Đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch đối với Protein MBP-VT2eB trên heo.pdf

i




***000***










PROTEIN MBP-


: 
: 2001-2005


Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8/2005



ii





B















PROTEIN MBP-

 
 TR








Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8/2005





iii




Con t
.
Ch 
-  
ch 
-         

 

- TS.  

- 

-  anh 
     

-  

- 

- B  CNSH27
ch 


8 








iv

TÓM TẮT

TRƢƠNG THỊ THẢO UYÊN, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005.
“ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI PROTEIN MBP-
VT2eB TRÊN HEO”

Giáo viên hƣớng dẫn:
TS. Nguyễn Ngọc Hải
Sử dụng kháng nguyên là protein tái tổ hợp MBP-VT2eB pha trong keo phèn
với liều 50µg/heo và 75µg/heo có lập lại và không lập lại gây đáp ứng miễn dịch trên
heo. Thí nghiệm đƣợc bố trí ngẫu nhiên trên 25 cá thể với 5 lô thí nghiệm. Sau đó thu
kháng huyết thanh để định hiệu giá kháng thể theo 2 phƣơng pháp: trung hòa độc tố
trên tế bào vero và khuyếch tán kết tủa trên thạch.
Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
- Protein tái tổ hợp MBP-VT2eB ở liều 50µg và 75µg/heo pha trong keo phèn là
loại kháng nguyên an toàn với heo.
- Hoàn thiện qui trình định hiệu giá kháng huyết thanh bằng phƣơng pháp kết tủa
khuyếch tán trên thạch.
- Hoàn thiện qui trình định hiệu giá kháng huyết thanh bằng phƣơng pháp trung
hòa độc tố trên tế bào vero: huyết thanh phải bất hoạt trƣớc khi thử nghiệm và
không bổ sung sodium azid vào trong huyết thanh.
- Liều tiêm 50µg và 75µg/heo có lập lại và không lập lại không tạo đủ lƣợng
kháng thể để phát hiện bằng phƣơng pháp kết tủa khuyếch tán trên thạch và
trung hòa độc tố trên tế bào vero.

v




Tiêu đề ............................................................................................................ Trang
Trang bìa .................................................................................................................. i
Trang tựa ................................................................................................................. ii
Lời cảm ơn ............................................................................................................. iii
Tóm tắt ................................................................................................................... iv
Mục lục ................................................................................................................... v
Danh sách các bảng ............................................................................................. viii
Danh sách các hình ................................................................................................ ix

1.  ............................................................................................................ 1
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................... 1
1.2 MỤC TIÊU VÀ YÊU CẦU ........................................................................ 1
2. .................................................................................. 2
2.1 VACXIN ..................................................................................................... 2
2.1.1 Lịch sử ra đời vacxin ............................................................................ 2
2.1.2 Đáp ứng miễn dịch .............................................................................. 2
2.1.2.1Kháng nguyên ........................................................................... 2
2.1.2.2 Kháng thể ................................................................................. 3
2.1.2.3 Cơ chế đáp ứng miễn dịch ...................................................... 4
2.1.2.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến đáp ứng miễn dịch ......................... 7
2.1.3 Phân loại ....................................................................................................... 9

2.1.3.1 Vacxin sống .............................................................................. 9
2.1.2.2 Vacxin vô hoạt ....................................................................... 10
2.1.2.3 Vacxin phân tử ....................................................................... 10
2.2 BỆNH PHÙ VÀ ĐỘC TỐ VT2e .............................................................. 12
2.2 PROTEIN TÁI TỔ HỢP MBP-VT2eB .................................................... 14
2.3 PHƢƠNG PHÁP OUCHTERLONY .................................................................. 14
2.3.1 Nguyên tắc .................................................................................................. 14
2.3.2 Định tính kháng nguyên- kháng thể bằng phƣơng pháp khuyếch tán trên
thạch ...................................................................................................................... 16



vi



2.4 PHẢN ỨNG TRUNG HÕA ĐỘC TỐ VEROTOXIN TRÊN TẾ BÀO
VERO .............................................................................................................. 16
2.4.1 Sơ lƣợc về tế bào Vero ...................................................................... 16
2.4.2 Nguyên tắc phản ứng trung hòa độc tố .............................................. 17
2.4.3 Đánh giá hiệu quả vacxin bệnh phù bằng phƣơng pháp trung hoà độc
tố verotoxin trên môi trƣờng nuôi cấy tế bào vero ...................................... 17
3.  ........................................ 18
3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM .................................................................... 18
3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ..................................................................... 18
3.3 VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM ........................................................................ 18
3.3.1 Sinh vật thí nghiệm ............................................................................ 18
3.3.2 Hóa chất thí nghiệm ........................................................................... 18
3.3.3 Dụng cụ thí nghiệm ............................................................................ 19
3.4 PHƢƠNG PHÁP ...................................................................................... 20

3.4.1 Bố trí thí nghiệm ................................................................................ 20
3.4.2 Cách pha dịch tiêm ............................................................................. 20
3.4.3 Lấy máu .............................................................................................. 20
3.4.4 Định tính kháng thể bằng phƣơng pháp Ouchterlony ........................ 21
3.4.5 Xác định liều TCID
50 ...............................................................................................................
22
3.4.5.1Chuẩn bị dịch độc tố ............................................................... 22
3.4.5.2Chuẩn bị tế bào vero ............................................................... 22
3.4.5.3Xác định liều TCID
50 ..............................................................................................
23
3.4.6 Thực hiện phản ứng trung hòa độc tố ................................................ 25
3.5 Các chỉ tiêu theo dõi ................................................................................. 26
4. ........................................................................ 27
4.1 CÁC TRIỆU CHỨNG CỦA HEO SAU KHI TIÊM VACXIN ................. 27
4.2 HIỆU GIÁ KHÁNG HUYẾT THANH THEO PHƢƠNG PHÁP KẾT TỦA
KHUYẾCH TÁN TRÊN THẠCH ....................................................................... 27
4.2.1 Với kháng nguyên là độc tố của E. coli H28 ..................................... 27
4.2.2 Với kháng nguyên MBP-VT2eB ........................................................ 28
4.3 LIỀU TCID50 CỦA DỊCH LỌC VI KHUẨN ......................................... 27
4.4 HIỆU GIÁ KHÁNG HUYẾT THANH TRÊN MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY



