trưởng thành.
Nhóm tế bào gốc này lại được xếp loại dựa vào nguồn cung cấp.
− Tế bào gốc trưởng thành (ASC) được thu thập từ cá thể trưởng thành.
Nhóm tế bào gốc này lại được xếp loại dựa vào nguồn cung cấp.

+ Tế bào gốc từ tuỷ xương+ Tế bào gốc từ tuỷ xương (BMSC): Là nguồn cung cấp tế bào gốc cho
những trường hợp ghép đầu tiên và rất phổ biến [84]. Tế bào gốc tạo
máu cũng có những dưới nhóm với đặc điểm khác nhau như quần thể
tế bào có khả năng tạo máu dài hạn (LT-HSC) và ngắn hạn (ST-HSC)
có khả năng hồi phục mô tạo máu rất khác nhau khi được ghép vào cơ
thể nhận [102], [129].
Tế bào gốc máu ngoại vi (PBSC): Được thu gom bằng các máy tách
tế bào sau khi huy động ra máu bằng các cytokine đơn thuần hay kết
hợp, hoặc cùng với hoá trị liệu. Hiện nay, nguồn tế bào gốc này được
sử dụng cho hầu hết các trường hợp ghép tự thân thay cho nguồn tế
bào gốc từ tuỷ xương và dần được sử dụng phổ biến hơn để ghép
đồng loại. Kết quả cho thấy thời gian mọc ghép sớm hơn, khả năng
miễn dịch được phục hồi nhanh hơn, tỷ lệ tử vong liên quan đến ghép
thấp hơn, nguy cơ xuất hiện ghép chống chủ tương đương, tuy nhiên
tỷ lệ ghép chống chủ mạn tính cao hơn so với sử dụng nguồn tế bào
gốc từ tuỷ xương [23],[131],[132].
+

7
+ Tế bào gốc sau khuếch đại ngoài cơ thể (Ex vivo expension): Sử
dụng biện pháp kỹ thuật nuôi cấy ngoài cơ thể trong môi trường lỏng,
có cung cấp đầy đủ các yếu tố kích thích tạo máu, các quần thể tế bào
gốc được nhân lên nhằm đáp ứng đủ lượng tế bào cần cho ghép trên
lâm sàng. Tuy nhiên, đây không phải là một giải pháp được lựa chọn
hàng đầu vì giá thành đắt, đòi hỏi trang thiết bị nuôi cấy hiện đại và
trong điều kiện vô khuẩn tuyệt đối. Mặt khác, do phát triển ngoài cơ
thể nên quá trình biến đổi tế bào ở mức phân tử còn chưa được nghiên
cứu kỹ, do vậy việc truyền loại tế bào này trở lại cơ thể người bệnh
vẫn đang được cân nhắc [48],[70],[94],[98].
+ Tế bào gốc cảm ứng (iPS): Được tạo thành qua việc tác động thay đổi

lại chương trình biệt hoá (reprogramming) của tế bào sinh dưỡng
bằng cách đưa vào nhân tế bào đó các gen thích hợp (Oct3/4, Sox2,
Klf4 và c-Myc). Đây là thành tựu mới nhất trong nghiên cứu và ứng
dụng tế bào gốc hiện nay. Các tế bào gốc cảm ứng iPS mang những
đặc điểm về hình thái, biểu hiện các dấu ấn màng, dữ liệu gen (gene
expression profile), khả năng tăng sinh và biệt hoá không giới hạn
tương tự như các tế bào gốc phôi. Các nghiên cứu được công bố từ
năm 2007 đã thu được kết quả tạo tế bào gốc vạn tiềm năng từ
nguyên bào xơ, nguyên bào nội mạc [152],[170].
1.1.2.3. Xếp loại theo mô đích và chức năng biệt hoá
Dựa vào khả năng phân lập được từ mô cụ thể, cũng như khả năng
định hướng biệt hoá đến các tế bào trưởng thành của mô đích đặc trưng để
xếp loại và định danh các tế bào gốc đặc hiệu mô (tissue-specific stem cells).
Các công trình nghiên cứu về tế bào gốc sớm nhất được công bố là các tế bào
gốc tạo máu. Về lý thuyết của sự phát triển, cơ thể của mọi cá thể luôn luôn
đổi mới. Trong những điều kiện sinh lý bình thường và cả trong các điều kiện
bệnh lý. Trong điều kiện sinh lý, quá trình tái tạo và đổi mới mô đích là nhờ

