Luận văn : XÁC ĐỊNH MÔI TRƯỜNG TỐI ƯU ĐỂ THU SINH KHỐI VÀ ENZYME CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS, LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS. THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC part 2 ppt

xi
DANH SÁCH CÁC BẢNG

BẢNG TRANG
Bảng 4.1. Số lượng tế bào B. subtilis trên từng loại môi trường nhân giống cấp 1 36
Bảng 4.2. Hoạt độ enzyme amylase và protease trên từng loại môi trường nhân giống cấp1 37
Bảng 4.3. Số lượng tế bào B. subtilis trên từng loại môi trường nhân giống cấp 2 39
Bảng 4.4. Hoạt độ enzyme amylase và protease trên từng loại môi trường nhân giống cấp 2 40
Bảng 4.5. Kết quả kiểm tra chế phẩm Bacillus subtilis trong thời gian bảo quản 42
Bảng 4.6. Kết quả thử phản ứng sinh hóa của Lactobacillus acidophilus 45
Bảng 4.7. Khả năng tạo độ chua của L. acidophilus trên môi trường sữa đặc có đường 46
Bảng 4.8. Số lượng của L. acidophilus trên môi trường sữa đặc có đường 46
Bảng 4.9. Khả năng tạo độ chua của L. acidophilus trên môi trường sữa đậu nành 47
Bảng 4.10. Số lượng của L. acidophilus trên môi trường sữa đậu nành 47
Bảng 4.11. Số lượng vi khuẩn L. acidophilus sau thời gian bảo quản 48

xii
DANH SÁCH CÁC HÌNH
HÌNH TRANG
Hình 2.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis 3
Hình 2.2. Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus 5
Hình 2.3. Enzyme α-amylase 19
Hình 2.4. Enzyme protease 21
Hình 4.1. Xác định hoạt độ amylase theo phương pháp Wolhgemuth 37
Hình 4.2. Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Gross + Fuld 38
Hình 4.3 . Kiểm tra số lượng vi khuẩn B. subtilis trên môi trường A 39
Hình 4.4 . Sinh khối vi khuẩn Bacillus subtilis trên môi trường A và B 41
Hình 4.5 . Hoạt độ amylase trong chế phẩm chứa Bacillus subtilis 42
Hình 4.6 . Hoạt độ protease trong chế phẩm chứa Bacillus subtilis 42
Hình 4.7 . Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus trên môi trường thạch MRSA 44
Hình 4.8. Khả năng lên men đường của Lactobacillus acidophilus 45
Hình 4.9. Chế phẩm chứa Bacillus subtilis và L. acidophilus sau khi đóng gói 48

xiii
DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ

SƠ ĐỒ TRANG
Sơ đồ 3.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đối với Bacillus subtilis 27
Sơ đồ 3.2. Sơ đồ quy trình sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis 29
Sơ đồ 3.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đối với Lactobacillus acidophilus 31
Sơ đồ 3.4. Quy trình phân lập vi khuẩn Lactobacillus acidophilus 32


DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ

BIỂU ĐỒ TRANG
Biểu đồ 4.1. Số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis sau thời gian bảo quản 43
Biểu đồ 4.2. Số lượng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus sau thời gian bảo quản 48

1
Phần 1. MỞ ĐẦU
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, con người có xu hướng trở dần về với tính chất thiên nhiên thông qua việc
sử dụng một số chất có hoạt tính sinh học hay các phương pháp sinh học để ứng dụng
trong công nghiệp, nông nghiệp, cải thiện môi trường và để chữa bệnh. Lý do đơn giản là
con người đã hiểu được mặt trái khi sử dụng các chất hóa học, chất kháng sinh. Những
chất này tuy có hiệu quả nhanh chóng nhưng hậu quả mà nó mang lại rất lớn.
Trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản trước đây người ta thường dùng những
chất kháng sinh để phòng và trị bệnh cho gia súc, gia cầm và tôm, cá Việc sử dụng
kháng sinh trong một thời gian dài đã để lại nhiều hậu quả không mong muốn như sự
kháng thuốc của vi khuẩn hoặc rối loạn hệ vi sinh vật đường ruột làm bệnh tái phát
nặng hơn và dẫn đến khó điều trị hơn. Nghiêm trọng hơn sự tồn dư kháng sinh trong
thịt dẫn đến phẩm chất thịt giảm làm hạ giá thành sản phẩm gây thiệt hại rất lớn trong
chăn nuôi.
Để khắc phục được tình trạng này, các nhà khoa học đã nghiên cứu sử dụng trực