vii



TẾ BÀO ......................................................................................................... 30

4.4.1 Đối với mẫu huyết thanh có sodium azid chƣa bất hoạt .................... 30
4.4.2 Đối với mẫu huyết thanh có sodium azid và có bất hoạt ................... 31
4.4.3 Thí nghiệm chứng minh sodium azid gây chết tế bào vero .............. 33
4.4.3.1 Mẫu huyết thanh có sodium azid ........................................... 33
4.4.3.1 Đối với mẫu không có sodium azid ....................................... 33
4.4.4 Đối với mẫu huyết thanh không có sodium azid và có bất hoạt ........ 33
5. ............................................................................. 36
5.1 KẾT LUẬN ............................................................................................... 36
5.2 ĐỀ NGHỊ .................................................................................................. 36
6. ............................................................................... 38
 ......................................................................................................... 39
Thành phần hóa chất ............................................................................................. 39
Bảng phân tích biến lƣợng tăng trọng heo thí nghiệm ......................................... 41
Bảng 3. Kết quả đo OD620nm đối với mẫu có sodium azid, có bất hoạt ............ 42
Bảng 4. Kết quả đo OD620nm đối với mẫu không có sodium azid, có bất hoạt 43

viii



DANH SÁCH CÁC BẢNG
BẢNG ........................................................................................................ TRANG
Bảng 1. Tăng trọng của heo thí nghiệm trong thời gian thí nghiệm .................... 25
Bảng 2. Kết quả đo OD trên đĩa nuôi cấy tế bào với dịch lọc vi khuẩn ............... 27
Bảng 3. Kết quả đo OD620nm đối với mẫu có sodium azid ................................ 42
Bảng 4. Kết quả đo OD620nm đối với mẫu không có sodium azid .................... 43

ix

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ
HÌNH .................................................................................................................... TRANG
Biểu đồ 4.1 Đồ thị chuẩn độ độc tố ...................................................................... 28
Hình 2.1. Cấu trúc kháng thể .................................................................................. 3
Hình 2.2. Liên kết kháng nguyên- kháng thể ....................................................... 15
Hình 4.1 Kết quả dƣơng tính với huyết thanh thỏ ................................................ 26
Hình 4.2 Kết quả âm tính trên huyết thanh heo .................................................... 26
Hình 4.3 Hình tế bào vero chết do sodium azid ................................................... 33
Hình 4.4 Hình tế bào vero chết do độc tố ............................................................. 33
Hình 4.5 Giếng đối chứng độc tố đã nhuộm ........................................................ 33
Hình 4.6 Giếng đối chứng tế bào đã nhuộm ......................................................... 33
















1

1





1.1 
Độc tố verotoxin VT2e do E. coli tiết ra là tác nhân chính gây bệnh phù trên
heo sau cai sữa gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi heo ở nƣớc ta.
Việc sử dụng kháng sinh để điều trị phù ở heo tuy có hiệu quả nhƣng gây ra
nhiều triệu chứng phụ nhƣ rối loạn tiêu hoá, tạo ra các chủng vi sinh vật kháng kháng
sinh gây khó khăn cho những lần trị bệnh về sau. Do đó sử dụng vacxin để phòng bệnh
phù do E. coli trên heo đƣợc xem là liệu pháp thích hợp nhất. Một số tác giả đã thử
nghiệm vacxin nhƣợc độc, hoặc vacxin chết ...bƣớc đầu ghi nhận hiệu quả bảo vệ nhất
định. Tuy vậy, các phản ứng phụ vẫn là những trở ngại lớn cho việc áp dụng rộng rãi
những loại vacxin này. Vacxin tái tổ hợp đƣợc tạo ra bằng cách loại bỏ yếu tố gây
bệnh của vi sinh vật mà vẫn giữ đƣợc đặc tính kháng nguyên của chúng đang đƣợc các
nhà khoa học quan tâm nhằm khắc phục những nhƣợc điểm nói trên.
Hiện nay, TS. Nguyễn Ngọc Hải và các cộng sự đã thành công trong việc tạo ra
đƣợc E. coli mang gen mã hoá cho tiểu phần B của độc tố VT2e và tinh sạch đƣợc
protein này. Từ thực tế đó, đƣợc sự chấp nhận của bộ môn Công Nghệ Sinh Học, với
sự hƣớng dẫn của TS. Nguyễn Ngọc Hải, chúng tôi thực hiện đề tài: “
-”.
1.2 
- Mục tiêu
Đánh giá khả năng ứng dụng protein tái tổ hợp MPB-VT2e trong sản xuất vacxin
phòng bệnh phù do E. coli trên heo.
- Yêu cầu
 Xây đựng thí nghiệm kiểm tra khả năng đáp ứng miễn dịch của MBP-VT2eB
trên heo.

 Định tính kháng huyết thanh bằng phƣơng pháp khuyếch tán trên thạch.
 Xác định liều TCID
50
(Tissue Culture Infectious Dose) trên tế bào vero
 Kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng MBP-VT2eB bằng phƣơng pháp trung hòa
độc tố trên tế bào vero.


2
2






2.1 VACXIN

Hiện nay vacxin đƣợc xem là một phƣơng pháp hữu hiệu để phòng bệnh trên
ngƣời và động vật. Từ xa xƣa khi mà con ngƣời vẫn chƣa hiểu biết về hệ thống miễn
dịch đặc hiệu thì ngƣời Trung Quốc đã biết sử dụng những vảy từ ngƣời bị bệnh đậu
mùa để phòng bệnh này. Năm 1798, Edward Jenner đã quan sát thấy hiện tƣợng những
ngƣời vắt sữa bò thƣờng tiếp xúc với những con bò bị đậu mùa thì không bị nhiễm
bệnh đậu mùa. Từ đó ông sử dụng virus gây bệnh đậu mùa trên bò nhƣ một vacxin
chống lại bệnh đậu mùa trên ngƣời. Sau này, ngƣời ta biết rằng đó là nhờ những
protein trên bề mặt virus gây bệnh đậu mùa trên bò tƣơng tự nhƣ những protein có trên
bề mặt của virus gây đậu mùa trên ngƣời. Và Pasteur là ngƣời đặt ra nền móng cho
việc sử dụng vacxin khi khám phá ra nguyên lý: “Muốn phòng bệnh phải gây cho thú
bệnh nhẹ”. Từ đó đến nay, ngƣời ta đã sản xuất ra nhiều loại vacxin phòng nhiều loại
bệnh do vi khuẩn, virus, kí sinh trùng gây ra nhƣ: bệnh đậu mùa, bệnh lở mồm long

móng, bệnh tả...với nhiều dạng tồn tại khác nhau. Nhƣng dù bất cứ dạng nào vacxin
cũng mang một chức năng chung là tạo miễn dịch cho cơ thể ngƣời và động vật, phòng
chống lại các loại bệnh truyền nhiễm và nhiều tác nhân gây hại khác [4].

