Luận văn : Thu thập dịch tiết từ Fasciola gigantica và sử dụng làm kháng nguyên trong chẩn đoán part 5 pot

37




PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1 Kết luận
Sau khi thu thập dịch tiết từ Fasciola gigantica và xác định nồng độ
protein trong dịch tiết bằng phương pháp Bradford, ta thu được xấp
xỉ 6,5 mg protein tiết/ 1 con sán/ 24 giờ.
Dịch tiết của sán lá gan lớn chứa những thành phần protein trội có
trọng lượng phân tử trong khoảng từ 27-29 kDa.
Đặc tính kháng nguyên tiết trong thành phần protein này đặc hiệu
hơn so với kháng nguyên thân của Fasciola sp nên có thể sử dụng để
chẩn đoán bệnh sán lá gan lớn ở người chính xác hơn.
Với protein tiết, một giá sắc ký ái lực đã được thực hiện. Giá sắc ký
này đã cho phép tinh chế từ huyết thanh bệnh nhân kháng thể (IgG),
đặc hiệu với protein tiết của sán.
Các kháng thể này đã được sử dụng để thực hiện một hệ thống thử
nghiệm miễn dịch cộng hợp enzyme (ELISA) để sử dụng trong chẩn
đoán.

5.2 Đề nghị
Gia tăng độ nhạy của phản ứng ELISA. Sử dụng kháng nguyên tiết để
phát hiện kháng thể trong huyết thanh bệnh nhân nhiễm Fasciola sp.
Thử nghiệm phát hiện kháng nguyên tiết trong phân bệnh nhân.
Xác định lại hoạt tính và tinh chế enzyme cystein-protease trong dịch
tiết của sán lá gan lớn.
Trên cơ sở đó ứng dụng những kỹ thuật phân tử để nghiên cứu những
đặc tính của enzyme trong mục đích chẩn đoán và điều chế vaccine

chống sán lá gan lớn.



38






PHẦN 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO

Phần tiếng Việt

1. Trần Thị Kim Dung. Chẩn đoán một số bệnh ký sinh trùng bằng phương pháp
huyết thanh miễn dịch men. Chuyên ngành Ký Sinh Trùng học. Luận án Tiến sĩ
khoa học Y Dược. Trường đại học Y Dược TP HCM, 1995.
2. Trần Thị Kim Dung, Trần Vinh Hiển, và Phan Anh Tuấn. Chẩn đoán bệnh sán
lá lớn ở gan Fasciola gigantica bằng phương pháp huyết thanh miễn dịch
ELISA và huỳnh quang. Tạp chí Y học Đại học Y Dược TP HCM. Công trình
nghiên cứu khoa học, trang 201-204, 1994.
3. Trần Vinh Hiển, Trần Thị Kim Dung, Nguyễn Hữu Chí, Phan Hữu Danh, Phạm
Thị Hạnh. Bệnh do sán lá lớn ở gan Fasciola sp trên người tại Việt Nam. Tạp
chí Y học Đại học Y Dược TP HCM. Số đặc biệt chuyên đề Ký Sinh Trùng. Phụ
bản của tập 5, số 1, trang 75-78, 2001.
4. Phan Địch Lân. Bệnh sán lá gan trâu bò do Fasciola gigantica ở phía Bắc Việt
Nam. Luận án Phó tiến sĩ thú y. H. Bộ Nông Nghiệp, 1980.

Phần tiếng nƣớc ngoài

5. A.Y. SHEHAB et al, 1999. Serogiagnosis and assessment of antigens in the
sera of patients with fascioliasis by IELISA.Tropical Medicine and
International Health Volume 4, N
0
10; pp 686 – 690. Medical Research
Institute, University of Alexandria, Egypt.
6. B. GÖNEç. H. O. SARIMEHMETOĞLU. M. KARA. F. KIRCALI, 2003. Comparison
of Crude and Excretory/Secretory Antigens for the Diagnosis of Fasciola hepatica in
Sheep by Western Blotting. Turk J Vet Anim Sci. 28 (2004) 943-949, Turkey.
39




7. Bradford, M.M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding. A
ral. Biochem. 72: 248-254.
8. Peter R.Collins, Colin M. Stack et al, 2004. Cathepsin L1, the Major Protease Involved in
Live Fluke (Fasciola hepatica) Virulence. The Journal of Biological Chemistry Vol. 279,
N
o
. 17, Issue of April 23, pp 17038-17046, USA.
9. Cooper, Terrance G.(1977). The tools of Biochemistry. John Willey and Sons,
Interscience publication, United State of America. pp 36-307.
10. John P. Dalton, Sharon J. Andrew. Induction of protective immunity in cattle
against infection with Fasciola hepatica by vaccination with cathepsin L
proteinase and with Hemoglobin. Infection and Immunity, Dec. 1996, pp 5066-
5074. United Kingdom.
11. ESPINO et al. Dynamics of Antigenemia and Coproantigens during a human