tiếp những vi sinh vật sống, có lợi thường gọi là “probiotic”. Kết quả đã chứng minh
được lợi ích của những vi khuẩn có lợi này trong việc phòng và điều trị một số bệnh
trong chăn nuôi, thủy sản và cho cả con người. Điều quan trọng là nó không để lại
những hậu quả hay di chứng khi sử dụng như các loại hóa chất và thuốc kháng sinh.
Xuất phát từ những vấn đề trên chúng tôi tiến hành đề tài “Xác định môi trường
tối ưu để thu sinh khối và enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis, Lactobacillus
acidophilus. Thử nghiệm sản xuất chế phẩm sinh học” để phục vụ trong chăn nuôi
và thủy sản.





2
1.2. MỤC ĐÍCH
Xác định được môi trường tối ưu của vi khuẩn Bacillus subtilis và Lactobacillus
acidophilus để sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng trong chăn nuôi thú y và nuôi trồng
thủy sản.
1.3. YÊU CẦU
1.3.1. Đối với Bacillus subtilis
9 Thực hiện việc nuôi cấy Bacillus subtilis trên nhiều loại môi trường khác nhau
để xác định xem môi trường nào làm cho vi khuẩn sinh enzyme protease và
amylase nhiều nhất.
9 Sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis .
9 Kiểm tra chất lượng của chế phẩm vừa sản xuất và sau thời gian bảo quản.
1.3.2. Đối với Lactobacillus acidophilus
9 Phân lập từ chế phẩm Antibio do Hàn Quốc sản xuất.
9 Tìm môi trường nhân giống thích hợp cho sinh khối và độ chua cao nhất.
9 Sản xuất chế phẩm chứa vi khuẩn Lactobacillus acidophilus.
9 Kiểm tra chất lượng của chế phẩm vừa sản xuất và sau thời gian bảo quản.

3
Phần 2. TỔNG QUAN
2.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS
2.1.1. Lịch sử
Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên trong phân ngựa vào năm 1941 bởi tổ
chức y học Nari của Đức. Lúc đầu chủ yếu được sử dụng để phòng bệnh lị cho các
binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi.
Năm 1949 – 1957 Henry và các cộng sự tách được các chủng thuần khiết của
Bacillus subtilis. Từ đó “Subtilistherapie” có nghĩa là thuốc subtilin ra đời trị các
chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy do rối loạn tiêu hóa.
2.1.2. Phân loại và đặc điểm
2.1.2.1. Phân loại
Theo khóa phân loại của Bergey vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc:
Bộ: Eubacteriales

Họ: Bacillaceae
Giống: Bacillus
Loài: Bacillus subtilis
2.1.2.2. Đặc điểm
Vi khuẩn Bacillus subtilis là trực khuẩn
nhỏ, hai đầu tròn, Gram dương (G
+
), kích
thước 0,5 - 0,8 µm × 1,8 – 3 µm. Đứng thành
chuỗi ngắn hoặc đơn lẻ, di động, sinh bào tử
nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào, kích thước bào tử 0,8 – 1,8 µm. Phát triển bằng
cách nảy chồi do sự nứt của bào tử. Chúng là loại vi sinh vật hiếu khí, nhiệt độ tối thích cho
sinh trưởng là 36 - 50
o
C, tối đa khoảng 60
o
C, bào tử chịu nhiệt khá cao. Nồng độ muối ăn
làm ngừng phát triển của Bacilluss subtilis là 10 – 15% (Lương Đức Phẩm, 2000). Chúng
phân bố rộng rãi trong ngoại cảnh, nhất là trên bề mặt thực vật (cỏ khô, khoai tây).
Hình 2.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis
Một đặc điểm dùng để phân biệt với các vi khuẩn khác là làm tan chảy gelatine
nhanh chóng. Sữa cấy Bacillus subtilis trước tiên sau đó cấy men lactic trở nên acid
nhanh chóng hơn sữa chỉ cấy men lactic. Vi khuẩn tác động bằng protease làm hình
thành paraprotein từ casein, sữa cấy Bacillus subtilis bị kết tủa khi cho vào clorua calci
(Nguyễn Vĩnh Phước, 1978).