2.1.2.1 Kháng nguyên[4]
a. Định nghĩa
Kháng nguyên là một chất tự nhiên hay tổng hợp có khả năng gây đáp ứng miễn
dịch khi đƣợc đƣa vào cơ thể của một động vật thích hợp hoặc là chất có khả năng
phản ứng với một kháng thể hay một tế bào của hệ thống miễn dịch. Trên cấu trúc
phân tử của kháng nguyên có sự hiện diện của các quyết định kháng nguyên gọi là
epitope.
b. Tính chất của kháng nguyên
 Tính sinh miễn dịch: tính sinh miễn dịch của một kháng nguyên phụ thuộc
vào:


3
3



Trọng lƣợng phân tử : kháng nguyên phải có trọng lƣợng phân tử đạt tối
thiểu là 10.000Da. Tuy nhiên có một số chất có trọng lƣợng phân tử nhỏ nhƣng
có tính sinh miễn dịch vì chúng gắn với protein khác để trở thành kháng nguyên
hoàn chỉnh, ngƣợc lại một số chất có trọng lƣợng phân tử lớn nhƣng không có
tính sinh miễn dịch.
Lƣợng epitope khác loài vì hệ thống miễn dịch không phản ứng với các
epitope cùng loài.
 Tính đặc hiệu
Tính đặc hiệu của kháng nguyên do những epitope quyết định. Các

epitope là vị trí để kháng thể hay các lympho T mẫn cảm gắn với kháng nguyên
một cách đặc hiệu.
Tính đặc hiệu của kháng nguyên rất nghiêm ngặt tuy nhiên đôi khi vẫn xảy ra
hiện tƣợng hai kháng nguyên khác nhau có thể cho phản ứng chéo nhau.
2.1.2.2 Kháng thể[4]
a. Định nghĩa
Kháng thể (immunoglobin Ig) là protein dạng cầu đƣợc tổng hợp bởi tế bào
lympho và tế bào plasma khi bị kích thích bởi kháng nguyên. Nó đƣợc tạo ra để
giúp sinh vật chống đỡ các yếu tố kháng nguyên có hại vào cơ thể.
b. Cấu trúc tổng quát của kháng thể
Phân tử immunoglobulin gồm một hay nhiều đơn vị hình thành, chúng có cấu
trúc tƣơng đối giống nhau. Mỗi đơn vị là một phân tử protein có 4 chuỗi
polypeptit giống nhau từng đôi một: 2 chuỗi nhẹ và 2 chuỗi nặng, chúng đƣợc nối
với nhau bằng những cầu nối disulfua.
Kháng thể đƣợc cấu tạo từ hai loại chuỗi polypeptit là chuỗi nặng và chuỗi nhẹ
đƣợc liên kết với nhau bằng các liên kết disulfide.
Các chuỗi nhẹ bao gồm hai dạng κ, λ, hai dạng này chung cho tất cả các loại
kháng thể. Các chuỗi nhẹ đều đƣợc cấu tạo từ hai phần:
 Phần hằng định: kí hiệu C
L
(constant) có tận cùng –COOH với trình tự acid
amin tƣơng đối không đổi
 Phần thay đổi: kí hiệu V
L
(variable) có tận cùng là –NH
2
. Trật tự acid amin
trong vùng này thay đổi từng nhóm một, rất khác nhau từ cá thể này đến cá

4
4



thể khác và ngay trong một cá thể, phần này đƣợc kí hiệu V
κ
(cho type
kappa) và V
λ
(cho type lambda). [3]
Có các kiểu chuỗi nặng nhƣ: µ, δ, γ1, γ2, γ3, γ4, α, ε và dạng của chuỗi nặng sẽ
qui định phân loại lớp nhƣ IgM, IgD, IgG, IgA, và IgE và dƣới lớp nhƣ IgG1,
IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 (5) . Các chuỗi nặng đƣợc cấu tạo từ hai vùng:
vùng hằng định (CH) và vùng dễ biến đổi (VH), các vùng dễ biến đổi có khu vực
tận cùng là N. Các vùng dễ biến đổi bao gồm 3 vùng siêu biến (hypervariable)
đƣợc tách biệt bằng các vùng bảo thủ hơn (framework regions) ở giữa. Những
vùng này là những vùng liên kết với kháng nguyên hay còn gọi là paratop, vì vậy
nó còn đƣợc gọi là vùng định tính bổ sung (complementarity-detemining regions)
[15]. Vùng nằm giữa CH1 và CH2 của chuỗi H đựơc gọi là vùng khớp hay vùng
bản lề đảm bảo cho tính mềm dẻo của các phân tử kháng thể đồng thời là hai
cánh tay (VL, CL, VH, CH1) di động trong không gian.



2.1.2.3 Cơ chế đáp ứng miễn dịch
Khi cơ thể đã đƣợc miễn dịch thì khi tác nhân gây bệnh xâm nhập, chúng
sẽ không thực hiện đựơc quá trình gây bệnh và nhanh chóng bị loại trừ khỏi cơ
thể. Nhƣ vậy vacxin là yếu tố khởi phát của quá trình đáp ứng miễn dịch và kháng
nguyên là thành phần cơ bản của vacxin. Khi đƣa vacxin vào cơ thể cũng có nghĩa

là đƣa một loại kháng nguyên lạ vào cơ thể, kháng nguyên này sẽ kích thích cơ
. Cấu trúc kháng thể
(Timothy G. Standish, 2003)



5
5



thể thú sản xuất ra một loại protein mới có chức năng bảo vệ và tham gia miễn
dịch là kháng thể (antibody).
Nhƣ vậy việc tiêm vacxin vào cơ thể thú chính là việc tập dƣợt cho cơ thể
thực hiện quá trình đáp ứng miễn dịch chống lại tác nhân gây bệnh khi chúng xâm
nhập vào những lần sau đó. Hay còn gọi là gây miễn dịch chủ động.
Khi cơ thể tiếp nhận vacxin, miễn dịch đƣợc tạo ra chính là sự huy động
toàn bộ hệ thống miễn dịch tham gia. Bao gồm hệ thống miễn dịch trung ƣơng, hệ
thống miễn dịch ngoại biên và nhiều loại tế bào có thẩm quyền miễn dịch khác.
Do đó quá trình đáp ứng miễn dịch chính là sự hoạt động của hệ miễn dịch, là sự
phối hợp nhịp nhàng của hệ thống tủy xƣơng nhằm tạo ra các loại tế bào nguồn,
rồi từ đó chuyển hóa thành các tế bào có thẩm quyền miễn dịch bao gồm tế bào
lympho B, lympho T, đại thực bào và một số tế bào chuyên biệt khác. Đáp ứng
miễn dịch còn đƣợc hổ trợ và tham gia của các cơ quan nhƣ hạch, lách, các mô
lymphô đƣờng ruột, đƣờng hô hấp, cũng nhƣ tế bào tua (dendric cells), các tế bào
trình diện kháng nguyên (antigen presenting cells-APC) và một số thành phần
khác.
Cả hai quá trình cá thể thu nhận đƣợc: miễn dịch dịch thể và miễn dịch
trung gian tế bào chính là hệ quả của sự tiếp nhận kháng nguyên, hoạt hóa, biệt
hóa và sự tham gia của các tế bào lympho B, lympho T.