Fasciola hepatica Outbreak. Journal of Clinical Microbiology, Sept. 1998, pp
2723 – 2726. Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kouri”, Ciudad de La
Habana, Cuba.
12. ESPINO et al, 1990. Detection of Circulating Excretory Secretory Antigens in
Human Fascioliasis by Sandwich Enzyme- Linked Immunosorbent Assay.
Jounal of clinical microbiology, pp 2637-2640. Instituto Medicina Tropical
“Pedor Kouri” Apartado 601 Zona 13, Havana, Cuba
13. Louis Nguyen Anh Van (1985). Essai d’enseignement des cycles parasitaires
par le graphisme. Thèse pour le Doctorat en Médecine. Université de Paris.
Sud. p28.
14. Ortiz, P.L. Claxton. J. R Clarkson, M.J. Mc Garry, J. Williams, D.J. L . The
specificity of antibody responses in cattle naturally exposed to Fasciola
hepatica. Vet. Parasit 2000:93:121:124.




40




Internet
15.
16.
17.
18.

41






PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Môi trƣờng nuôi sán lá gan Fasciola gigantica để thu đƣợc kháng nguyên tiết
Môi trường RPMI 1640 1X (104,3 g/10 lít) bổ sung 2g NaHCO
3
/1lít
Thành phần
Đơn vị (mg/l)

Ca(NO
3
)
2
.4H
2
O
KCl
MgSO
4
(anhydrid)
NaCl
Na
2
HPO
4
(anhydrid)
D-Glucose
Glutathione
Rouge de Phénol
L-Arginine HCl
L-Asparagine
Acide L-Aspartique
L-Cystine. 2HCl
Acide L-Glutamique
L-Glutamine
Glycine
L-Histidine
L-Hydroxyproline
L-Isoleucine

L-Leucine
L-Lysine HCl
L-Méthionine
L-Phénylalanine
100,00
400,00
48,84
6000,00
800,00
2000,00
1,00
5,00
241,86
50,00
20,00
65,15
20,00
300,00
10,00
15,00
20,00
50,00
50,00
40,00
15,00
15,00
42

L-Proline
L-Sérine
L-Thréonine
L-Tryptophane
L-Tyrosine
L-Valine
D-Biotine
Pantothénate de Calcium D
Chlorure de Choline
Acide Folique
i-Inositol
Nicotinamide
Acid Para-aminobenzoique
Pyridoxal HCl
Riboflavine
Thiamine HCl
Vitamine B
12

20,00
30,00
20,00
5,00
20,00
20,00
0,20
0,25
3,00
1,00

35,00
1,00
1,00
1,00
0,20
1,00
0,005

(Theo Catalogue 1996-97 Culture Cellulaire – Hãng Gibco BRL. Code 51800 –
035. Produced in U. K by life Technologies LTD, P. O. Box 35 PAISLEY).
Pha 500 ml môi trường RPMI 1640 1X (m = 5,215g + 1g NaHCO
3
).
Chỉnh pH = 7,3 bằng HCl đặc.
Bổ sung 300 µl Penicillin 1000000U (nồng độ 200 000 U / 1 ml).
Thêm vào 300 µl Streptomycin 1000000 µg (nồng độ 200 mg / 1 ml).
Cho dung dịch qua lọc vô trùng 0,22 µm để khử trùng.
Phân phối đều vào các ống nghiệm, mỗi ống 5 ml giữ trong 4
0
C.
Tất cả các thao tác đều thực hiện trong điều kiện vô trùng.



43

Hình - Các ống nghiệm chứa môi trƣờng RPMI 1640 dùng để nuôi sán bên ngoài vật chủ

Phụ lục 2: Hình cột sắc ký ái lực để tinh chế kháng thể đặc hiệu với kháng
nguyên tiết của sán lá gan lớn

44





Phụ lục 3: Máy đo quang phổ hấp thụ Spectrophotometer U 3310 Hitachi (Japan)



Phụ lục 4: Máy đọc Elisa Sanofi PR 2100, Diagnostics Pasteur

45




Phụ lục 5: Các giếng thực hiện phản ứng ELISA để phát hiện kháng nguyên tiết
trong huyết thanh của bệnh nhân