Luận văn : NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI PROTEIN TÁI TỔ HỢP MBP-VT2eB TRÊN THỎ part 1 potx

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
****0O0****








KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP




N
N
G
G
H
H
I
I
Ê
Ê
N
N

C
C
Ứ
Ứ
U
U


Đ
Đ
Á
Á
P
P


Ứ
Ứ
N
N
G
G


M
M
I
I
Ễ
Ễ

N
N


D
D
Ị
Ị
C
C
H
H


Đ
Đ
Ố
Ố
I
I


V
V
Ớ
Ớ
I
I

P
P
R
R
O
O
T
T
E
E
I
I
N
N


T
T
Á
Á
I
I


T
T
Ổ
Ổ

H
H
Ợ
Ợ
P
P


M
M
B
B
P
P
-
-
V
V
T
T
2
2
e
e
B
B


T
T

R
R
Ê
Ê
N
N


T
T
H
H
Ỏ
Ỏ








Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Niên khóa : 2001 – 2005
Sinh viên thực hiện : PHAN LÊ MAI

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8-2005

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
****0O0****







KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP



N
N
G
G
H
H

I
I
Ê
Ê
N
N


C
C
Ứ
Ứ
U
U


Đ
Đ
Á
Á
P
P


Ứ
Ứ
N
N
G
G

M
M
I
I
Ễ
Ễ
N
N


D
D
Ị
Ị
C
C
H
H


Đ
Đ
Ố
Ố
I
I

V
V
Ớ
Ớ
I
I


P
P
R
R
O
O
T
T
E
E
I
I
N
N


T
T
Á
Á
I
I

T
T
Ổ
Ổ


H
H
Ợ
Ợ
P
P


M
M
B
B
P
P
-
-
V
V
T
T
2
2

e
e
B
B


T
T
R
R
Ê
Ê
N
N


T
T
H
H
Ỏ
Ỏ

Giáo Viên Hướng Dẫn: Sinh Viên Thực Hiện:
TSKH NGUYỂN NGỌC HẢI PHAN LÊ MAI
PGS.TSKH NGUYỄN LÊ TRANG











Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8-2005

iii
LỜI CẢM ƠN

Con luôn nhớ ơn ba mẹ sinh thành, dưỡng dục và tạo mọi điều kiện cho con tự
hoàn thiện mình, cảm ơn sự quan tâm, động vịên của mọi người trong gia đình.
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ
Chí Minh, Ban Chủ nhiệm bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý Thầy Cô đã
truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tại trường.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS khoa học Nguyễn Ngọc Hải, người
Thầy đã dạy bảo em rất nhiều và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khoá
luận.
Con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS-TS khoa học Nguyễn Lê Trang,
người Thầy, người bác đã dạy bảo con rất nhiều và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp

con hoàn thành khoá luận.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thạc sỹ Nguyễn Kim Dung, người Thầy
đã dạy bảo em rất nhiều và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khoá luận.
Em xin chân thành cảm ơn chị Nguyễn Thị Nguyệt Thu, chị Đỗ Thị Châm, chị
Lạc Ngọc Thêm, chị Võ Thị Mỹ Duyên, chị Dương Ngọc Diễm, chị Doãn Thị Sim,
Thầy Lưu Đức Lợi, anh Nguyễn Văn Thương đã tận tình giúp đỡ chỉ bảo em trong
suốt thời gian thực tập khoá luận tốt nghiệp.
Cảm ơn các bạn bè thân yêu của lớp DH01SH đã san sẻ cùng tôi những vui
buồn trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập.











iv
TÓM TẮT
PHAN LÊ MAI, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005.
“NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI PROTEIN TÁI TỔ HỢP MBP-
VT2eB TRÊN THỎ”.
Hội đồng hướng dẫn:
TS khoa học Nguyễn Ngọc Hải
PGS-TS khoa học Nguyễn Lê Trang
Độc tố verotoxin VT2eB do E. coli tiết ra là tác nhân chính gây ra bệnh phù đầu
và tiêu chảy trên heo con, gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi heo của nước ta.