Quá trình đáp ứng miễn dịch dịch thể do tế bào lymphô B đảm nhận. Từ tế
bào nguồn tủy xƣơng biệt hóa thành tế bào lympho B khởi thủy (pro-B) sau đó
thành tiền lymphoB (pre- B). Tiếp theo các tế bào này sẽ đƣợc biệt hoá thành
lympho B chƣa chín có bộc lộ bề mặt IgM. Sau đó lympho B chín muồi đã bộc lộ
IgM và IgD bề mặt. Nếu lympho B chín không gặp kháng nguyên sẽ bị phân hủy.
Lympho B khi gặp kháng nguyên và đƣợc sự hợp tác hổ trợ của lympho T giúp
(helper T for B cell) hoặc hợp tác giúp đỡ của lympho T hổ trợ sẽ tiếp tục đƣợc
biệt hóa thành nguyên bào (B-blast) và tế bào plasma (plastmocyte). Chỉ có tế bào
plasma mới có khả năng tiết kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên lạ. Các kháng
thể này đi vào máu và tồn tại trong huyết thanh hoặc chất dịch của cơ thể. Mặt
khác nguyên bào B sẽ trở thành tế bào B ghi nhớ (memory- B) để khi gặp kháng
nguyên vào nhắc nhở, chúng có thể nhanh chóng nhớ lại và sản xuất kháng thể
nhanh và nhiều hơn [5] .


6
6



Miễn dịch trung gian tế bào do tế bào lympho T đảm nhận. Các tế bào
nguồn bắt đầu từ tủy xƣơng di tản xuống tuyến ức và đƣợc tuyến ức huấn luyện,
biệt hóa rồi non hóa trở lại để trở thành tiền lympho T. Các tiền lympho T tiếp tục
đƣợc biệt hóa thành ở vùng vỏ tuyến ức để trở thành lympho T chƣa chín. Các
lympho T chƣa chín đƣợc biệt hóa tiếp tục để trở thành lympho T chín đi vào hệ
máu ngoại vi và đi đến các cơ quan tổ chức khác cƣ ngụ tại các vùng phụ thuộc
tuyến ức của lách và hạch. Khi đại thực bào đƣa thông tin kháng nguyên đến các
lympho T tiếp nhận, rồi biệt hóa để trở thành nguyên bào lympho T rồi tiếp tục trở
thành nhóm tế bào mẫn cảm với kháng nguyên có chức năng nhƣ một kháng thể
đặc hiệu. Nhƣ vậy kháng thể tế bào là loại tế bào có thẩm quyền miễn dịch

lympho T đã đƣợc biến đổi, biệt hóa trở thành tế bào gây độc có tác dụng tiêu diệt
kháng nguyên. Đặc biệt, lympho T sau khi đƣợc biệt hóa tiếp xúc với kháng
nguyên đặc hiệu còn có khả năng sản xuất một số chất dịch ngoại bào [1]. Các
chất này có tác dụng trợ giúp đắc lực và tăng cƣờng quá trình đáp ứng miễn dịch
còn đƣợc gọi là lymphokin, đặc trƣng là các loại cytokine (gồm các loại
interleukin IL-1, IL-2...), chemokin và các yếu tố gây hoại tử tế bào (TNF). Một
số nguyên bào T mẫn cảm cũng trở thành “ tế bào nhớ”, có vai trò trong “trí nhớ
miễn dịch”. Ngoài ra còn có một số tế bào T khác làm nhiệm vụ duy trì đáp ứng
miễn dịch nhƣ: lymphoT cảm ứng (T
I
-inducer), lympho T hỗ trợ (T
H
-helper),
lympho T ức chế (T
S
- suppressor), lympho T hỗ trợ cho lympho T ức chế (T
HS
-
suppressor for helper), lympho T quá mẫn (T
D
- delayed-type hypersensitivity)[3].
Để tạo khả năng phòng hộ có hiệu quả cho cơ thể thú thì vacxin phải đảm
bảo các yêu cầu sau:
 An toàn: vacxin không đƣợc gây bệnh và không hay ít gây phản ứng có
hại trên cơ thể của thú.
 Vô trùng: vacxin chỉ chứa duy nhất hay một vài loại kháng nguyên
đƣợc chọn làm vacxin mà không bị nhiễm tạp các loại khác.
 Hiệu lực: vacxin phải kích thích sinh miễn dịch cho cơ thể. Tính hiệu
lực thực chất là mức độ biểu hiện gây miễn dịch của kháng nguyên. Vacxin có
hiệu lực cao hay thấp, tức là nói đến mức độ gây miễn dịch của vacxin.

Khả năng phòng hộ của vacxin phụ thuộc vào yếu tố quyết định tính miễn
dịch của chế phẩm. Yếu tố này chính là thành phần protein đặc biệt có trên bề mặt


7
7



của tác nhân gây bệnh hay trên bề mặt của chế phẩm vacxin của chính tác nhân
gây bệnh đó. Thành phần này còn đƣợc gọi là kháng nguyên do một gen hay một
số gen của vi sinh vật tổng hợp nên. Những gen này đƣợc gọi là gen kháng
nguyên. Ngƣời ta có thể clone gen này và chuyển vào một hệ thống vectơ thích
hợp để sản xuất ra loại protein của gen kháng nguyên làm vacxin. Protein này còn
đƣợc gọi là protein tái tổ hợp dùng sản xuất vacxin tái tổ hợp [3].
2.1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch [4]
Bản thân túc chủ
Những loài khác nhau thì khả năng đáp ứng miễn dịch khác nhau. Ở những
cá thể khác nhau thì tính sinh miễn dịch cũng khác nhau, do:
 Di truyền: ngƣời ta có thể tăng khả năng đáp ứng miễn dịch bằng cách
tuyển chọn những nhóm giống có khả năng đáp ứng miễn dịch cao. Tùy cơ địa
của từng cá thể mà có thể có hiện tƣợng dị ứng khi gây miễn dịch.
 Tuổi: thú quá nhỏ thì khả năng đáp ứng miễn dịch không cao do hệ
thống cơ quan miễn dịch của thú chƣa phát triển hoàn chỉnh. Hơn nữa những thú
nhỏ đều có kháng thể do mẹ truyền nên những kháng thể này có thể trung hòa
kháng nguyên đƣa vào.
 Tình trạng sức khỏe: những thú khỏe mạnh khả năng đáp ứng miễn dịch
cao hơn những thú bị bệnh hay sức khỏe yếu. Do đó chỉ gây miễn dịch với những
thú có sức khỏe tốt , không mắc các bệnh truyền nhiễm khác.
 Chế độ dinh dƣỡng: những thú đƣợc nuôi dƣỡng tốt sẽ đáp ứng miễn

dịch tốt hơn những thú không đƣợc chăm sóc tốt.
Kháng nguyên
 Tính lạ kháng nguyên
Đáp ứng miễn dịch xảy ra khi có sự khác biệt chủng loài giữa kháng
nguyên và túc chủ. Khả năng đáp ứng miễn dịch tăng khi kháng nguyên càng lạ.
 Cấu tạo hóa học của kháng nguyên
Kháng nguyên có bản chất protein hay polysaccharide thì khả năng gây
đáp ứng miễn dịch cao cả khi chúng ở dạng hòa tan hay trong cấu tạo phức tạp.
Các kháng nguyên đƣợc tổng hợp từ một loại axit amin thì khả năng kích ứng
miễn dịch thấp hơn so với những kháng nguyên đƣợc tổng hợp từ hai loại axit


