Luận văn : Thu thập dịch tiết từ Fasciola gigantica và sử dụng làm kháng nguyên trong chẩn đoán part 2 pptx

10















Hình 2.5.2.1 – Hình chụp CT bệnh nhân bị nhiễm sán lá gan lớn
[Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Thành Phố Hồ Chí Minh]












Hình 2.5.2.2 - Hình chụp siêu âm của bệnh nhân nhiễm sán lá lớn ở gan

[Bệnh viện Bệnh nhiệt đới Thành Phố Hồ Chí Minh]
Về điều trị dùng Dehydro – Emetine hoặc Chlorhydrate Emetine, mặc
dầu thuốc này có nhiều tác dụng phụ (gây liệt cơ, suy tim…); bệnh nhân
phải nằm viện tối thiểu 10 ngày nhưng vẫn phải sử dụng vì thị trường
11




trong nước chưa có thuốc nào thuận tiện hơn. Hiện nay, có xu hướng sử
dụng triclabendazole.
Theo dõi bệnh nhân sau điều trị thì thấy tỷ lệ bạch cầu toan tính trong
máu và hình ảnh siêu âm gan có xu hướng trở lại bình thường sớm hơn
hiệu giá huyết thanh miễn dịch. Đến tháng 9, tỷ lệ bạch cầu toan tính
trong máu của 70% bệnh nhân trở lại mức bình thường sớm hơn hiệu giá
huyết thanh miễn dịch. Sau một năm điều trị, hiệu giá kháng thể vẫn còn
cao (trên 91,96%) nên không thuận lợi để theo dõi hiệu quả của điều trị.
Do tập quán ăn rau sống, bối cảnh sinh thái môi trường, chăn nuôi gia
súc gần nơi trồng rau, số người mắc bệnh chắc chắn phải rất cao trên
thực tế, vì vậy dùng Emetine chưa phải là một giải pháp tốt cho việc điều
trị hàng loạt cần phải có sự phối hợp giữa nhiều ngành chức năng: thú y,
canh nông, môi trường, sinh thái, y học để giải quyết tốt vấn đề này ở
nước ta.

2.6 Dịch tiết từ sán lá gan lớn trong thời gian ký sinh có vai trò sinh học
2.6.1 Protein tiết và đáp ứng miễn dịch
Protein trong dịch tiết của sán lá gan lớn được tiết ra ở các giai đoạn phát
triển khác nhau của sán lá gan trong cơ thể của ký chủ. Loại protein này được xem như
một sự nhiễm bệnh đối với Fasciola sp. Do đó, nó có thể được dùng để chẩn đoán sớm
bệnh sán lá gan lớn ở người khi kháng thể đặc hiệu chống lại sán chưa được xuất hiện

(từ 1 – 3 tuần sau nhiễm). Bệnh thường có những triệu chứng lâm sàng không rõ ràng
và biến động nên đa số các bệnh nhân nhập viện đều cho kết quả kháng thể kháng
Fasciola sp cao. Lúc này, lượng protein tiết đánh giá qua xét nghiệm sẽ giảm dần và
có xu hướng mất hẳn. Do đó, việc phát hiện kháng nguyên tiết trong huyết thanh bệnh
nhân cũng gặp nhiều khó khăn. Sán ký sinh ở ống dẫn mật nên lượng protein tiết sẽ
lưu thông xuống ruột và được bài tiết theo phân. Vì thế, việc tìm protein tiết trong
phân có nhiều thuận lợi hơn.
Xét nghiệm huyết thanh học qua phương pháp miễn dịch men đã được Trần
Vinh Hiển và Trần Thị Kim Dung dùng để phát hiện kháng thể của người bệnh mang
12




lại hiệu quả cao. Nhưng do sử dụng kháng nguyên thân của F. gigantica nên có thể có
những phản ứng chéo không mong muốn và không thể đánh giá được hiệu quả điều trị
bệnh vì lượng kháng thể vẫn còn tồn tại rất lâu trong cơ thể bệnh nhân sau khi đã khỏi
bệnh. Thành phần protein trong dịch tiết của sán lá gan lớn được đánh giá là có tính
đặc hiệu hơn so với kháng nguyên thân của F. gigantica (còn gọi là kháng nguyên tiết
– excretory/ secretory antigens) nên có thể sử dụng để cải tiến phương pháp huyết
thanh miễn dịch men để phát hiện kháng thể nhạy hơn và để tránh các phản ứng chéo.
Ngoài ra, kháng nguyên tiết còn được dùng để đánh giá hiệu quả điều trị vì các nghiên
cứu khoa học cho thấy sau khi được điều trị thì lượng kháng nguyên tiết sẽ được giảm
một cách từ từ trong cơ thể ký chủ. Do đó hiệu quả điều trị sẽ được đánh giá nhanh
chóng hơn [6, 5, 11,12].