8
+ Tế bào gốc đệm từ tuỷ xương (Bone marrow-derived stroma stem
cells) có đa tiềm năng biệt hoá [26],[73].
+ Tế bào gốc đệm khác: Thu gom từ máu ngoại vi huy động, từ máu
dây rốn [75],[126].
+ Tế bào gốc biệt hoá từ mô mỡ (Adipose tissue-derived stem cells):
có khả năng biệt hoá thành các tế bào xương, sụn, tế bào gan hay các
neuron thần kinh [175].
+ Tế bào gốc biệt hoá từ da (Skin-derived precursor stem cells): có
khả năng biệt hoá thành các neuron thần kinh và các tế bào Schawnn
[173].
Trong từng mô, những quần thể tế bào mang đặc điểm đặc trưng của

tế bào gốc cũng đã và đang được xác định [118],[140].
Tế bào gốc ung thư (CSC): Gần đây, một số nghiên cứu về bệnh lý ác tính
cơ quan tạo máu và ung thư đã tập trung chứng minh giả thiết về Theo lý
thuyết này, sở dĩ các khối u có thể tồn tại và phát triển là nhờ khả năng tự tái
tạo (self-renewal) của một quần thể tế bào trong khối u và đó chính là các tế
bào gốc ung thư. Các nghiên cứu đang tập trung chứng minh và xác định
quần thể tế bào gốc đặc hiệu này, đồng thời xác định các đặc trưng để làm cơ
sở cho các phương pháp điều trị nhắm đích (target therapy) (Hình 1.3) với hy
vọng có thể kiểm soát được khả năng phát triển của khối u và có thể điều trị
khỏi bệnh hoàn toàn [90],[114],[127],[155].





9
1.2. TẾ BÀO GỐC TRONG QUÁ TRÌNH TẠO MÁU
1.2.1. Đặc điểm tế bào gốc tạo máu
Đặc trưng của tế bào gốc tạo máu là khả năng tự tái tạo, biệt hoá thành
các dòng tế bào máu trưởng thành và có thể tái tạo mô tạo máu thực nghiệm
trên động vật sau khi chiếu xạ liều chí tử. Tỷ lệ tế bào gốc thường rất thấp,
khoảng 1 tế bào trong tổng số từ 10.000 đến 1.000.000 tế bào tuỷ xương và
hầu hết ở trạng thái nghỉ, không phân bào [42]. Trong một số tình huống nhất
định, như nhiễm khuẩn, chảy máu cấp tính hoặc điều trị hoá chất các tế bào
gốc sẽ nhanh chóng tăng sinh. Tình trạng rối loạn quá trình tạo máu cũng có
thể gặp trong các bệnh lý như lơxêmi, bệnh tăng sinh tuỷ hoặc giảm sinh tuỷ.
Do vậy, tế bào gốc tạo máu được định nghĩa dựa trên ba đặc trưng cơ bản,
đó là khả năng tự tái tạo, khả năng biệt hoá đa dòng và khả năng phục hồi
mô tạo máu [138]. Ngoài ra còn một số đặc điểm khác như khả năng di
chuyển từ tủy ra máu, tính mềm dẻo (plasticity) trong biệt hóa và chết theo

chương trình.
a.
Khả năng tự tái tạo
Bằng chứng rõ ràng về khả năng tự tái tạo của các tế bào gốc là việc
cung cấp liên tục các tế bào máu trong suốt cuộc đời của một cá thể. Khả
năng này liên quan chặt chẽ với hoạt tính của enzym tổng hợp chuỗi có khả
năng tổng hợp của chuỗi DNA mới bằng cách rút ngắn độ dài chuỗi DNA
trong quá trình phân chia tế bào (telomerase). Ở người, thời gian tổng hợp
chuỗi DNA rất ngắn trong quá trình phân bào của tế bào gốc, đặc biệt khi bị
tác động mạnh (stress) như trong quá trình ghép [50],[110].
b.
Khả năng biệt hoá đa dòng
Tế bào gốc tạo máu có khả năng biệt hoá thành tất cả các dòng tế bào
máu, ban đầu tạo ra các tế bào định hướng dòng: dòng tuỷ và dòng lympho.
Các tế bào định hướng dòng lympho sẽ phân chia và biệt hoá thành các dòng
lympho T, B và NK. Các tế bào gốc định hướng dòng tuỷ sẽ phân chia và biệt