8
8



amin và từ những axit amin mạch vòng (đặc biệt là tyrozine). Các polypeptide
đƣợc tổng hợp từ axit amin dạng D thì khả năng gây đáp ứng miễn dịch cao vì ít
bị biến đổi.
Các kháng nguyên có bản chất là lipit, steroid, axit nucleic khả năng
kích ứng miễn dịch thấp hay không có trừ khi chúng đƣợc gắn với protein tải.
 Kích thƣớc của phân tử kháng nguyên
Kháng nguyên có kích thƣớc càng lớn và cấu trúc càng phức tạp thì khả
năng kích ức miễn dịch càng cao vì một phân tử kháng nguyên càng lớn thì nó
càng có cấu trúc phức tạp và có nhiều quyết định kháng nguyên. Đây là yếu tố
đảm bảo tính sinh miễn dịch.
Hơn nữa kháng nguyên có cấu trúc phân tử càng lớn thì càng dễ bị đại
thực bào phát hiện và xử lý nên nó khả năng kích ứng miễn dịch cao. Những
kháng nguyên có cấu trúc phân tử nhỏ dễ bị đại thực bào bỏ qua nên khả năng

kích ứng miễn dịch thấp.
Cách gây miễn dịch và liều lƣợng kháng nguyên
 Đƣờng đƣa kháng nguyên vào cơ thể vật chủ: Với những kháng nguyên
mạnh, đƣa kháng nguyên vào đƣờng mạch máu có thể dễ dàng gây đáp ứng miễn
dịch: nhƣ vi khuẩn, virus, tế bào. Những kháng nguyên hòa tan thì phải có quy
trình gây miễn dịch thích hợp tốt nhất là đƣờng tiêm trong da, dƣới da.
 Liều lƣợng kháng nguyên: nếu lƣợng kháng nguyên quá thấp thì không
đủ gây đáp ứng miễn dịch. Ngƣợc lại nếu lƣợng kháng nguyên nhiều quá sẽ gây
ức chế miễn dịch.
 Quy trình gây miễn dịch có ảnh hƣởng lớn tới tính sinh miễn dịch của
phân tử kháng nguyên. Cùng một loại kháng nguyên nếu gây miễn dịch trên hai
qui trình khác nhau thì khả năng gây đáp ứng miễn dịch khác nhau. Mỗi một loại
kháng nguyên thích hợp với một qui trình gây miễn dịch riêng. Đối với những
kháng nguyên yếu thì phải tuân theo một qui trình miễn dịch nghiêm ngặt và phải
chủng nhiều lần mới có hiệu quả. Trong khi đó những kháng nguyên mạnh thì chỉ
cần chủng một lần.
Hiệu ứng cộng lực kháng nguyên
 Các nhà miễn dịch học đã chứng minh rằng: nếu gây miễn dịch nhiều
loại kháng nguyên cùng lúc cho thú thì lƣợng kháng thể đặc hiệu sinh ra tƣơng


9
9



ứng với mỗi loại kháng nguyên sẽ ít nhất ngang bằng hay nhiều hơn khi kháng
nguyên đó kích thích một mình. Đây là hiện tƣợng cộng lực kháng nguyên. Tuy
nhiên đối với những kháng nguyên có cấu trúc hóa học gần giống nhau thì xảy ra
hiện tƣợng cạnh tranh kháng nguyên. Nếu cùng một lúc mẫn cảm hai loại kháng

nguyên: một liều mạnh, một liều nhẹ thì thú có thể chỉ phản ứng với kháng
nguyên liều mạnh.
Phản ứng thứ phát
 Nếu thú đã đƣợc mẫn cảm với kháng nguyên đó một lần thì hàm lƣợng
kháng thể sẽ tăng sớm và nhiều hơn nếu thú gặp lại kháng nguyên đó. Đó là nhờ
tế bào lympho có khả năng nhớ để khi gặp lại kháng nguyên đó thì sẽ lập tức tăng
sinh thành dòng tế bào có hoạt tính miễn dịch.
Chất bổ trợ
 Hiệu quả đáp ứng miễn dịch sẽ tăng nếu bổ sung tá chất vào kháng
nguyên. Vì tá chất tăng khả năng thực bào của đại thực bào đối với kháng nguyên,
tăng khả năng tồn tại của kháng nguyên trong cơ thể thú và gây phản ứng viêm
không đặc hiệu làm tăng tính sinh miễn dịch.

Có nhiều cách để phân loại vacxin nhƣ dựa theo phƣơng pháp sản xuất, bản
chất sinh học của kháng nguyên hay nguồn cung cấp kháng nguyên. Nếu phân loại
theo tính chất sinh học thì vacxin đƣợc phân làm 3 nhóm sau:
2.1.3.1 Vacxin sống (lived vaccine)
Vacxin cƣờng độc [4]
Đây là loại vacxin đƣợc lấy từ những chủng vi sinh vật gây bệnh có độc
lực cao. Tuy nhiên, các nhà miễn dịch học đã dùng số lƣợng rất nhỏ để vi sinh vật
không đủ sức gây bệnh nhƣng lại gây đƣợc đáp ứng miễn dịch. Hiện nay,vacxin
này không còn đƣợc sử dụng vì độ an toàn không cao.
Vacxin nhƣợc độc (attenuated vaccine)[4]
Vacxin nhƣợc độc đƣợc tạo ra từ những chủng vi sinh vật có độ lực thấp
hoặc từ những chủng vi sinh vật có độc lực cao đƣợc làm yếu đi để chúng không
có khả năng gây bệnh mà vẫn giữ đƣợc đặc tính kháng nguyên. Các chủng vi sinh
vật này đƣợc tạo ra bằng cách nuôi các chủng vi sinh vật có độc lực cao trong môi