4
Khi nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa Bacillus subtilis có khuẩn lạc tròn, không
đều hay phân tán. Đường kính khuẩn lạc 3 – 5 mm, phát triển chậm, màu vàng xám ở
giữa sậm màu, rìa có răng cưa. Sau 1 – 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi nâu.

Trong môi trường canh (nutrian broth) chúng phát triển làm đục môi trường, tạo
thành màng nhăn trên bề mặt, lắng cặn, ít hoặc không tạo nhớt.
Bacillus subtilis cho một số phản ứng sinh hóa:
• Lên men nhưng không sinh hơi các loại đường: glucose, maltose, mannitol,
saccharose, xylose, arabinose.
• Indol (-), VP (+), nitrat (+), H
2
S (-), NH
3
(+), catalase (+), amylase (+), casein (+),
citrat (+), có khả năng di động và hiếu khí.
2.2. ĐẠI CƯƠNG VỀ VI KHUẨN LACTIC
Theo hệ thống phân loại của Bergey năm 1979 thì vi khuẩn lactic được phân loại
như sau:
Họ: Lactobacteriaceae
Họ phụ: Streptococcaceae
Giống: Streptococcus
Leuconostoc
Họ phụ: Lactobacteriaceae
Giống: Lactobacterium
2.2.1. Giới thiệu về vi khuẩn Lactobacillus acidophilus
2.2.1.1. Lịch sử
Lactobacillus acidophilus lần đầu tiên được phân lập bởi Moro (1900) từ phân của
trẻ sơ sinh đã qua phẫu thuật. Ông đã mô tả được các đặc điểm trao đổi chất, phân loại
cũng như chức năng của vi khuẩn này.
Năm 1906 Metchnikoff xuất bản cuốn “The prolongation of life optinistic studies”.
Ông chứng minh rằng vi khuẩn lactic trong yoghurt bulgarian như là nhân tố chống lại
sự thối rữa ruột và sự lão hóa. Tuy nhiên sau đó người ta khám phá ra rằng chủng vi
khuẩn này không thể sống sót khi qua dạ dày và ruột. Do đó người ta nhanh chóng thay
thế chủng vi khuẩn này bằng chủng L. acidophilus như là một probiotic trong ruột. Họ

thấy rằng có rất nhiều vi khuẩn Lactobacillus lên men đồng hình và dị hình sống trong
ruột, miệng và âm đạo nhưng chiếm ưu thế nhất trong số đó là 6 loài Lactobacillus lên
men đồng hình tạo thành nhóm gọi là phức hợp Lactobacillus acidophilus.

5
2.2.1.2. Đặc điểm
Lactobacillus acidophilus thuộc họ vi
khuẩn lactic. Chúng có dạng trực khuẩn
dài và chịu nhiệt. Tế bào hình que, đầu
tròn, kích thước 0,6 - 0,9 × 1,5 – 6 µm
đứng riêng rẻ, xếp thành đôi hay thành
chuỗi ngắn, không di động, không sinh
bào tử, tế bào non bắt màu Gram dương
khi nhuộm, tế bào già trở thành Gram
âm. Vi hiếu khí, nhiệt độ thích hợp là 37
o
C, không phát triển ở 20 - 22
o
C và 43 - 48
o
C.
Hình 2.2. Lactobacillus acidophilus
Trên môi trường nước chiết cà chua hay nước chiết nấm men khuẩn lạc có dạng
tròn, nhỏ ở giữa dày và đục hơn mép ngoài. Trong môi trường thạch sâu khuẩn lạc nhỏ
và có hình dạng không ổn định. Trên môi trường thạch nghiêng thì khuẩn lạc khô, phát
triển kém và giới hạn theo vết cấy.
Lên men lactic đồng hình, tích tụ 2,2% acid lactic trong môi trường, không phát
triển trong môi trường hydratcarbon, môi trường khoai tây, phát triển tốt trên môi
trường dịch thể cao nấm men.
L. acidophilus là một dạng probiotic được sử dụng thường xuyên nhất. Là vi khuẩn

