Luận văn : Thu thập dịch tiết từ Fasciola gigantica và sử dụng làm kháng nguyên trong chẩn đoán part 4 pdf

28




cột có chứa sẵn đệm Tris. Cho đệm Tris vào đầy cột, đặt frit còn lại vào
cột và rửa lại một lần nữa bằng đệm Tris.
 Giải hấp: Sau khi nén cột ta cho kháng thể đã tinh chế vào cột rồi cũng
cân bằng lại cột bằng đệm Tris. Giải hấp kháng thể kháng kháng nguyên tiết của sán
lá gan lớn bằng glycine 0,1M, pH=2.5. Sau khi giải hấp cũng rửa cột với đệm Tris để
cân bằng lại cột.
3.3.7 Kỹ thuật ELISA phát hiện kháng nguyên tiết trong huyết thanh hoặc
trong phân bệnh nhân
Nguyên tắc chung của kỹ thuật ELISA là nguyên tắc bánh kẹp (Sandwich), tạo
liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể.
Sự liên kết đó biểu hiện hợp thức liên kết hóa học cho phép định lượng sự có
mặt của kháng thể hoặc kháng nguyên. Kháng thể hoặc kháng nguyên có thể được
xác định khi được nhận biết đặc hiệu bằng một kháng thể thứ hai cộng hợp với hệ
biotin – Streptavidin – enzyme sẽ tạo ra sản phẩm có màu khi tác dụng với cơ chất
phù hợp.

Hình 3.3.7 – Sơ đồ nguyên tắc phản ứng ELISA phát hiện kháng nguyên
OPD
B
B
Streptavidin - PO
Polystyrene
Giai đoạn
gắn bản
Giai đoạn
phản ứng

29




 Gắn IgG
kháng nguyên tiết
vào giếng nhựa polystyrene
Phủ protein lên giếng nhựa: IgG
kháng nguyên tiết
pha trong đệm NaHCO
3
- Na
2
CO
3
0,1 M, pH = 9,6 thu được dung dịch kháng thể có nồng độ
5 µg/ml. Cho vào mỗi giếng 100 µl dung dịch trên. Ủ qua đêm ở
4
0
C. Rửa giếng 3 lần bằng đệm PBS -thimerosal 0,01%, Tween 20
0,05%, gelatine 0,5% (đệm 1).
Dung dịch bão hòa: Bão hòa các vị trí kháng thể không gắn vào
giếng bằng dung dịch Tris 0,1 M; NaCl 0,15M; EDTA 1mM; Tween
20 0,05%; gelatine 0,5%; pH = 8 (375 µl/ giếng) trong 60 phút ở
39
0
C. Rửa giếng 3 lần bằng đệm 1.
 Thực hiện phản ứng trên giá rắn: Pha kháng nguyên tiết trong huyết thanh âm
thành các dung dịch có nồng độ kháng nguyên tiết lần lượt 1000; 500; 250; 125;

62,5; 31,25 (ng/ml). Cho các dung dịch vừa pha vào giếng (100 µl/giếng) theo bảng
sau:

Bảng 3.3.7 – Bố trí hệ thống ELISA để phát hiện kháng nguyên tiết trong huyết thanh bệnh nhân

Giếng
1
2
A
Huyết thanh âm
Huyết thanh âm
B
31,25 ng kháng nguyên tiết
C
62,5 x
D
125 x
E
250 x
F
500 x
G
1000 x
H
Huyết thanh dương
Huyết thanh dương

Ủ 39
0
C, 60 phút. Sau đó, rửa ba lần với đệm 1.

Cho IgG
kháng nguyên tiết
-biotin vào (100 µl/giếng). Ủ 39
0
C trong 30
phút. Sau đó rửa ba lần với đệm 1.
30




Cho Streptavidin – peroxydase vào (100 μl/giếng). Ủ nhiệt độ phòng
trong 30 phút. Sau đó cho OPD vào (100 μl/giếng). Ủ nhiệt độ phòng
trong 30 phút. Sau đó chờ khoảng 15 phút để hiện màu. Rồi cho vào
mỗi giếng 100 μl dung dịch H
2
SO
4
1,5N. Sau đó đem đi đọc kết quả
bằng máy đọc ELISA Sanofi Pr 2100 ở
1
= 490 nm và
2
= 620 nm.