10

10



trƣờng không thích hợp, các vi sinh vật này sẽ thích nghi dần dần và trở thành
không độc. Vì vi sinh vật vẫn còn sống và có khả năng sinh sản trong cơ thể kí
chủ nên nó kích thích các tế bào nhớ sản xuất kháng thể liên tục. Tuy nhiên, số
lƣợng vi sinh vật phát triển trong cơ thể kí chủ khó có thể kiểm soát và trong một
số trƣờng hợp các vi sinh vật có thể phục hồi gây bệnh. Vacxin này không nên
dùng cho những con thú bị suy giảm miễn dịch. Hiện nay, ngƣời ta dùng một số
phƣơng pháp công nghệ sinh học để loại bỏ gene gây bệnh để tạo ra vacxin an
toàn hơn.
2.1.2.2 Vacxin vô hoạt (inactivated vaccine)
Tác nhân gây bệnh sẽ bị giết hay bất hoạt bằng phóng xạ, formalin, nhiệt
độ...không còn khả năng nhân lên trong vật chủ nhƣng vẫn đảm bảo đặc tính
kháng nguyên của chúng. Vacxin này an toàn hơn so với vacxin sống, dễ sản xuất
và sử dụng. Tuy nhiên nó không có khả năng hoặc nếu có thì rất ít kích thích tế
bào T gây độc và phải sử dụng lập lại nhiều lần.
2.1.2.3 Vacxin phân tử
a. Vacxin kết hợp (conjugate vaccine)[10]
Ngƣời ta chỉ sử dụng những phần của tác nhân gây bệnh có khả năng tạo ra
đáp ứng miễn dịch nhƣ protein hay carbonhydrate. Các vi sinh vật gây bệnh sẽ bị
phá vỡ từng phần và các thành phần sẽ đƣợc tinh sạch. Ngƣời ta chỉ sử dụng một
vài thành phần để tiêm. Bằng cách này ngƣời ta sẽ tránh đƣợc những nguy cơ tiềm
ẩn của độc tố và những thành phần che khuất kháng nguyên ảnh hƣởng đến khả
năng đáp ứng miễn dịch bị loại bỏ. Tính chất kháng nguyên của các thành phần
này phải đƣợc kiểm tra khả năng tạo đáp ứng miễn dịch chính xác và hiệu quả.
Dựa trên hiện tƣợng một số vi khuẩn bị đột biến mất vỏ thì không có khả
năng gây bệnh, ngƣời ta đã dùng vỏ polysaccharide nhƣ một kháng nguyên để làm
vacxin. Tuy nhiên polysaccharide là những kháng nguyên độc lập với tế bào T (T-

independent antigenes). Do đó khả năng nhớ là không có hay nếu có thì rất thấp
và việc tiêm lập lại nhiều lần để tăng hàm lƣợng kháng thể cũng không hiệu quả.
Ngƣời ta sử dụng thêm protein mang để liên kết với đƣờng. Việc này sẽ chuyển
kháng nguyên độc lập với tế bào T thành kháng nguyên phụ thuộc tế bào T nhờ
việc tạo ra những epitope của tế bào T.


11
11



Kỹ thuật này đã thành công trên những loại vacxin viêm gan B,viêm gan A,
Salmonella typhi...
b.Vacxin tái tổ hợp (recombinant vaccine)[17]
Cùng với sự tiến bộ vƣợt bậc của các kỹ thuật sinh học phân tử, xu hƣớng sản
xuất vacxin tái tổ hợp ngày càng đƣợc ứng dụng rộng rãi. Việc sản xuất vacxin
bằng các công nghệ truyền thống có nhiều hạn chế không chỉ do tính an toàn mà
còn do nhiều tác nhân gây bệnh không thể nuôi cấy trên qui mô lớn. Gen mã hóa
cho protein immunoprotective (những kháng nguyên tạo ra phản ứng miễn dịch tự
nhiên) trên vi sinh vật gây bệnh sẽ đƣợc clone. Những gen này sau đó đƣợc tái tổ
hợp với DNA của một vector của loài vi khuẩn hay virus khác, thƣờng là plasmid
rồi đƣợc đƣa vào tế bào vi sinh vật tạo nên dòng vi sinh vật tái tổ hợp. Những vi
sinh vật tái tổ hợp này sẽ đƣợc nuôi cấy trong các bình lên men lớn để có thể thu
đƣợc lƣợng lớn protein tái tổ hợp mà sau đó sẽ đƣợc tinh sạch dễ dàng. Bằng kỹ
thuật này ngƣời ta có thể sản xuất vacxin trên qui mô công nghiệp với giá thành
thấp. Hiện nay, ngƣời ta đã thành công trong việc sản xuất vacxin hepatitis B, B.
pertussis,...bằng phƣơng pháp này. Tuy nhiên việc nghiên cứu vacxin này đòi hỏi
tốn nhiều thời gian, tài chính, trang thiết bị đắt tiền.
Ngƣời ta cũng có thể dùng kỹ thuật công nghệ sinh học để loại bỏ những gen

mã hóa cho những protein “không cần thiết”. Do đó có thể làm giảm tính độc của
vi sinh vật.
c.Vacxin peptide tổng hợp [17]
Hƣớng sản xuất vacxin này phát triển nhanh nhờ sự tiến bộ của kỹ thuật tạo
dòng và giải trình tự của DNA. Ngƣời ta nghiên cứu các cấu trúc không gian và
trình tự của các epitope của kháng nguyên đƣợc nhận biết bởi tế bào B và tế bào
T. Nhóm này có thành phần vào khoảng 8-12 axit amin. Sau khi đƣợc tổng hợp
các axit amin này phải đƣợc gắn vào giá đỡ, thƣờng là các hạt polyme có khả
năng hấp phụ cao và sử dụng chung với các loại chất bổ trợ tốt. Ƣu điểm của loại
vacxin này là an toàn, ổn định, dễ bảo quản và vận chuyển. Tuy nhiên việc sản
xuất vacxin này đòi hỏi kỹ thuật cao.
d.Vacxin DNA [17]
Khi đƣa DNA của một loại plasmid vectơ có chứa gen kháng nguyên vào cơ
thể thì thấy có hiện tƣợng gen kháng nguyên đó tổng hợp ra protein kháng nguyên


12
12



và kích thích cơ thể sinh miễn dịch chống lại protein do gen kháng nguyên kích
thích sinh ra. Dựa trên hiện tƣợng này, ngƣời ta tạo ra vacxin DNA bằng cách tái
tổ hợp gen kháng nguyên của một plasmid vectơ với một hệ thống promotor
mạnh. Loại kháng nguyên này sẽ kích hoạt tiết interleukin 12. Interleukin này sẽ
tác động vào những tế bào chết tự nhiên gây phân tiết interferon-g kích thích sự
phát triển của tế bào trợ giúp T. Vacxin này có ƣu thế lớn với phƣơng thức gây
miễn dịch đơn giản, bền với nhiệt độ do chỉ chứa DNA thuần khiết.Vacxin DNA
an toàn đối với những bệnh nhân bị suy giảm miễn dịch. Tuy nhiên việc đƣa một
DNA lạ vào cơ thể đôi khi gặp nguy hiểm do sự nhạy cảm của tế bào miễn dịch