Do vậy các nghiên cứu nhằm tạo ra vaccin phòng bệnh phù đầu trên heo đang nhận
được sự quan tâm rất lớn, mở ra nhiều triển vọng cho ngành chăn nuôi heo nước ta.
Hiện nay, TS Nguyễn Ngọc Hải và các cộng sự đã thành công trong việc tạo ra được
chủng E. coli mang gen mã hoá cho protein tái tổ hợp MBP-VT2eB và tinh sạch được
protein này. Từ thực tế đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đáp ứng miễn
dịch đối với protein tái tổ hợp MBP-VT2eB trên thỏ” nhằm xác định khả năng ứng
dụng protein này trong nghiên cứu bệnh phù đầu do E. coli gây ra trên heo .
Chúng tôi sử dụng phản ứng kết tủa khuếch tán trên thạch (kỹ thuật
Ouchterlony) để đánh giá sự xuất hiện của kháng thể và phản ứng trung hoà độc tố
VT2e trên môi trường tế bào vero để đánh giá hiệu giá kháng thể trung hoà độc tố
verotoxin.
Những kết quả đạt được sau 7 tháng nghiên cứu:
- Cả hai quy trình gây miễn dịch dài ngày và ngắn ngày đều tạo kháng thể
kháng MBP-VT2eB có hiệu quả.
- Protein MBP-VT2eB có khả năng kích ứng đáp ứng miễn dịch trên thỏ
tạo kháng thể trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero.
- Kháng thể kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB có khả năng trung hoà
độc tố VT2e (gây bệnh phù đầu trên heo).



v
MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN iii
TÓM TẮT iv
MỤC LỤC v
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii
DANH MỤC CÁC HÌNH xi
DANH MỤC CÁC BẢNG xii

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ xiii
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ xiv
PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1
1.1. Mở đầu 1
1.2. Mục tiêu và yêu cầu 1
1.2.1. Mục tiêu 1
1.2.2. Yêu cầu 2
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. Kháng nguyên 3
2.2. Kháng thể 3
2.2.1. Chuỗi nhẹ (L) 4
2.2.2. Chuỗi nặng (H) 4
2.3. Đáp ứng miễn dịch 5
2.3.1. Đáp ứng miễn dịch khi tiếp xúc kháng nguyên lần đầu 6
2.3.2. Đáp ứng miễn dịch khi tiếp xúc lại kháng nguyên những lần tiếp theo 6
2.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch 7
2.4. Cơ chế miễn dịch dịch thể 10
2.5. Protein tái tổ hợp MBP-VT2eB 15
2.6. Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch (Double diffusion in two
dimensions) (Kỹ thuật Ouchterlony) 15
2.6.1. Sự kết hợp giữa kháng nguyên – kháng thể 15
2.6.2. Phản ứng kết tủa theo kỹ thuật khuếch tán kép trên thạch (Double
diffusion in two dimensions) (Kỹ thuật Ouchterlony) 17

vi
2.7. Phản ứng trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero 18
2.7.1. Sơ lược về tế bào vero 18
2.7.2. Độc tố VT2e 19
2.7.3. Nguyên tắc của phản ứng trung hoà độc tố
trên môi trường tế bào vero 20

PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 21
3.1. Thời gian và địa điểm 21
3.2. Nội dung nghiên cứu 21
3.3. Vật liệu và hoá chất 21
3.3.1. Thú thí nghiệm 21
3.3.2. Vật liệu và hoá chất 21
3.3.3. Môi trường 22
3.3.4. Thiết bị và dụng cụ 22
3.4. Phương pháp nghiên cứu 22
3.4.1. Bố trí thí nghiệm 22
3.4.2. Chuẩn bị dịch tiêm 24
3.4.3. Thu nhận kháng huyết thanh 24
3.4.4. Xử lý kháng huyết thanh 24
3.4.4.1. Tách kháng thể với ammonium sulfate bão hoà 100%S 24
3.4.4.2. Hòa tan kháng thể 25
3.5. Đánh giá 27
3.5.1. Định tính: phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch (kỹ thuật
Ouchterlony) 27
3.5.2. Định lượng: phản ứng trung hoà độc tố VT2e trên môi trường
tế bào vero 28
3.5.2.1. Xác định liều TCID
50
(Tissue Culture Infectious Dose 50) 28
3.5.2.2. Thử phản ứng trung hoà độc tố 31

vii
3.6. Chỉ tiêu theo dõi 33
3.7. Đánh giá kết quả và xử lý số liệu 33
PHẦN 4 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34
4.1. Xác định kháng thể đặc hiệu với protein tái tổ hợp MBP-VT2eB bằng kỹ