2.6.2 Hoạt động protease
Thành phần chủ yếu của dịch tiết là cysteine-protease trong thời gian ký
sinh đóng vai trò chủ chốt trong việc xâm nhập bệnh vào cơ thể ký chủ. Các enzyme
này giúp phân giải thành phần protein của ký chủ để cung cấp dinh dưỡng cho sán phát

triển và để tạo điều kiện thuận lợi cho sự di chuyển của ký sinh trùng qua ruột non và
gan. Chúng phân cắt những protein của màng ruột như fibronectin, laminin và
collagen. Mặt khác, chúng còn bất hoạt hàng rào bảo vệ miễn dịch của tế bào chủ bằng
sự phân cắt các immunoglobulins. [8,10]
Do đó, việc xác định và tinh chế thành phần protease này có ý nghĩa quan
trọng trong việc phòng ngừa và điều trị bệnh sán lá gan lớn ở người và gia súc.
Các thử nghiệm tạo vaccine từ các loại protease trong vật liệu tiết của sán lá
gan lớn ở giai đoạn non và trưởng thành đã được thực hiện cho thấy có kết quả tốt tác
động lên sự dinh dưỡng và phát triển của ký sinh trùng cũng như hạn chế số lượng
trứng trong phân. Từ đó kiểm soát được sự lan nhiễm của bệnh và hạn chế mức thiệt
hại về kinh tế [10].




13





PHẦN 3: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm
Thời gian thực hiện đề tài: từ tháng 3/2005 đến tháng 6/2005.
Địa điểm: phòng Hóa Miễn Dịch, Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh.
3.2 Vật liệu
3.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu
Sán trưởng thành từ gan trâu, bò bị nhiễm sán lá gan được lấy từ công ty
Vissan.

Sử dụng sán chết được giữ trong môi trường PBS. Bảo quản ở -20
0
C.
Nuôi sán còn sống trong môi trường được pha chế bên ngoài vật chủ để
thu lấy dịch tiết. Bảo quản ở -20
0
C.
3.2.2 Thiết bị và dụng cụ
3.2.2.1 Thiết bị
Cân phân tích E14130, OHAUS, Switzerland.
Máy lọc nước Titertek (Microtitration).
Tủ hút khí (pha hóa chất) Kottermann.
Máy đo pH METTLER TODEDO MP220.
Máy sấy tiệt trùng.
Tủ cấy vô trùng.
Lọc vô trùng 0,22 μm.
Máy ly tâm lạnh MEGAFUGE 1.0 R, Heraeus Instruments.
Máy ly tâm nhỏ Micro centrifuge.
Máy khuấy từ CATM6/1.
Tủ lạnh Vestfrost REETECH, DOSAI, SANYO.
Máy vortex Minishaker MS1.
Máy lắc thường LAB-ROTATOR, LAB-LINE.
Máy đo quang phổ hấp thụ Spectrophotometer U 3310 Hitachi (Japan).
14




Bộ điện di protein SNEW.
Máy đọc ELISA Sanofi PR 2100, Diagnostics Pasteur.

Máy nghiền tế bào bằng sóng siêu âm Sonicator (Merck)
Máy chụp ảnh.
Máy vi tính.
3.2.2.2 Dụng cụ
Van kẹp; ống nghiệm thủy tinh; bông gòn không thấm nước; các loại
ống nhựa 5 ml, 15ml, 50 ml; bộ kính điện di đứng; kim bơm butanol
100 μl, kim bơm mẫu 50 μl; eppendorf; đầu cone; bình tia đựng cồn,
nước cất; ống hút nhựa; ống đong; giấy lọc; cóng đo bằng nhựa;
pipetman và típ các loại.
3.2.3 Hóa chất và cách chuẩn bị các dung dịch
Nước cất 2 lần.
Dung dịch PBS 1X.
Môi trường RPMI 1640 1X để nuôi sán (hãng Gibco BRL Code 51800 –
035).
Kháng sinh Streptomycin.
Kháng sinh Penicillin.
Dung dịch màu (Bradford 4X) dùng để xác định nồng độ protein bằng
phương pháp Bradford:
+ Comassie blue G (Serva Blue G – N
0

