Luận văn : NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI PROTEIN TÁI TỔ HỢP MBP-VT2eB TRÊN THỎ part 3 ppt

7






2.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch
- Tính lạ của kháng nguyên
Điều kiện quan trọng để một kháng nguyên có tính sinh miễn dịch cao là sự
khác biệt chủng loài giữa thú được gây miễn dịch và kháng nguyên. Trong miễn
dịch dịch thể, kháng nguyên càng lạ với cơ thể thú bao nhiêu thì khả năng sinh
miễn dịch càng cao bấy nhiêu. Ví dụ: Albumin gà sẽ tạo kháng thể cao hơn
albumin bò khi cùng tiêm cho dê. Trong miễn d
ịch qua trung gian tế bào chỉ
cần sự khác biệt giữa các cá thể cũng gây đáp ứng miễn dịch cao, ví dụ như
phản ứng thải bỏ mảnh ghép của chuột A khi ghép một bộ phận nào đó của
chuột B.
- Cấu tạo hoá học của kháng nguyên
Các kháng nguyên là protein hay polysaccharide đều có tính miễn dịch cao
khi chúng ở dạng hoà tan hay trong cấu trúc phức tạp, ví dụ: vỏ vi khuẩn, các
loại protein trong máu.
Các chất khác gồ
m lipide, steroid, acid nucleic có tính sinh miễn dịch yếu
hoặc không có tính sinh miễn dịch, trừ khi chúng được gắn với một protein tải
để trở thành một phức hợp có tính sinh miễn dịch.
Hình 2.2: Đáp ứng miễn dịch của thú đối với 2 lần tiêm kháng nguyên được phản
ánh qua mức độ kháng thể trong kháng huyết thanh
(Nguồn: Ian R. Tizard, Immunology, Saunders College Publishing, 1988)
8

Các kháng nguyên được tổng hợp từ một loại acid amin thì có tính sinh
miễn dịch yếu. Các kháng nguyên được tổng hợp từ hai loại acid amin trở lên sẽ
có tính sinh miễn dịch cao. Nếu trong mạch polypeptide có thêm acid amin
mạch vòng (đặc biệt là tyrosine) sẽ làm tăng tính sinh miễn dịch của phân tử
polypeptide đó.
Các polypeptide được tổng hợp từ các acid amin dạng D có tính sinh miễn
dịch thấp vì nó ít bị chuyển hoá. Sự chuyển hoá kháng nguyên trong cơ thể vật
chủ là yếu tố quan trọng cho tính sinh miễn dịch, vì khi bị chuyển hoá các
kháng nguyên dễ bộc lộ các quyết định kháng nguyên ra ngoài.
- Kích thước của phân tử kháng nguyên
Kháng nguyên càng có kích thước phân tử lớn và cấu trúc càng phức tạp thì
tính sinh miễn dịch càng cao. Một phân tử kháng nguyên càng lớn thì nó càng
có cấu trúc phức tạp và có nhiều quyết định kháng nguyên, đó là một trong
những yếu tố đảm bảo tính sinh miễn dịch cao.
- Cách gây miễn dịch và liều lượng của kháng nguyên
Ngoài các y
ếu tố trên, còn có những các yếu tố khác ảnh hưởng đến tính
sinh miễn dịch:
• Đường đưa kháng nguyên vào cơ thể vật chủ: với những kháng nguyên
mạnh, đưa kháng nguyên vào đường mạch máu có thể dễ dàng gây đáp
ứng miễn dịch, ví dụ: virus, vi khuẩn, tế bào. Nhưng với những kháng
nguyên hoà tan thì phải có quy trình gây miễn dịch thích hợp, tốt nhất là
đường tiêm trong da, dưới da và phải tiêm nhắc lại nhiều lần.
• Liề
u lượng kháng nguyên: Nếu lượng kháng nguyên quá ít thì không đủ
gây đáp ứng miễn dịch. Ngược lại, nếu lượng kháng nguyên nhiều quá sẽ
gây ức chế miễn dịch.
• Quy trình gây miễn dịch cũng ảnh hưởng lớn đến tính sinh miễn dịch của
phân tử kháng nguyên. Cùng một loại kháng nguyên, gây miễn dịch trên
hai lô thú thí nghiệm thuần chủng nhưng ở hai quy trình gây miễn dịch

khác nhau thì đáp ứng miễn dịch cũng khác nhau. Mỗi loạ
i kháng
nguyên thích hợp với một loại quy trình gây miễn dịch riêng. Với những
kháng nguyên yếu thường phải được gây miễn dịch bằng quy trình hết
sức nghiêm ngặt và gây miễn dịch nhiều lần thì mới có đáp ứng miễn
9