31




Albumin
Papain
Mẫu
Lysozyme
PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Nồng độ protein trong dịch tiết của sán lá gan lớn đƣợc xác định bằng
phƣơng pháp Bradford
Sau khi xử lý số liệu bằng phần mềm KC4 ta tính được nồng độ protein trong dịch
tiết của sán lá gan lớn
Nồng độ protein đo được =
mlmg/38,1
3
4433,12806,14258,1

4.2 Kết quả điện di SDS-PAGE 12% xác định thành phần protein trong dịch tiết
của sán lá gan lớn

Hình 4.2.1 – Kết quả điện di để xác định trọng lƣợng phân tử của các protein
trong dịch tiết của sán lá gan lớn
Giếng 1, 2, 3, 5, 7: Protein trong dịch tiết của sán lá gan lớn với các nồng độ khác
nhau.
Giếng 4,6 : Protein chuẩn - Albumin ( MW = 66 kDa; Nồng độ 1,53 mg/ml)
- Papain (MW = 23 kDa; Nồng độ 2,8 mg/ml)
- Lysozyme (MW = 14 kDa; Nồng độ 4,3 mg/ml)

32







Hình 4.2.2 – Đồ thị tuyến tính giữa đƣờng di chuyển của các protein chuẩn và
trọng lƣợng phân tử
Nhận xét: Dựa theo hình điện di và đồ thị trên ta thấy trong dịch tiết của sán lá gan
lớn có một thành phần protein trội có trọng lượng phân tử xấp xỉ trong khoảng từ 27 –
29 kDa.

4.3 Kết quả miễn dịch khuếch tán kép kiểm tra độ đặc hiệu của kháng nguyên
tiết trong dịch tiết của sán lá gan lớn so với kháng nguyên thân của chính nó
Kháng nguyên tiết và kháng nguyên thân của sán lá gan lớn được pha loãng bậc hai
nồng độ bắt đầu từ ½ với PBS. Cho mẫu vào giếng tương ứng. Ta có kết quả như sau:

33




Kháng nguyên
tiết
Kháng nguyên
thân














Hình 4.3 – Kết quả miễn dịch khuếch tán kép phát hiện kháng thể đặc hiệu ở
huyết thanh bệnh nhân

Kết quả cho thấy đường tủa giữa kháng nguyên tiết và kháng thể của bệnh nhân
bị nhiễm bệnh rõ nét hơn. Cho thấy độ đặc hiệu của kháng nguyên tiết cao hơn kháng
nguyên thân so với kháng thể của Fasciola sp.

4.4 Kết quả tinh chế kháng thể kháng Fasciola sp từ huyết thanh bệnh nhân
Từ 4ml huyết thanh ban đầu của bệnh nhân bị nhiễm Fasciola sp qua giai đoạn
tủa kháng thể. Sau khi đo OD
280
ta thu được nồng độ kháng thể 21 mg/ml. Bảo quản
kháng thể thu được trong dung dịch đệm PBS 1X.
34





4.5 Giải hấp kháng thể từ cột sắc ký ái lực tạo với kháng nguyên tiết


IgG kháng nguyên tiết
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
0 10 20 30
Đoạn 1ml
OD280nm

Hình 4.5 – Tinh chế kháng thể qua sắc ký ái lực dùng Sepharose – 4B cộng hợp
với protein tiết từ Fasciola gigantica.
Sau khi giải hấp với glycine pH = 2.5, các đoạn số 1 đến số 27 được gom lại và hấp
phụ quang trung bình đo được là:
[IgG
kháng nguyên tiết
] = 0,293 mg/ml









35




0
0.5
1
1.5
2
0 125 250 375 500 625 750 875 1000

Nồng độ kháng nguyên tiết (ng/ml)
Abs 490 nm
4.6 Kết quả phát hiện kháng nguyên tiết trong huyết thanh bệnh nhân bằng
phƣơng pháp ELISA
Sau khi xử lý số liệu bằng phần mềm KC4 ta có kết quả như sau:

Bảng 4.6 – Kết quả phát hiện kháng nguyên tiết trong huyết thanh bệnh nhân
bằng hệ thống ELISA







]

Hình 4.6.1 – Đồ thị hệ thống ELISA phát hiện kháng nguyên tiết trong huyết
thanh bệnh nhân
Giếng
1
2

A
0.014
0.016
HT -
B
0.728
0.726
31.25ng
C
1.099
1.124
62.5
D
1.312
1.418
125
E
1.506
1.367
250
F
1.558
1.339
500

G
1.495
1.406
1000
H
0.013
0.012
HT +
36




Kết quả cho thấy hệ thống hoạt động tốt phát hiện được hàm lượng kháng nguyên
tiết trong huyết thanh bệnh nhân ở giá trị 125 ng/ml. Tuy nhiên ở huyết thanh bệnh
nhân dương tính không cho thấy có kháng nguyên tiết có thể đây là trường hợp nhiễm
Fasciola sp mãn tính nên lượng kháng nguyên tiết sẽ được bài tiết ra trong phân.




Hình 4.6.2 – Đồ thị biểu hiện sự biến động của kháng nguyên tuần hoàn trong
máu và trong phân bệnh nhân nhiễm Fasciola sp [11]