đối với chính DNA đó.
e.Vacxin phối hợp với công nghệ chuyển gen thực vật[3]
Nhờ công nghệ gen ngƣời ta có thể chuyển nhiều gen quý giá vào hệ gen
thực vật tạo nên nhiều loại cây có khả năng sản xuất ra nhiều sản phẩm có giá trị
thông qua hệ thống plasmid Ti và Agrobacter tumefaciens. Dựa vào cách này
ngƣời ta đã chuyển một hay nhiều gen kháng nguyên của vacxin động vật và
ngƣời vào thực vật, thƣờng chú trọng vào những loại cây thực phẩm . Nhờ đó có
thể thu đƣợc vacxin thông qua thực vật.
Ƣu điểm của vacxin này là an toàn, dễ sử dụng. Tuy nhiên, việc tạo vacxin
này đòi hỏi kỹ thuật cao.

Bệnh phù ở heo xuất hiện ở heo sau cai sữa với các triệu chứng phù ở nhiều vị
trí nhƣ: mi mắt, sống mũi và trán, thành dạ dày, màng treo ruột và cuối cùng rối loạn
thần kinh. Bệnh này liên quan độc tố VT2e không bền nhiệt đƣợc tạo ra bởi một vài
chủng E. coli nhƣ: O138:K81; O139:K82; O141: K85 [11]. Độc tố này tác động lên
các tế bào ruột, đồng thời chúng cũng tác động lên nội mô thành mạch máu, hậu quả là
làm giảm sự hấp thu do các tế bào nhung mao ruột bị tổn thƣơng. Sự hƣ hại của các tế
bào nội mô mạch máu sẽ gây ra triệu chứng xuất huyết (Nguyễn Ngọc Hải, 1999).
Lƣợng độc tố cần thiết để có thể dẫn đến các triệu chứng và các thƣơng tổn thần kinh
đặc trƣng cho bệnh phù thì rất thấp. Liều LD
50
(Lethal Dose)của VT2e trên heo khi
tiêm tĩnh mạch là 3ng/kg thể trọng (MacLeod và cộng sự, 1991).


13
13

VT2e hay còn gọi là SLT-IIv là nhóm độc tố vero, đƣợc Konowalchuk và cộng
sự đặt tên đầu tiên năm 1977. Độc tố này chung họ với nhóm của Shigella và có đặc
trƣng gây độc trên môi trƣờng nuôi cấy tế bào vero (African green monkey kidney)
hơn là trên tế bào Hela, do đó còn đƣợc gọi là độc tố VT2e. Độc tố VT2e bị trung hòa
một phần bởi kháng thể của SLT-II và không bị trung hòa bởi kháng thể của SLT-I.
VT2e đƣợc cấu tạo từ hai thành phần: một đơn vị A nặng 32kDa và năm đơn vị B
(7.7kDa/ đơn vị). Tiểu phần A mã hóa cho enzyme RNA N-glycosidase. Enzyme này
sẽ phân cắt một liên kết N-glycosidic trên tiểu phần 28S của rRNA. Sự phân cắt này sẽ
làm sai hỏng yếu tố kéo dài EF1 (elongation factor 1) liên kết aminoacyl-tRNA với
tiểu phần 60S của RNA ribosome. Do đó ức chế sự tổng hợp protein và gây chết tế
bào. Những tiểu phần B chịu trách nhiệm cho khả năng kết dính những thụ thể bản
chất glycolipid có sẵn trên bề mặt của tế bào ruột cũng nhƣ trên các tế bào vero. Các
độc tố SLT-I và SLT-II chỉ liên kết với Gal 1-4Gal -4Glc 1-1Cer (globotriosyl
ceramid- Gb3), trong khi độc tố VT2e liên kết với cả Gb3 và GalNAc 1-3Gal 1-
4Gal 1-4Glc 1-Cer (globotetraosyl ceramid-Gb4), Gal 1-3GalNAc 1-3Gal 11-
4Gal 1-aGlc 1-1Cer (globopenosyl- Gb5) trên tế bào vero [13]. Các tế bào của lớp
nội mô ở heo nhạy cảm với độc tố VT2e. Và độc tố này gây ra những tổn thƣơng chủ
yếu trên lớp nội mô của mạch máu, làm biến đổi khả năng thấm của mạch máu và hậu
quả gây nên chứng phù .
Năm 1988, trình tự của một operon mã hóa cho độc tố VT2e đã đựơc báo cáo.
Trình tự axit amin của tiểu đơn vị A của VT2e dài hơn một axit amin và tƣơng đồng
94% so với SLT-II. Trong khi tiểu đơn vị B của VT2e ngắn hơn hai axit amin, và
tƣơng đồng 87% với SLT-II [7].
Việc phòng bệnh phù nhờ vacxin dựa vào độc tố VT2e cũng đã đƣợc nghiên
cứu. MacLeod và Gyles đã chứng minh đƣợc khả năng bảo vệ heo con bằng cách tiêm
tĩnh mạch độc tố VT2e bị vô hoạt bởi glutaraldehyde. Gordon và cộng sự đã phát hiện
độc tố VT2e sau khi xử lý với formaldehyde có thể tạo miễn dịch trên heo con [9]. Tuy
nhiên cách này có thể gây tồn dƣ độc tố in vivo. Ngƣời ta cũng có thể sử dụng một
kháng nguyên từ độc tố VT2e đã bị thay đổi một axit amin (Glu167-->Gln) trên vùng
hoạt động của tiểu đơn vị A. Việc miễn dịch này có thể bảo hộ cho heo con khỏi bệnh

