Luận văn : XÁC ĐỊNH MÔI TRƯỜNG TỐI ƯU ĐỂ THU SINH KHỐI VÀ ENZYME CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS, LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS. THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC part 7 ppsx

48
Bảng 4.11. Số lượng vi khuẩn L. acidophilus sau thời gian bảo quản
Thời gian 0 ngày 10 ngày 20 ngày
Số lượng (×10
6
cfu/g) 38 4,15 2,83

Qua bảng 4.11 chúng tôi nhận thấy số lượng tế bào vi khuẩn giảm nhiều nhất vào 10
ngày đầu sau đó giảm dần sau thời gian bảo quản.
38
4.15
2.83
0
5
10
15
20
25
30
35
40
01020
Số lượng × 10
6
cfu/g
Số lượn
g
Thời gian (ngày)

Biểu đồ 4.2. Số lượng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus sau thời gian bảo quản

Hình 4.9. Chế phẩm chứa B. subtilis và L. acidophilus sau khi đóng gói

49
Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. KẾT LUẬN
5.1.1. Đối với Bacillus subtilis
Trong số 5 loại môi trường nhân giống cấp 1 là Edward, Nomura, Fragie, Rỉ đường
có bổ sung 2% tinh bột và pepton-gelatin, chúng tôi ghi nhận môi trường rỉ đường có
bổ sung 2% tinh bột là môi trường có khả năng cho sinh khối và hoạt độ enzyme
amylase và protease cao nhất với số lượng tế bào là 19,2 × 10
9
cfu/ml, hoạt độ amylase
là 256 (W
o
/ml) và protease là 128 (Hđp/ml).
Môi trường A là môi trường nhân giống cấp 2 có khả năng cho sinh khối và hoạt
độ enzyme amylase, protease cao nhất với số lượng tế bào là 345,67×10

10
cfu/g, hoạt
độ amylase là 160 (W
o
/ml) và protease là 80 (Hđp/ml).
Sau khi sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis có số lượng tế bào là 589 × 10
9

cfu/g, hoạt độ amylase là 160 (W
o
/ml) và protease là 80 (Hđp/ml).
Sau thời gian bảo quản 10, 20 và 30 ngày ở nhiệt độ phòng chúng tôi nhận thấy số
lượng tế bào có giảm nhưng hoạt độ enzyme amylase và protease không thay đổi.
5.1.2. Đối với Lactobacillus acidophilus
Trên môi trường sữa đặc có đường, độ chua và số lượng của tế bào tăng dần khi
nồng độ sữa tăng dần. Số lượng vi khuẩn và độ chua cao nhất ở nồng độ 25% sữa và
cho số lượng tế bào là 21,96 × 10
9
cfu/ml và độ chua là 1,1093g/100 ml.
Đối với môi trường sữa đậu nành số lượng và độ chua cao nhất ở môi trường NB
15
.
Số lượng tế bào là 73,1 × 10
9
cfu/ml và độ chua là 1,6g/100 ml.
Chế phẩm chứa Lactobacillus acidophilus sau khi sản xuất có số lượng tế bào là 38 × 10
6

cfu/g. Sau thời gian bảo quản số lượng tế bào giảm nhanh vào 10 ngày đầu sau đó giảm dần
sau thời gian bảo quản.

5.2. ĐỀ NGHỊ
9 Cần khảo sát thêm khi nuôi cấy B. subtilis ở nhiệt độ 37
o
C và vào từng thời điểm
khác nhau như 24 và 36 giờ để xác định chính xác điều kiện tối ưu nhất để sản xuất
chế phẩm.
9 Chiết xuất ra enzyme tinh khiết phục vụ trong chăn nuôi và các ngành công nghiệp khác.
9 Khảo sát thêm khả năng sinh enzyme lipase của vi khuẩn Bacillus subtilis.

50
9 Cần phân lập thêm nhiều chủng Lactobacillus acidophilus từ nhiều nguồn khác
nhau như sữa chua, nem… để tìm ra chủng tốt nhất phục vụ cho sản xuất.
9 Sản xuất trên dây chuyền khép kín với số lượng lớn để hạ giá thành sản xuất
5.3. TỒN TẠI
9 Chưa kiểm tra được khả năng ức chế của chế phẩm đối với các vi khuẩn gây bệnh
như E. coli, Salmonella…
9 Chưa kiểm tra được độ an toàn cũng như tác dụng của chế phẩm trên thú và thủy sản.