có lợi cư trú trong ruột, âm đạo, trong phân người và động vật. Chúng có khả năng sinh
Bacteriocin là chất có hoạt tính ức chế các vi khuẩn gây bệnh đường ruột.
L. acidophilus có khả năng lên men các loại đường: glucose, fructose, galactose,
mannose, maltose, lactose và không lên men xylose, arabinose, ramnose, glycerol,
mannitol, sorbitol, inositol. Cho các phản ứng: methyl red (+), indol (-), VP (-), citrate
(-), catalase (-), khả năng đông vón sữa (+).
2.2.1.3. Quá trình trao đổi chất
Hiện nay các thành viên của phức hợp Lactobacillus acidophilus được phân vào
nhóm lên men đồng hình bắt buộc. Hexose được lên men để tạo thành acid lactic theo
con đường EMP. Chúng có enzyme aldolase nhưng thiếu phosphoketolase, không lên
men gluconat và pentose. Tất cả các loài đều tạo đồng phân dạng D và L của acid
lactic (Lê Thị Hồng Tuyết, 2004).



6
2.2.1.4. Sự thay đổi thành phần của sữa trong quá trình lên men
Trong quá trình lên men sữa tạo thành sản phẩm sữa chua có sự thay đổi sâu sắc
các loại đường, casein và các thành phần khác.
• Sự thay đổi đường sữa
Vi khuẩn lactic sử dụng đường lactose nhờ hệ thống enzyme lactase để chuyển hóa
lactose thành glucose và galactose. Lactase là một endoenzyme nên khi lactose muốn
được chuyển hóa thì phải qua màng vi khuẩn. Lactose sẽ được chuyển hóa theo hai
con đường:
¾ Vi khuẩn sử dụng enzyme lactase (hay enzyme galactosidase) để bẻ gãy H
2

chuyển lactose thành glucose và galactose.
¾ Lactose được oxi hóa thông qua enzyme lactosehydrogenase thành lactosebionat
sau đó phân giải tiếp thành gluconat và galactose qua một giai đoạn diễn biến

phức tạp, mỗi giai đoạn do một enzyme chuyên biệt phụ trách.
• Sự thay đổi protein sữa
Trong quá trình lên men, lượng acid hữu cơ các loại càng tích lũy càng làm tăng
quá trình tách calci ra khỏi casein tạo pH đẳng điện. Do đó, casein bị vón lại làm tăng
quá trình lên men tạo pepton và các sản phẩm khác nhau.




















7
Con đường chuyển hóa chủ yếu của quá trình lên men sữa
+
CO
2

ADP
ATP
NAD
+
NADH
ATP
ADP
Glucose-6 phosphat
galactose
Lactose
glucose
ATP
ADP
Fructose-6 phosphat
1,3 diphosphoglycerat
Glyceraldehyd-3 phosphat
Fructose-1,6 phosphat
Dihydroxyaceton phosphat
acid pyruvic
Aldehyd acetic citric

+
2H
acid malic
-CO
2
Acetyl- CoA
acid propionic
Chu trình acid citric
Rượu etylic

acid malic
acid lactic
+2H
2.2.2. Ứng dụng của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công
nghiệp, nông nghiệp, môi trường, y dược và nhiều nhất là trong chế biến bảo quản
thực phẩm.
2.2.2.1. Trong công nghiệp
Vi khuẩn lactic được sử dụng để lên men thu acid lactic. Có vị chua dễ chịu và có
đặc tính bảo quản nên có thể làm gia vị đối với các loại nước uống nhẹ, tinh dầu, dịch
quả, mứt. Chúng được dùng để acid hóa rượu vang và hoa quả nghèo acid, ngoài ra
còn được sử dụng trong công nghiệp thuộc da, dệt, nhuộm, sơn và chất dẻo.