dịch mạnh. Trong khi đó, với những kháng nguyên mạnh có khi chỉ cần
gây miễn dịch một lần cũng gây đáp ứng miễn dịch mạnh.
- Hiệu ứng cộng lực kháng nguyên
Nếu cùng một lúc gây miễn dịch nhiều loại kháng nguyên cho con thú thì
kháng thể đặc hiệu được sinh ra tương ứng với mỗi loại kháng nguyên sẽ ít nhất
ngang bằng hoặc nhiều hơn khi kháng nguyên đó kích thích một mình. Hiện
tượ
ng này được gọi là sự cộng lực kháng nguyên hay cộng kích thích kháng
nguyên.
Nếu cùng một lúc cho con thú mẫn cảm với hai loại kháng nguyên: một
kháng nguyên liều mạnh và một kháng nguyên liều nhẹ thì con thú có thể chỉ
phản ứng với kháng nguyên liều mạnh. Hiện tượng này gọi là sự cạnh tranh
kháng nguyên. Hiện tượng cạnh tranh kháng nguyên chỉ xảy ra ở hai kháng
nguyên có cấu trúc hoá học gần giống nhau.
- Phản ứng thứ phát (phản ứng nhớ)
Nếu cho mẫn cảm kháng nguyên với một con vật đã được mẫn cảm với
kháng nguyên đó một lần rồi, thì hàm lượng kháng thể sẽ tăng sớm và nhiều
hơn lần đầu. Phản ứng nhớ này tồn tại trong một thời gian khá dài sau mũi tiêm
thứ nhất, đó là nhờ các tế bào lympho B sau khi tiếp xúc với kháng nguyên đã
phân chia và biệt hoá trở thành tế bào ghi nhớ (memory cell), để khi kháng
nguyên vào những lần sau sẽ
lập tức tăng sinh thành dòng tế bào đã có hoạt tính
miễn dịch.

- Chất bổ trợ
Ngày nay, tá chất được sử dụng rộng rãi để tăng hiệu quả của các loại
vaccin, tăng khả năng thực bào của đại thực bào đối với kháng nguyên. Ngoài
ra, tá chất còn gây một phản ứng viêm không đặc hiệu làm tăng tính sinh miễn
dịch.
Qua các nghiên cứu gần đây, tá chất còn có tác dụng làm tăng t
ế bào T
H
.
Khi bổ sung tá chất vào kháng nguyên sẽ làm kháng nguyên tồn tại lâu hơn
trong cơ thể túc chủ. Kháng nguyên được giải phóng dần dần, có tác dụng giống
như kích thích miễn dịch nhiều lần.


10

- Khả năng đáp ứng của thú
Ngày nay, người ta biết rằng với cùng một loại kháng nguyên, nếu đưa vào
các cơ thể khác nhau sẽ cho đáp ứng miễn dịch khác nhau.
Tính sinh miễn dịch = tính kháng nguyên + khả năng đáp ứng miễn dịch của vật
chủ
Khả năng đáp ứng miễn dịch của vật chủ phụ thuộc vào tính di truyền.

2.4. CƠ CHẾ MIỄN D
ỊCH DỊCH THỂ
[13]

Quá trình đáp ứng miễn dịch dịch thể là do tế bào lympho B đảm nhận. Đầu tiên,
các tế bào nguồn (trong tủy xương) biệt hoá thành tế bào lympho B khởi thuỷ (pro-B).
Sau đó chúng tiếp tục biệt hoá thành tiền tế bào lympho B (pre-B), các tế bào này có

đặc điểm là chưa có Immunoglobulin (Ig) bề mặt mà chỉ có IgM trong bào tương
CIgM (cytoplasma IgM). Các phân tử Ig bề mặt hoạt động như các thụ thể tiếp nhận
kháng nguyên, là những protein tham gia cấu tạo màng tế bào. Các tiề
n tế bào lympho
B được biệt hoá thành các tế bào lympho chưa chín, các tế bào này đã có IgM bề mặt.
Sau đó, chúng tiếp tục biệt hoá thành các tế bào lympho B chín với sự xuất hiện của
IgM, IgD bề mặt (và một số nhỏ IgA và IgG bề mặt). Tuy nhiên, các tế bào lympho B
chín chưa phải là các tế bào sản xuất kháng thể. Nếu các tế bào lympho B chín không
gặp đuợc kháng nguyên thì chúng sẽ bị phân huỷ. Nếu tế bào lympho B chín gặp được
kháng nguyên cộng thêm sự h
ợp tác hỗ trợ của các tế bào lympho T
H
, chúng sẽ tiếp tục
biệt hoá thành các tế bào plasma (plasma cell) và tế bào ghi nhớ (memory cell).