51
Phần 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng việt
1. Vũ Ngọc Bội, 2004. Nghiên cứu quá trình thủy phân protein cá bằng enzyme
protease từ Bacillus subtilis S5. Luận án tiến sĩ sinh học, Đại học Khoa Học Tự
Nhiên TPHCM.
2. Đinh Văn Cải, Phạm Hồ Hải, Võ Thị Hạnh, 2004. Nghiên cứu sản xuất và sử
dụng các chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ các loại men vi sinh bổ sung vào
khẩu phần ăn của bò vắt sữa và bê sau cai sữa. Báo cáo khoa học chăn nuôi thú
y. Phần dinh dưỡng và vật nuôi.
3. Tô Minh Châu, 2000. Giáo trình thực tập vi sinh vật học.
4. Trần Thị Dân, 2000. Bài giảng sinh lý học gia súc. Đại học Nông Lâm Tp HCM.
5. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Lê Đình Lương,
Đoàn Xuân Mượu, Phạm Văn Ty, 1978. Một số phương pháp nghiên cứu vi
sinh vật học tập III, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.
6. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, 2000. Vi sinh vật học,
Nhà xuất bản Giáo Dục.
7. Nguyễn Văn Đông, 1993. Khảo sát một số tính chất của vi khuẩn Bacillus
subtilic dùng sản xuất chế phẩm Biosubtyl phòng và trị bệnh tiêu chảy heo con.
Luận văn tốt nghiệp Kỹ sư Chăn Nuôi, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
8. Nguyễn Hữu Đức. Tạp chí thuốc và sức khỏe số 202 ngày 15/12/2001
9. Đậu Ngọc Hào, Phạm Minh Hằng, Nguyễn Chi Quế, 2001. Nghiên cứu một số
đặc tính trợ sinh học (probiotic) của Bacillus subtilis trong phòng bệnh đường
tiêu hóa gà. Tạp chí Khoa Học Kỹ Thuật Thú Y, tập III, số 3-2001.
10. Nguyễn Thị Hiền, Nguyễn Đức Lượng, 2004. Công nghệ sản xuất mì chính và
các sản phẩm lên men cổ truyền. Nhà xuất bản Khoa Học Kỹ Thuật.
11. Lã Văn Kính,1998. Những tiến bộ khoa học kỹ thuật trong công nghệ sản xuất
thức ăn gia súc và vai trò của probiotic đối với động vật. Viện Khoa học Nông
Nghiệp và Kỹ Thuật Miền Nam.
12. Nguyễn Thị Lam Kiều, 2004. Khảo sát đặc điểm sinh học của hai chủng
Lactobacillus trong men tiêu hóa. Khóa luận cử nhân khoa học ngành sinh học,
truờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên TPHCM.

52
13. Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết, 2003. Thí nghiệm
Công nghệ sinh học tập 2. NXB đại học Quốc Gia TPHCM.
14. Nguyễn Đức Lượng và cộng tác viên, 2004. Công nghệ enzyme. Nhà xuất bản
đại học Quốc Gia TPHCM.
15. Nguyễn Đức Lượng, 2002. Công nghệ vi sinh tập 2. NXB Đại học Quốc Gia TPHCM.
16. Lê Minh Cẩm Ngọc, 2005. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ chế phẩm
probiotic, tìm hiểu môi trường nuôi cấy thích hợp và sản xuất thử nghiệm. Luận
văn tốt nghiệp chuyên ngành chăn nuôi, trường đại học Nông Lâm TPHCM.
17. Lương Đức Phẩm, 2000. Vi sinh vật học và an toàn vệ sinh thực phẩm. Nhà
xuất bản Nông nghiệp Hà Nội.
18. Lương Đức Phẩm, 1998. Công nghệ vi sinh vật. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Hà
Nội.
19. Lê Xuân Phương, 2001. Vi sinh vật công nghiệp. NXB Xây Dựng Hà Nội
20. Phạm Hào Quang, 2004. Kiểm tra tác dụng của các sản phẩm probiotic và
kháng thể E. coli trong việc phòng trị bệnh tiêu chảy trên heo con theo mẹ.
Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Thú Y, trường đại học Nông Lâm TPHCM.
21. Nguyễn Quyết, 2004. Nghiên cứu đặc tính và ứng dụng của α – amylase dạng
hòa tan và dạng cố định thu nhận từ vi khuẩn Bacillus subtilis. Luận văn thạc sĩ
khoa học chuyên ngành sinh hóa, đại học Khoa Học Tự Nhiên TPHCM.
22. Tăng Thị Rít, Nguyễn Thị Bích Thúy, Quan Quốc Đăng và Nguyễn Kim Trinh,
2004. Tổng hợp chế phẩm sinh học SH bổ sung vào thức ăn tôm sú Penaeus
monodon nhằm kích thích tăng trưởng và tăng sức đề kháng bệnh đốm trắng.
Tóm tắt báo cáo hội nghị khoa học tháng 10 - 2004, đại học Khoa Học Tự
Nhiên TPHCM.
23. Trần Minh Tâm, 2000. Công nghệ vi sinh ứng dụng. NXB Nông Nghiệp
24. Nguyễn Hoàng Thảo, 2003. Khảo sát một số đặc tính về phân loại của vi
khuẩn lactic từ đậu nành và sữa chua. Khóa luận cử nhân khoa học ngành sinh
học, đại học Khoa Học Tự Nhiên TPHCM.