thuật Ouchterlony 34
4.1.1. Xác định quy trình thực hiện phản ứng 34
4.1.2. Đánh giá kết quả gây miễn dịch theo các quy trình
ngắn ngày và dài ngày 35
4.1.2.1. Quy trình ngắn ngày 35
4.1.2.2. Quy trình dài ngày 36
4.1.3. Nhận xét 38
4.2. Xác định liều TCID
50
41
4.3. Phản ứng trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero 42
4.3.1. Kiểm tra độ an toàn của kháng huyết thanh đối với tế bào vero 42
4.3.1.1. Kháng huyết thanh có bổ sung NaN
3
và tế bào vero 43
4.3.1.2. Kháng huyết thanh có bổ sung NaN
3
và có bất hoạt 43
4.3.1.3. Thí nghiệm đánh giá tác động của NaN
3
44
4.3.1.4. Kháng huyết thanh không bổ sung NaN
3
và có bất hoạt 44
4.3.2. Phản ứng trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero 46
4.3.2.1. Quy trình dài ngày 47
4.3.2.2. Quy trình ngắn ngày 50
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 53
PHẦN 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO 54
PHỤ LỤC 56

viii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ag
ATCC

DAG
DMEM

TCID
50


EDTA

FBS
Gb4
Ig
IL2
IL4
IL5
IL6
IP
3

LB

MAF

MBP
MHC class II antigens

MIF

MWCBs

PCR
Antigen
American Type Culture
Collection
Diacylglycerol
Dulbeccos Minimal
Essential Medium
Tissue culture infectious
dose 50
Ethyllene diamine tetra
acetic acid
Fetal Bovine Serum
Globotetraosyl ceramide
Immunoglobulin
Interleukin 2
Interleukin 4
Interleukin 5
Interleukin 6
Inositol triphosphate
Lubria – Bertani
Macrophage activating

factor
Maltose binding protein
Major histocompatibility
complex class II antigens
Macrophage inhibitation
factor
Manufacturer's working
cells bank
Polymerase chain reaction
Kháng nguyên
Tổ chức sưu tầm nhân
giống Mỹ







Huyết thanh bào thai bê

Globulin miễn dịch






Yếu tố có tác dụng hoạt
hoá đại thực bào

Các kháng nguyên phù hợp
tổ chức chính lớp II


Ngân hàng tế bào đang làm
việc


ix
PBS
SLT
T
C

T
DTH


T
I

T
H

Vero
VT
VT2e (SLT-IIv)
VT2eB

Phosphate buffer stalin
Shiga-like toxin
Cytotoxic T cell
Delayed type
hypersensitivity T cell
Inducer T cell
Helper T cell
Vervet Monkey Origin
Verotoxin
SLT-II variant
VT2e subunit B



Tế bào lympho T gây độc
Tế bào lympho T gây quá
mẫn muộn
Tế bào lympho T cảm ứng
Tế bào lympho T giúp


Độc tố Shiga-like toxin IIv
Tiểu đơn vị B của VT2e

x
DANH MỤC CÁC HÌNH

TRANG
Hình 2.1:
Hình 2.2:

Hình 2.3:
Hình 2.4:

Hình 2.5:
Hình 2.6:

Hình 2.7:

Hình 2.8:

Hình 3.1:
Hình 3.2:
Hình 4.1:

Hình 4.2:

Hình 4.3:

Hình 4.4:

Hình 4.5:


Hình 4.6:
Cấu trúc kháng thể 5
Đáp ứng miễn dịch của thú đối với 2 lần tiêm kháng nguyên được
phản ảnh qua mức độ kháng thể trong kháng huyết thanh 7
Quá trình biệt hoá và phân chia của tế bào lympho B 11
Các quá trình diễn ra khi kháng nguyên kết hợp với các thụ thể trên bề
mặt tế bào lympho B 12
Sự kết hợp giữa tế bào lympho T
H
và tế bào lympho B 13
Tế bào lympho B xử lý và trình diện kháng nguyên cho tế bào lympho
T
H
13
Tác động của các interleukin ở các giai đoạn khác nhau trong tiến trình

đáp ứng miễn dịch của tế bào lympho B đối với kháng nguyên 14
Hiện tượng hai kháng nguyên: đồng nhất (A), không đồng nhất (B),
đồng nhất một phần (C) được phát hiện bằng phản ứng kết tủa khuếch
tán kép trên thạch 18
Bao thẩm tích 26
Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch (kỹ thuật Ouchterlony) 27
Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 4 (mũi nhắc
lại 1) 34
Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 2 (mũi nhắc
lại 1) 35
Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 1 (mũi nhắc
lại 2) 36
Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 1 (đối chứng
+ kháng huyết thanh) 36
Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 2 (đối chứng
+ kháng huyết thanh) 36

Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 4 (mũi nhắc