Thu thập dịch tiết từ Fasciola gigantica và sử dụng làm kháng nguyên trong chẩn đoán (Mục lục)

LỜI CẢM ƠN
Với tất cả lòng thành, đời đời nhớ ơn công lao sinh thành, dưỡng dục và tất cả
những gì ba mẹ đã dành cho con để con có được như ngày hôm nay.
Với tất cả lòng kính trọng, em xin cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học
Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học,
cùng tất cả Quý Thầy Cô đã giảng dạy và truyền thụ kiến thức cho em trong suốt bốn
năm học qua.
Con xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến PGS. TSKH. Nguyễn
Lê Trang - người thầy hết sức tận tâm hướng dẫn, dạy dỗ, động viên và tạo mọi điều
kiện thuận lợi cho con trong suốt thời gian học tập và làm khóa luận tại Viện Pasteur.
Em xin chân thành cảm ơn TSKH. Nguyễn Ngọc Hải - Giảng viên Khoa Chăn
Nuôi - Thú Y đã tạo điều kiện và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn Ths. Nguyễn Thị Nguyệt Thu, CN Đỗ Thị Châm,
CN Võ Thị Mỹ Duyên, chị Thêm, chị Sim và đặc biệt là CN Dương Ngọc Diễm
phòng Miễn Dịch, Viện Pasteur đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn và động viên ủng hộ
tinh thần cho em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.
Trong lúc thực hiện đề tài này, chúng tôi có được sự giúp đỡ rất tận tình của
GS. BS Trần Vinh Hiển và PGS. TS Trần Thị Kim Dung, Bộ môn Ký Sinh Trùng đại
học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh.
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Đốc Viện Pasteur - Thành phố Hồ Chí
Minh đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập và nghiên cứu tại Viện.
Tôi xin cảm ơn các bạn lớp DH01SH - Trường Đại học Nông Lâm Thành phố
Hồ Chí Minh đã gắn bó và giúp đỡ tôi trong suốt bốn năm học qua.
SV: Nguyễn Thị Quỳnh Nga.
ii
iii
TÓM TẮT KHÓA LUẬN
NGUYỄN THỊ QUỲNH NGA, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005.
“THU THẬP DỊCH TIẾT TỪ FASCIOLA GIGANTICA VÀ SỬ DỤNG LÀM
KHÁNG NGUYÊN TRONG CHẨN ĐOÁN”.
Hội đồng hướng dẫn:

PGS.TSKH NGUYỄN LÊ TRANG
TSKH. NGUYỄN NGỌC HẢI
Bệnh sán lá gán lớn ở trâu bò và các động vật nhai lại khác như dê, cừu là một
trong những nguyên nhân gây tổn thất kinh tế trong ngành công nghiệp chăn nuôi.
Ngoài ra, bệnh còn gặp ở người với những triệu chứng lâm sàng không rõ ràng nên
gây khó khăn trong việc chẩn đoán và điều trị bệnh. Trước những yêu cầu cấp thiết
như vậy, được sự đồng ý của Viện Pasteur TPHCM và trường đại học Nông Lâm
TPHCM, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Thu thập dịch tiết từ Fasciola
gigantica và sử dụng làm kháng nguyên trong chẩn đoán”
Các kết quả thu được:
• Số lượng sán thu thập cho nghiên cứu là 17 con và 80 ml dịch tiết.
• Xác định được nồng độ protein trong dịch tiết của sán lá gan lớn bằng
phương pháp Bradford.
• Xác định được thành phần protein trong dịch tiết bằng phương pháp
điện di SDS-PAGE 12%.
• Dùng phương pháp Ouchterlony, sử dụng protein tiết từ sán làm kháng
nguyên, phát hiện kháng thể ở huyết thanh bệnh nhân.
• Tạo giá sắc ký ái lực Sepharose 4B – protein(s) tiết để tinh chế kháng
thể đặc hiệu ở huyết thanh người nhiễm sán Fasciola sp.
• Tinh chế kháng thể kháng Fasciola sp từ huyết thanh bệnh nhân nhiễm
sán lá gan lớn.
• Sử dụng kháng thể tinh chế qua sắc ký ái lực miễn dịch để chế tạo hệ
thống thử nghiệm phát hiện kháng nguyên.
ii
iv
MỤC LỤC
CHƯƠNG TRANG
Trang tựa
Lời cảm ơn......................................................................................................................
iii