phù bằng đƣờng miệng và không tạo các phản ứng phụ [7]. Tuy nhiên, cho đến nay


14
14



vẫn chƣa thấy loại vacxin dựa vào độc tố VT2e nào hiệu quả trong việc phòng chống
bệnh phù trên heo.
-VT2eB[6]
Protein MBP-VT2eB là protein tái tổ hợp đƣợc tổng hợp từ gen MPB-VT2eB có
trọng lƣợng phân tử 47kDa. Gen này đƣợc mang bởi vectơ pMal-c2X chứa trong
chủng E. coli DH5 do TS. Nguyễn Ngọc Hải tạo ra tại Pháp.
Gen MPB-VT2eB đƣợc cấu thành từ gen mục tiêu VT2eB và gen MBP có sẵn
trong vectơ pMal-c2X. Trong đó gen VT2eB mã hóa cho tiểu phần B của độc tố
VT2eB. Tiểu phần B qui định khả năng kết dính của độc tố đối với các thụ thể có bản
chất glycolipid trên tế bào đích. Do đó protein tiểu phần B không có khả năng gây
bệnh và mang đặc tính kháng nguyên cho độc tố này. Việc gắn kết gen mục tiêu với
gen MBP sẽ tạo nên hệ thống protein dung hợp với MBP (maltose binding protein). Hệ
thống này sẽ biểu hiện khi gen đƣợc cảm ứng IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) và
tổng hợp protein dung hợp mang protein MPB ở đầu amin và protein mục tiêu ở đầu
carboxyl. Protein sinh ra sẽ tích lũy trong vùng chu chất (periplasm) nằm giới hạn giữa
màng trong và màng ngoài của vi khuẩn. MPB có trung tâm cơ chất có ái lực cao đối
với maltose và amylose, do đó có thể tinh sạch đƣợc protein tái tổ hợp ở dạng dung
hợp với MPB thông qua sắc ký ái lực. Ngoài ra, trên protein tái tổ hợp còn mang vị trí
nhận biết đặc hiệu của một protease, do đó có thể phân cắt protein mục tiêu dễ dàng.
Hệ thống gen chung VT2eB-MPB đƣợc mang bởi vectơ plasmid pMal-C2X. Gen mục
tiêu VT2eB sẽ đƣợc tái tổ hợp với gen malE nhờ các vị trí cắt của enzyme cắt giới hạn
trên các polylinker. Gen malE qui định cho việc tổng hợp protein MBP và hoạt động

dƣới sự kiểm soát của gen khởi động ptac. Gen này đƣợc hoạt hóa bởi IPTG. Do đó
khi có mặt IPTG, gen ptac sẽ kích ứng sự tổng hợp protein tái tổ hợp MBP-VT2eB.
Protein này sẽ đƣợc tinh sạch bằng cách cho qua các cột sắc ký mang hạt
amylose. Protein mục tiêu có ái lực với amylose sẽ đƣợc giữ lại. Sau đó, tiếp tục cho
dung dịch đệm maltose chạy qua cột sắc ký sẽ thu đƣợc protein này.
2.4 ERLONY
Phƣơng pháp Ouchterlony hay còn gọi là phƣơng pháp khuyếch tán trên thạch
đƣợc Orjan Ouchterlony phát hiện năm 1948.

Phƣơng pháp này dựa trên hai nguyên tắc:


15
15



Cấu trúc phân tử của agar
Cấu trúc phân tử đặc trƣng của agar hay agarose cho phép các phân tử có
trọng lƣợng phân tử nhỏ hơn 200 kDa khuyếch tán dễ dàng qua các khoảng
trống giữa chúng. Nhờ vậy mà các phân tử kháng nguyên hay kháng thể có thể
khuyếch tán qua gel tùy theo nồng độ ban đầu và bán kính Stoke, trong khi đó
những phân tử ở dạng kết hợp có kích thƣớc lớn sẽ không thể di chuyển.
Liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên- kháng thể
Kháng nguyên liên kết với epitop kháng thể thông qua vị trí paratop theo
nguyên tắc bổ sung không gian tƣơng tự liên kết giữa “ổ khóa- chìa khóa”. Sự
liên kết đƣợc thiết lập và duy trì là nhờ các lực hấp dẫn có năng lƣợng nhỏ nhƣ:
 Lực tĩnh điện giữa các nhóm COO
-
và NH

3
+
đối diện nhau của axid amin
trong các chuỗi polypeptit.
 Các liên kết hydro giữa các nguyên tử H
+
và N
-
hoặc O
-
.
 Các liên kết kị nƣớc giữa các axit amin kị nƣớc.
 Lực Van der Waals do sự di động của các điện tử giữa hai phân tử.
Sự liên kết giữa các kháng nguyên- kháng thể là một phản ứng phát nhiệt,
giải phóng ra năng lƣợng từ khoảng 2- 40Kcal/mol. Sự liên kết giữa kháng
nguyên- kháng thể là một phản ứng cân bằng, có thể đƣợc biểu diễn nhƣ sau:
KN + KT KN-KT + nhiệt lƣợng
Hằng số kết hợp K= [KN-KT]/[KN][KT] (K: biểu hiện cho sự nghịch đảo
của nồng độ l/mol).
Sự phù hợp của một kháng thể đối với kháng nguyên đặc hiệu tạo điều kiện
xuất hiện nhanh chóng một phản ứng kết tủa hay ngƣng kết. Phản ứng giữa
kháng nguyên kháng thể là phản ứng đặc hiệu: một vị trí paratop của kháng thể
chỉ kết hợp với một epitop của kháng nguyên. Tuy nhiên tính chất này chỉ
tƣơng đối chứ không tuyệt đối có thể bị phân li do các yếu tố nhƣ nhiệt độ, môi
trƣờng axit, môi trƣờng ion cao. Do đó phản ứng này phụ thuộc vào hằng số kết
hợp, hóa trị của kháng thể và số lƣợng của epitop, nhiệt độ pH và lực ion của
môi trƣờng phản ứng.

16
16















-  

Các thử nghiệm này đƣợc thực hiện bằng cách cho kháng nguyên hay kháng thể
vào các giếng nhỏ đƣợc cắt trên agar hay agarose. Dung dịch kháng nguyên hay kháng
thể chuẩn đƣợc cho vào các giếng trung tâm, kháng thể hay kháng nguyên cần tìm sẽ
đƣợc cho vào các giếng xung quanh. Chúng sẽ khuyếch tán trong thạch. Nếu chúng
gặp nhau ở cùng một tỉ lệ tƣơng đƣơng thì sẽ tạo nên một vạch có thể quan sát bằng
mắt thƣờng.
TOXIN TRN 

Dòng tế bào biểu mô vero nhạy cảm với độc tố SLT đƣợc Y. Yasumura và Y.

Kawakita phát hiện đầu tiên vào năm 1962 ở trƣờng đại học Chipa (Nhật Bản). Tế
bào này thu đƣợc từ mô tế bào thận khỉ Châu Phi trƣởng thành (African green
monkey) (Cercopithecus) [13]. Dòng tế bào này có nhiều Gb3 và Gb4 trên màng tế
bào chất do đó nên chúng đƣợc dùng để phát hiện các VT2e. Ngƣời ta có thể phát
hiện sự hiện diện của SLT trong mẫu thông qua việc ủ dịch này trên môi trƣờng nuôi
cấy tế bào vero đơn lớp mỏng. Thông thƣờng các thử nghiệm đƣợc tiến hành trên
những đĩa polystyren 96 giếng. Việc phát hiện sự hiện diện của độc tố này dựa trên
sự phân tách tế bào vero sau khi ủ 48-72 giờ.

Liên kết kháng nguyên- kháng thể
(