35050) 85 mg
+ Ethanol (EtOH) 50ml
+ H
3
PO
4
85% 100ml
+ H
2

O cất hai lần 100ml
Dung dịch BSA (Bovine Serum Albumin)
Các dung dịch dùng trong điện di:
1. Dung dịch 40% T: Acrylamide (38,93g); N, N’-Methylene-bis-
acrylamide (1,07g). Hòa tan trong khoảng 80 ml + 1 ít MB1 và
xoay với máy khuấy từ trong 30 phút. Chỉnh đúng 100 ml. Lọc
qua Whatman số 1 cho vào chai nâu và bảo quản ở 4
0
C.
15




2. Dung dịch 9,5% T: Acrylamide (6,3g); N, N’-Methylene-bis-
acrylamide (3,2g). Làm theo như với dung dịch 1.
3. Đệm phân giải (1,5M Tris): Tris base (18,15g). Trộn với khoảng
70 ml H
2
O. Dùng HCl hòa tan và chỉnh pH xuống 8,8. Chỉnh
đúng 100 ml và bảo quản ở 4
0
C.
4. Đệm tập trung: Tris base (3g). Trộn với khoảng 35 ml H
2
O. Dùng
HCl, hòa tan và chỉnh pH xuống 6,8. Chỉnh đúng 50 ml và bảo
quản ở 4
0
C.

5. Dung dịch SDS 10%: 10g/100 ml. Giữ ở nhiệt độ phòng.
6. Dung dịch đệm bình điện di: Tris base (12g); glycine (57,6g). Hòa
tan và chỉnh đúng 1000 ml. Bảo quản ở 4
0
C. Khi dùng pha loãng
¼ và cộng 1% dung dịch 5 (4 ml/400ml).
7. Dung dịch cố định: Sulfosalicylic acid (4g) + 100 ml Trichloroacetic acid 12,5%.
8. Dung dịch nhuộm: Coomassie R250 (2,5g); Methanol (600 ml);
Acid acetic (90ml). Trộn đều bột màu với hai dung môi hữu cơ
này để hòa tan trước khi cho nước vào, 300 ml nước. (Có một số
bột màu có giá bột thủy tinh, không tan được phải lọc qua
Whatman số 1).
9. Dung dịch tẩy: Methanol (50ml); Acid acetic (75ml); nước cho
đến 1000 ml.
10. Dung dịch glycerol (d=1,25g/ml) 1g=0,8 ml (nếu không dùng 1g
glycerol dùng 0,8 ml H
2
O)
11. Dung dịch xanh-glycerol dùng để pha mẫu: glycerol (2 ml); SDS
10% (2,5 ml); đệm 4 (2 ml); màu bromphenol (80 μl); nước cất
vừa đủ 10 ml. Bảo quản ở 4
0
C.
Dung dịch TEMED (2μl/4ml) khi còn mới. Khi lực xúc tác
bị yếu đi tăng lên cao hơn.
Dung dịch APS/KPS (A/K persulfate) (100 mg/ml) pha
trước khi dùng ở 4
0
C. Chỉ dùng dung dịch mới pha (15 μl/ 4 ml) khi còn mới.
16

Khi lực xúc tác bị yếu đi, tăng lên cao hơn. Để hãm tốc độ polymer hóa, các
dung dịch monomer cần cho xuống 4
0
C trước khi thực hiện gradient.
Dung dịch Triton 2,5%.
Dung dịch EDTA 1mM; glycine 0,1M; L-Cystein 10mM; pH = 8.
Các dung dịch dùng trong miễn dịch khuếch tán kép:
Dung dịch gel agarose 1% pha trong đệm PBS 1X để làm
phản ứng miễn dịch khuếch tán kép trên thạch.
Dung dịch nhuộm đỏ Ponceau S 0,2%.
Các dung dịch dùng trong sắc ký ái lực:
Gel CN-Br activated Sepharose 4B (Pharmacia, Thụy Điển).
Dung dịch NaN
3
0,05% (dd1).
Dung dịch HCl 1mM, pH = 3.
Dung dịch đệm carbonate: NaHCO
3
0,1M; NaCl 0,5M;
thimerosal 0,01%; pH = 8,7 (dd3).
Dung dịch Tris-HCl 0,1M; NaCl 0,5M; pH = 8 (dd4).
Dung dịch NaCl 0,5M; CH
3
COONa 0,1M; pH = 4 (dd5).
Dung dịch Tris-HCl 0,1M; NaN
3