10
Các nghiên cứu gần đây nhất lại cho thấy các tế bào định hướng dòng
dưới sự kích thích đặc hiệu của các cytokine có thể chuyển đổi lẫn nhau từ
dòng tuỷ sang dòng lympho và ngược lại [138], [141].
c.
Khả năng phục hồi mô tạo máu
Các y văn sớm nhất đã công bố về khả năng phục hồi mô tạo máu của
tế bào gốc dựa trên nghiên cứu thực nghiệm ghép trên chuột sau chiếu xạ liều
chí tử. Tương tự như vậy, các tế bào gốc ở người cũng đặc trưng bởi đặc tính
có thể quay trở lại tuỷ xương và tái tạo mô tạo máu trong mô hình ghép dị
loài thực nghiệm. Sau khi trở lại cư trú tại tuỷ xương (homing), các tế bào
gốc tạo máu tăng sinh và biệt hoá, đáp ứng những tín hiệu kích thích từ môi
trường đệm gian bào (extracellular matrix) [43].

1.2.2. Nguồn gốc tế bào gốc tạo máu
Quá trình tạo máu được hình thành và tiến hóa từ ếch, cá ngựa đến
động vật có vú, kể cả chuột và ở người. Tuy nhiên, quá trình hình thành tế
bào gốc tạo máu và quá trình tạo máu nguyên phát trong thời kỳ bào thai ở
người còn chưa được chứng minh rõ ràng. Từ trung bì phôi, sau quá trình tạo
máu nguyên phát ngắn ngủi là quá trình tạo máu thứ phát. Sau đó, các tế bào
gốc mở rộng phạm vi cư trú đến gan và lách của bào thai (ở động vật có vú)
và thận (ở cá ngựa) và bắt đầu biệt hoá thành các dòng tế bào máu. Trong giai
đoạn cuối của thai kỳ, các tế bào gốc di cư xa hơn đến tuỷ xương ở động vật
có vú và cư trú lâu dài tại đây.
Hiện tượng di chuyển tự nhiên của các tế bào gốc trong quá trình phát
triển phôi thai cũng có thể giúp giải thích được sự tồn tại của chúng tại các
mô không tạo máu ở người trưởng thành. Chỉ khi đến cư trú tại tuỷ
xương-với vi môi trường tạo máu lý tưởng-các tế bào gốc mới phát huy được

11
Copyright © 2005 Elsevier Inc. (USA) All rights reserved.
Figure 17-01
Hình 1.3. Sơ đồ biệt hoá tạo máu [102]
Tiểu cầu

Hồng cầu

Bạch cầu hạt

Monocyte
Định hướng
dòng lympho
Định hướng
dòng tuỷ

T lympho

B lympho

NK













1.2.3. Các phương pháp xác định tế bào gốc tạo máu
Các nghiên cứu về tế bào gốc tạo máu thường gặp phải khó khăn vì
chúng phân bố rất rải rác trong các mô tạo máu và không có các dấu ấn đặc
trưng hay các kỹ thuật đặc hiệu hoàn toàn để xác định chính xác tế bào gốc
tạo máu. Hầu hết các nghiên cứu đều sử dụng một tập hợp nhiều phương
pháp để xác định và phân lập tế bào gốc, bao gồm: xác định dấu ấn màng tế
bào, nhuộm loại trừ, nuôi cấy in vitro, đếm tế bào gốc trong ghép và phương
pháp thực nghiệm trên linh trưởng.
a. Phương pháp xác định dấu ấn màng tế bào
Cho đến nay, chưa có một dấu ấn nào được cho là đặc trưng để xác
định chính xác tế bào gốc tạo máu ở người. Các tế bào gốc tạo máu là những
tế bào mang dấu ấn CD34

+
hay không mang dấu ấn CD34 ? [49]. Thực