11





Khi kháng nguyên kết hợp với các thụ thể Ig bề mặt của tế bào lympho B, chúng sẽ
hoạt hoá phospholipase C ở màng tế bào thuỷ phân phosphotidyl inositol biphosphate
thành diacylglycerol (DAG) và inositol triphosphate (IP
3
). DAG và IP
3
có tác dụng
hoạt hoá protein kinase C và gia tăng hàm lượng Ca
2+

ngoại bào. Protein kinase C
được hoạt hoá sẽ thúc đẩy quá trình sao chép các gen mã hoá cho các kháng nguyên
phù hợp tổ chức chính lớp II (Major histocompatibility complex class II antigens –
MHC class II antigens) và thụ thể transferrin CD71.
Hình 2.3: Quá trình biệt hóa và phân chia của tế bào lympho B
(Nguồn: Ian R. Tizard, Immunology, Saunders College Publishing, 1988)
12





Các tế bào lympho B bắt giữ, xử lý và phân cắt để đưa lên bề mặt tế bào các nhóm
quyết định kháng nguyên, sau đó gắn kết với các kháng nguyên MHC lớp II tạo thành
phức hợp kháng nguyên – kháng nguyên MHC lớp II. Phức hợp này sẽ được phức hợp
thụ thể TCR – CD3 của tế bào lympho T
H
nhận diện và kết hợp.
Hình 2.4: Các quá trình diễn ra khi kháng nguyên kết hợp với các thụ thể trên bề
mặt tế bào lympho B
(Nguồn: Ian R. Tizard, Immunology, Saunders College Publishing, 1988)
13



Nhờ vậy, các tế bào lympho B có thể gửi một dấu hiệu trình diện kháng nguyên
bị giới hạn bởi kháng nguyên phù hợp tổ chức chính (MHC – restricted antigen –
presenting signal) cho tế bào lympho T
H
. Tế bào lympho T

H
bị hoạt hoá, chuyển từ
Hình 2.5: Sự kết hợp giữa tế bào
lympho T
H
và tế bào lympho B.
(Nguồn: Ian R. Tizard,
Immunology, Saunders College
Publishing, 1988)

Hình 2.6: Tế bào lympho B xử lý và
trình diện kháng nguyên cho tế bào
lympho T
H
. (Nguồn: Ian R. Tizard,
Immunology, Saunders College
Publishing, 1988)
14

trạng thái nghỉ ngơi (resting state) sang trạng thái G
1
(G
1
state) trong chu trình tế bào
(the cycle cell) và tiết ra hỗn hợp các interleukin. Tế bào lympho T
H
gồm hai tiểu quần
thể với các chức năng khác nhau: T
H1
và T

H2
. T
H1
là các tế bào lympho T giúp đóng vai
trò quan trọng trong đáp ứng trung gian tế bào, T
H1
tiết interleukin 2 (IL2). T
H2
là các
tế bào lympho T giúp đóng vai trò quan trọng trong quá trình sản xuất kháng thể của tế
bào lympho B. T
H2
tiết interleukin 4 (IL4), interleukin 5 (IL5), interleukin 6 (IL6), các
interleukin này có tác động giúp tế bào lympho B hoạt hoá, phân chia và biệt hoá.





Tế bào lympho B phân chia và biệt hoá thành tế bào plasma (plasma cell). Chỉ
có tế bào plasma mới có khả năng sản xuất kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên lạ.
Các tế bào plasma có khả năng sản xuất 300 phân tử kháng thể trong 1 giây. Các chuỗi
nặng và chuỗi nhẹ của phân tử kháng thể được tổng hợp trong các polyribosome, và
được kết hợp để tạo thành các phân tử kháng thể hoàn chỉnh trong các rãnh nội bào
(intracellular pool).
Mặt khác, tế bào lympho B cũng biệt hoá thành tế bào ghi nh
ớ (memory cell) để
khi gặp kháng nguyên vào nhắc nhở, chúng có thể nhanh chóng nhớ lại và sản xuất
kháng thể nhanh và nhiều hơn.