0,05%; NaCl 0,5M; pH = 7,4 (dd6).
Dung dịch glycine 0,1M, pH = 2,5.
Các dung dịch dùng trong kỹ thuật ELISA:
Đệm carbonate Na
2
CO
3
; pH = 9,6: NaHCO
3
0,075M (pH =
8; 1,26g/ 200 ml); Na
2
CO
3
0,075 M (pH = 10,9; 159 g/200
ml); NaN
3
0,003% (0,04 g/200 ml).
Dung dịch rửa: PBS thimerosal 0,01%; Tween 0,05%.
Dung dịch bão hòa pH = 8 (HCl): Tris 0,1M; NaCl 0,15 M;
EDTA 1mM, NaN
3
0,05%; Tween 20 0,05%; Gelatin 0,5%.
NHS-LC-Biotin (21336, Pierce).
OPD – cơ chất cho peroxydase (Sigma, USA).
Streptavidin - peroxydase (Sigma, USA).
Chất hiện màu.
17

Dung dịch ngừng phản ứng H
2
SO
4
1,5 N.
3.3 Phƣơng pháp
3.3.1 Quy trình lấy mẫu [6]
Sán trưởng thành từ gan trâu hoặc bò bị nhiễm sán lá gan được rửa 4 lần với
PBS 1X cho sạch máu và mật, sau đó cho vào ống chứa PBS và bảo quản ở -20
0
C.
Đối với sán sống cho vào môi trường nuôi RPMI 1640 (1 con/5 ml/1 ống
nghiệm), ủ ở 37
0
C/24h. Sau đó ly tâm (3000 vòng/phút/4
0
C/30phút) thu lấy dịch nổi,
bảo quản ở -20
0
C.
3.3.2 Định lƣợng protein bằng phƣơng pháp đo mật độ quang OD
280
[9]
Phương pháp này sử dụng một máy đo quang phổ 250 – 700 nm (UV – VIS).
Cấu tạo gồm nguồn sáng, một khe hở cho ánh sáng đi vào, các lăng kính và cách tử để
tạo thành các ánh sáng đơn sắc, ngăn chứa mẫu và đầu dò để đo lượng ánh sáng sau
khi qua mẫu. Photon ánh sáng ở vùng tử ngoại do đèn nguồn phát qua hệ thống các
lăng kính và cách tử sẽ chỉ tạo ánh sáng đơn sắc với bước sóng nhất định. Khi đi qua

dung dịch trong cốc sẽ gây ra sự thay đổi năng lượng của các điện tử. Khi phân tử hấp
thụ năng lượng ánh sáng này, các điện tử sẽ chuyển lên mức năng lượng cao hơn.
Phân tử protein hấp thụ ánh sáng cực đại ở bước sóng 280 nm, sự hấp thụ này
có được chủ yếu là do các amino acid có nhân thơm như phenylalanine, tyrosine,
tryptophan. Tuy nhiên, mỗi protein có thành phần và số lượng các amino acid trên
khác nhau nên mỗi protein sẽ có một hệ số tắt (extinction) tương ứng. Hệ số tắt này là tỉ
số giữa độ hấp thụ quang ở bước sóng 280 nm (OD
280
) trên nồng độ (mg/ml) của protein.
Ví dụ, protein BSA có hệ số tắt là 0,66; như vậy nếu BSA giá trị OD
280
= 0,66 thì nồng độ
của BSA là 1 mg/ml.
18





Hình 3.3.2 – Biểu đồ quang học máy đo quang phổ 250 – 700 nm (UV – Vis)[9]

3.3.3 Xác định nồng độ protein bằng phƣơng pháp Bradford [7,18]
Bradford là một phương pháp định lượng protein rất phổ biến bởi vì nó đơn
giản, nhanh, không đắt và nhạy. Phương pháp này sử dụng thuốc nhuộm
Coommassie Briliant Blue G-250 (CBBG). Thuốc nhuộm này liên kết chuyên biệt
với protein ở vị trí các nhóm amino acid arginine, tryptophan, tyrosine, histidine và
phenylalanine trong đó chủ yếu là liên kết với arginine (nhiều hơn 8 lần so với
nhóm khác). CBBG liên kết với các nhóm này dưới dạng amin, mà ở dạng này nó
hấp thụ ánh sáng tối đa ở bước sóng 595 nm (màu xanh); Thuốc nhuộm ở dạng tự
do là cation, mà ở dạng này nó hấp phụ ánh sáng tối đa ở bước sóng 470 nm (màu

đỏ). Phương pháp này được đo ở bước sóng 595 nm bởi một máy quang phổ kế, và
vì vậy đo phức hợp CBBG với protein.