25. Lê Thị Hồng Tuyết, 2004. Nghiên cứu bacteriocin sản xuất bởi Lactobacillus
acidophilus NRRL B – 2092. Luận văn thạc sĩ sinh học, đại học Khoa Học Tự
Nhiên TPHCM.
26. Bộ Y tế, Vụ Khoa Học và Đào tạo, 2001. Vi sinh vật y học. NXB Y Học Hà Nội

53
Tiếng nước ngoài
27. Alexopoulos. C, Georgoulakis.I.E, Tzivara.A, Kritas.S.K, 2004. Field
evaluation of the efficacy of a probiotic containing Bacillus subtilis spores and
Bacillus licheniformis,on the health status and performance of sows and their
litters. Proceedings of the 18
th
international pig veterinary society congress.
Volume 2, June 27 – July 1, 2004 Hamburg, Germany (p. 865, 721).
28. Breed. Robert s, 1948. Bergey’s manual of determin ative bacteriology (p.352, 709).
29. Brovk. Thomas D , 1970. Biology of microorganism (p. 538)
30. Sirirat Rengpipat, Sombat Rukpratanporn, Somkiat Piyatirativivorakul, Piamsak
Menasveta, 1998. Probiotics in aquaculture: A case study of probiotics for Larvae
of the Black Tiger Shrimp (penaeus monodon) (p.177-179).
31. Star. Mortimer P , 1964. Global impacts of applied microbiology (p. 287, 288).
Internet
/> />

PHỤ LỤC
1. THÀNH PHẦN MỘT SỐ LOẠI MÔI TRƯỜNG
1.1. Môi trường nutrien agar (NA)
Beef extract 3 g
Pepton 5 g
Agar 15 g
Nước cất 1000 ml

Điều chỉnh pH tới 7. Tiệt khuẩn 15 - 20 phút ở 121
o
C
1.2. Môi trường Frage
Pepton 5 g
Gelatin 4 g
NaCl 3 g
K
2
HPO
4
1,5 g
KH
2
PO
4
0,5 g
Glucose 0,05 g
H
2
O 1000 ml
Điều chỉnh pH tới 7. Tiệt khuẩn 15 - 20 phút ở 121
o
C
1.3. Môi trường rỉ đường + 2% tinh bột
Rỉ đường 120 g
KH
2
PO
4

1g
Tinh bột 20 g
Nước sạch 1000 ml
Điều chỉnh pH 6,5 - 7. Tiệt khuẩn 15-20 phút ở 121
o
C
1.4. Môi trường nước thịt pepton - gelatin
Nước thịt pepton 1000 ml
Gelatin 150 g
Điều chỉnh pH 7 - 7,2. Tiệt khuẩn 15 - 20 phút ở 121
o
C
1.5. Môi trường Nomura
Nước chiết cám 20%
Nước chiết đậu nành 5%
Tinh bột 2%

(NH
4
)
2
HPO
4
0,067 M
KCl 0,2 M
MgSO
4
.7H
2
O 0,002 M

CaCl
2
0,001 M
Điều chỉnh pH 7,2. Tiệt khuẩn 15 - 20 phút ở 121
o
C
1.6. Môi trường tăng sinh chọn lọc MRSB (De man, Rogosa, Sharpe)
Cao thịt 8 g
Pepton bột 10 g
Cao nấm men 4 g
Acetat natri 5 g
Triamonium citrat 2 g
Glucose 5 g
MgSO
4
0,2 g
MnSO
4
0,2 g
Tween 80 1 ml
Bromocresol 1 ml
Nước cất 1000 ml
Điều chỉnh pH = 6 - 6,4. Đun nhẹ để hòa tan các thành phần môi trường. Sau đó
phân vào mỗi ống nghiệm khoảng 10 ml.Hấp khử trùng bằng autoclave ở 121
o
C/ 20 phút
1.7. Môi trường tăng sinh chọn lọc MRSA (De Man, Rogosa, Sharpe)
Môi trường MRSB 1000 ml
CaCO
3