Hình 2.7: Tác động của các interleukin ở các giai đoạn khác nhau trong tiến trình
đáp ứng miễn dịch của tế bào lympho B đối với kháng nguyên
(Nguồn: Ian R. Tizard, Immunology, Saunders College Publishing, 1988)

15

2.5. PROTEIN TÁI TỔ HỢP MBP-VT2eB
[4]

Protein tái tổ hợp MBP-VT2eB là một protein gồm hai thành phần: MBP (maltose
binding protein) và VT2eB (tiểu phần B của độc tố vero), có trọng lượng phân tử vào
khoảng 47 kDa.
Protein tái tổ hợp MBP-VT2eB được tổng hợp từ đoạn gen tái tổ hợp trong vector
pMal-c2X đã được chèn vào vi khuẩn E. coli DH5α. Gen vt2eB qui định việc tổng hợp
tiểu phần VT2eB của độc tố vero VT2e được tổ hợp với gen malE qui định việc tổ
ng
hợp nên protein MBP tạo thành đoạn gen tái tổ hợp trong vector pMal-c2X. Hoạt động
của gen này bị chi phối bởi gen ptac, một gen khởi động được hoạt hoá dưới tác động
của IPTG. Khi có mặt IPTG, gen ptac sẽ hoạt động kích ứng việc tổng hợp protein tái
tổ hợp MBP-VT2eB.
Dịch chứa protein MBP – VT2eB được cho qua cột sắc ký có chứa các hạt
amylose. Protein này có ái lực với amylose nên sẽ được giữ lại trong cột s
ắc ký, các
chất khác sẽ bị rửa trôi theo dung dịch đệm.
Cho dung dịch đệm có chứa maltose chạy qua cột sắc ký. Do ái lực của protein
MBP – VT2eB đối với maltosse mạnh hơn đối với amylose nên các protein này gắn
trên amylose sẽ chuyển sang gắn trên maltose và được rửa theo dung dịch đệm ra

ngoài.

2.6. PHẢN ỨNG KẾT TỦA KHUẾCH TÁN KÉP TRÊN THẠCH (Double
diffusion in two dimensions) (Kỹ thuật Ouchterlony)
2.6.1. Sự kết hợp giữa kháng nguyên – kháng thể
[1]

Khi cho tiếp xúc giữa kháng thể đặc hiệu (dịch thể hoặc tế bào) với kháng nguyên
thì phản ứng kết hợp kháng nguyên – kháng thể sẽ xảy ra một cách đặc hiệu. Kháng
thể dịch thể (các loại Ig) thường tồn tại trong huyết thanh và dịch cơ thể nên phản ứng
kháng nguyên – kháng thể còn gọi là phản ứng huyết thanh học.
Phản ứng huyết thanh học là phản ứng xảy ra dựa trên cơ
chế miễn dịch học, đó là
sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên - kháng thể, mà cụ thể là giữa nhóm quyết định
của kháng nguyên với trung tâm hoạt động của kháng thể. Phân tử IgG có hai trung
tâm hoạt động nên kết hợp được với hai phân tử kháng nguyên cùng loại. Các kháng
nguyên có nhiều nhóm quyết định sẽ kết hợp với nhiều phân tử kháng thể tương ứng.
16

Sự kết hợp kháng nguyên – kháng thể dịch thể đặc hiệu nhờ lực liên kết lý hoá và
biểu hiện làm hai pha phản ứng.
• Lực liên kết
- Lực liên kết các phân tử với nhau hay còn gọi là lực liên kết Van der
Waals.
- Lực hút tĩnh điện giữa các nhóm chức khác nhau. Ví dụ: giữa nhóm
amin và carboxyl (NH
2
và COOH) của hai phân tử protein.
- Lực liên kết giữa các cầu nối hydro giữa các nhóm hydroxyl.
• Các pha của phản ứng

Khi thực hiện phản ứng kháng nguyên và kháng thể ở in vitro, kết quả của
phản ứng có thể trực tiếp hoặc gián tiếp quan sát được bằng mắt thường hoặc
bằng kính hiển vi.
Với những phản ứng kháng nguyên – kháng thể có thể quan sát được bằng
mắt thường, phản
ứng thường xảy ra theo hai pha.
Pha thứ nhất
: Đặc trưng bởi sự hấp thụ kháng thể lên bề mặt kháng
nguyên tương ứng, pha này xảy ra nhanh được gọi là pha đặc hiệu hay pha
không nhìn thấy. Trong pha này, thực chất là sự tìm đến và kết hợp đặc hiệu giữa
nhóm quyết định của kháng nguyên với trung tâm hoạt động của kháng thể, tạo
thành phức hợp kháng nguyên – kháng thể.
Pha thứ hai
: Tiếp sau pha thứ nhất, xảy ra chậm hơn và biểu hiện ra ngoài
nên có thể nhìn thấy được như ngưng kết thành mạng lưới, tạo thành hạt lổn
nhổn, mịn như cát, hoặc như sợi bông, hoặc kết tủa thành cặn màu trắng lắng
xuống đáy; pha này thực chất là theo nguyên lý lý hoá đơn thuần, nên còn gọi là
pha không đặc hiệu hay pha nhìn thấy được.