Tóm tắt............................................................................................................................
iv
Mục lục...........................................................................................................................
v
Danh sách các chữ viết tắt..............................................................................................
vii
Danh sách các bảng.........................................................................................................
viii
Danh sách các hình.........................................................................................................
ix
PHẦN 1: MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề......................................................................................................1
1.2 Mục đích của đề tài........................................................................................2
1.3 Yêu cầu...........................................................................................................2
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Sơ lược lịch sử nghiên cứu sán lá gan và bệnh do sán lá gan lớn gây nên.....3
2.2 Vòng đời của sán lá gan lớn (Fasciola sp)......................................................3
2.3 Hình thái sinh học của sán lá gan lớn (Fasciola sp)......................................5
2.4 Tác hại của bệnh do sán lá lớn ở gan..............................................................6
2.4.1 Ở gia súc..................................................................................................6
2.4.2 Ở người...................................................................................................7
2.5. Chẩn đoán, phòng ngừa và điều trị bệnh sán lá gan lớn...............................8
2.5.1 Ở gia súc..................................................................................................8
2.5.2 Ở người...................................................................................................9
2.6 Dịch tiết từ sán lá gan lớn trong thời gian ký sinh có vai trò sinh học..........11
2.6.1 Protein tiết và đáp ứng miễn dịch..........................................................11
2.6.2 Hoạt động protease................................................................................12
PHẦN 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.
3.1 Thời gian và địa điểm...................................................................................13
3.2 Vật liệu .........................................................................................................13

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu...........................................................................13
3.2.2 Thiết bị và dụng cụ................................................................................13
3.2.2.1 Thiết bị.............................................................................................13
3.2.2.2. Dụng cụ .........................................................................................14
3.2.3 Hóa chất và cách chuẩn bị các dung dịch..............................................14
3.3 Phương pháp.................................................................................................17
3.3.1 Quy trình lấy mẫu...................................................................................17
3.3.2 Định lượng protein bằng phương pháp đo mật độ quang OD
280
...........17
ii
v
3.3.3 Xác định nồng độ protein bằng phương pháp Bradford .......................18
3.3.4 Điện di SDS-PAGE 12% xác định thành phần protein trong dịch tiết
của sán lá gan lớn Fasciola gigantica..........................................................21
3.3.5 Phương pháp miễn dịch khuếch tán kép Ouchterlony..........................26
3.3.6 Quy trình tạo cột sắc ký ái lực miễn dịch để tinh chế kháng thể đặc hiệu
với kháng nguyên tiết của sán lá gan lớn......................................................27
3.3.7 Kỹ thuật ELISA phát hiện kháng nguyên tiết trong huyết thanh hoặc
trong phân bệnh nhân .................................................................................28
PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Nồng độ protein trong dịch tiết của sán lá gan lớn được xác định bằng
phương pháp Bradford................................................................................................31
4.2 Kết quả điện di SDS-PAGE 12% xác định thành phần protein trong dịch tiết
của sán lá gan lớn.......................................................................................................31
4.3 Kết quả khuếch tán miễn dịch Ouchterlony kiểm tra độ đặc hiệu của kháng
nguyên tiết trong vật liệu tiết của sán lá gan lớn so với kháng nguyên thân của chính
nó................................................................................................................................33
4.4 Kết quả tinh chế kháng thể kháng Fasciola sp từ huyết thanh bệnh nhân...33
4.5 Giải hấp kháng thể từ cột sắc ký ái lực tạo với kháng nguyên tiết...............35

4.6 Kết quả phát hiện kháng nguyên tiết trong huyết thanh bệnh nhân bằng
phương pháp ELISA...................................................................................................35
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.....................................................................37
PHẦN 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................38
PHỤ LỤC..................................................................................................................41
ii
vi
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ab Antibody Kháng thể
Ag Antigen Kháng nguyên
BSA Bovine Serum Albumin Albumin huyết thanh bò
ELISA Enzyme Linked Immunospecific Assay Thử nghiệm miễndịch
cộng hợp enzyme
IgG Immunoglobulin G Globulin miễn G
MW Molecular Weight Trọng lượng phân tử
OD Optical density Mật độ quang
OP peroxydase
OPD O-phenylenediamine
PBS Phosphate Buffer Saline Đệm muối phosphate
SDS Sodium Dodecyl Sulfate
PAGE Polyacrylamide Gel Electrophoresis
ii
vii