2 g
Agar 16 g
pH = 6 – 6,4
Đun sôi để hòa tan các thành phần môi trường. Hấp khử trùng bằng autoclave
121
o
C/ 20 phút.
1.8. Môi trường thạch bán lỏng di động
Môi trường NB tổng hợp 13 g
Agar 5 g
Nước cất 1000 ml
pH = 7,2

Hòa tan các thành phần môi trường trong nước cất. Đun cách thủy cho agar tan
hết, sau đó phân vào mỗi ống nghiệm khoảng 5 ml.
Hấp khử trùng bằng autoclave ở 121
o
C/ 20 phút. Đặt thẳng ống nghiệm cho thạch đông
1.9. Môi trường Clark lubs
Pepton bột 7 g
Glucose 5 g
KH
2
PO
4
5 g
Nước cất 1000 ml
pH = 6,8 – 7,2
Hấp khử trùng bằng autoclave ở 121
o

C/20 phút.
1.10. Môi trường Simmon citrat
Sodium citrat 2 g
NaCl 5 g
KH
2
PO
4
1 g
NH
4
H
2
PO
4
5 g
MgSO
4
1 g
Bromothymlo blue 0,2 g
Agar 0,08 g
Nước cất 1000 ml
pH = 6,6 – 7
Đun nhẹ để hòa tan các chất, thỉnh thoảng khuấy đều. Sau đó phân vào khoảng
1/3 ống nghiệm. Hấp khử trùng bằng autoclave ở 121
o
C/20 phút.
1.11. Thành phần môi trường nhân giống cấp 2
A B C D E
Đậu nành 30%

Bột gạo 20%
Bột sữa Whey 10%
Bột bắp 40%

Đậu nành 20%
Bột bắp 40%
Bột gạo 30%
Bột sữa Whey 10%
Đậu nành 20%
Bột bắp 40%
Bột mì 30%
Bột sữa Whey 10%
Đậu nành 20%
Bột bắp 30%
Bột mì 30%
Bột gạo 20%
Bột nếp 20%
Bột bắp 30%
Bột mì 30%
Bột gạo 20%

Tất cả các môi trường A, B, C, D, E trước khi đem nhân giống đều được hấp khử trùng
ở 121
o
C trong 20 - 25 phút.



2. THÀNH PHẦN CÁC THUỐC THỬ
2.1. Dung dịch tinh bột 0,1%

Tinh bột 0,1g
Nước cất thêm đến 100 ml
Trộn tinh bột với khoảng 10 ml nước cất, thêm tiếp 80 ml nước cất đang sôi,
khuấy đều, để nguội, thêm nước cất đến 100 ml. Đối với dung dịch tinh bột tiêu chuẩn
1% thì sử dụng 1 g tinh bột.
Nếu sử dụng dung dịch tinh bột 1% trong đệm phosphate 0,05M, pH = 6, sử dụng
lượng tinh bột là 1g và thay nước cất bằng dung dịch đệm phosphate 0,05M, pH = 6.
Để bảo quản có thể thêm 1g natri benzoexan.
2.2. Dung dịch iod 0,02%
KI 2 g
Iodine 0,25 g
Nước cất thêm đến 100 ml
Hòa tan 2 g KI trong 3ml nước cất thêm 0,25g iodine, lắc đều cho tan, thêm nước
cất đến 100 ml.
2.3. Dung dịch casein 0,1%
Cách 1
Casein 0,1g
Dung dịch natri carbonate 100 ml
Hòa tan casein trong dung dịch natri carbonate đun nhẹ và khuấy cho đến khi hòa tan
Cách 2
Casein 0,1 g
NaOH 0,1N 5 ml
Nước cất 25 ml
Đun cách thủy cho đến khi tan hoàn toàn. Làm lạnh dùng HCl 0,1N chỉnh pH = 8.
Thêm nước cất đủ 100 ml.
2.4. Dung dịch acid acetic 1% trong ethanol
Acid acetic đặc 1 ml
Nước cất 49 ml
Ethanol 96% 50 ml
Hòa tan acid acetic đặc trong nước cất và ethanol