Luận văn : PHÂN LẬP, KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÌM HIỂU KHẢ NĂNG SINH ENZYME CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS ĐỂ SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC part 2 doc

xi
DANH SÁCH SƠ ĐỒ

Sơ đồ 3.1: Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất 20
Sơ đồ 3.2: Định danh vi khuẩn Bacillus subtilis (theo Nguyễn Ngọc Thanh Xuân, 2006). 21










1
Chƣơng 1
MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Ngày nay, nền kinh tế ngày càng phát triển cùng với những tiến bộ khoa
học đã làm cho cuộc sống con người có nhiều thay đổi lớn. Càng ngày đời sống tinh
thần vật chất càng cao, do đó nhu cầu về chất lượng sản phẩm cũng tăng cao đòi hỏi
những nhà sản xuất phải nâng cao chất lượng sản phẩm của mình để đáp ứng nhu
cầu của người tiêu dùng.
Với mục đích bảo vệ sức khỏe cho người sử dụng sản phẩm chăn nuôi, bảo
vệ môi trường sống không bị ô nhiễm bởi các hoá chất độc hại, người ta hạn chế
hoặc cấm sử dụng một số loại thuốc, đặc biệt là thuốc kháng sinh và thay thế thuốc
kháng sinh bằng các chế phẩm sinh học. Chế phẩm sinh học hay còn gọi là
“probiotic” bao gồm các vi sinh vật sống có lợi, có tính đối kháng cao khi

được đưa vào đường ruột sẽ tạo sự cân bằng có lợi của hệ sinh vật đường
ruột, ức chế vi sinh vật có hại, phòng bệnh tiêu chảy cho thú đặc biệt là heo
con. Ngoài ra, những chế phẩm sinh học còn cải thiện tốt quá trình tiêu hoá
(nhờ những enzyme vi sinh vật, hoặc những sản phẩm do quá trình lên men
của chúng), giúp nâng cao sức đề kháng, tăng trọng nhanh.
Từ những thực tế trên, dưới sự hướng dẫn của Tiến sĩ Nguyễn Ngọc Hải,
chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:
“Phân lập, khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis và tìm hiểu
khả năng sinh enzyme (protease, amylase) của vi khuẩn để sản xuất thử nghiệm chế
phẩm sinh học”.

2
1.2. Mục đích đề tài
Tìm hiểu đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis nhằm ứng dụng sản xuất
chế phẩm sinh học (probiotic), với mục đích nâng cao năng suất và tăng hiệu quả
kinh tế trong chăn nuôi.
1.3. Yêu cầu đề tài
Phân lập được loài vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất, hoặc từ chế phẩm.
Khảo sát khả năng sinh hai loại enzyme (protease, amylase) của vi khuẩn
và các yếu tố ảnh hưởng.
Xây dựng quy trình sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học.
Khảo sát sự thay đổi hoạt độ của enzyme chế phẩm trong thời gian
bảo quản.

3
Chƣơng 2
TỔNG QUAN
2.1. Sơ lƣợc về vi khuẩn Bacillus subtilis
2.1.1. Lịch sử phát hiện
Bacillus subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa năm 1941 bởi tổ
chức y học Nazi của Đức. Lúc đầu được sử dụng chủ yếu là để phòng bệnh lỵ cho
các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Việc điều trị phải đợi đến những năm
1949 - 1957, khi Henrry và các cộng sự tách được chủng thuần khiết của Bacillus
subtilis. Từ đó “subtilis therapy” có nghĩa là "thuốc subtilis" ra đời trị các chứng
viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy trong rối loạn tiêu hoá. Ngày nay, vi
khuẩn này đã trở nên rất phổ biến, được sử dụng rộng rãi trong y học, chăn nuôi,
thực phẩm (trích Lý Kim Hữu, 2005).
2.1.2. Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis
 Đặc điểm phân loại:
Theo phân loại của Bergy (1994) Bacillus subtilis thuộc:
Bộ: Eubacteriales
Họ: Bacillaceae
Giống: Bacillus
Loài: Bacillus subtilis
Hình 2. 1. Vi khuẩn Bacillus subtilis
www.microscopyconsulting.com/ Gallery/pages/Ba

4
 Đặc điểm phân bố:
Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc, chúng được
phân bố hầu hết trong tự nhiên. Phần lớn chúng cư trú trong đất, thông thường đất
trồng trọt chứa khoảng 10 - 100 triệu CFU/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc,
vùng đất hoang thì vi khuẩn Bacillus subtilis rất hiếm. Nước và bùn cửa sông cũng
như ở nước biển cũng có mặt bào tử và tế bào Bacillus subtilis (Vũ Thị Thứ, 1996).
2.1.3. Đặc điểm hình thái
Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, G
+
, kích thước
0,5 - 0,8 m x 1,5 – 3 m, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả năng di động,
có 8 - 12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế
bào, kích thước từ 0,8 - 1,8 m. Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt của
bào tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng
xạ (Tô Minh Châu, 2000).
2.1.4. Đặc điểm nuôi cấy
 Điều kiện phát triển: hiếu khí, nhiệt độ tối ưu là 37
0
C
 Nhu cầu O
2
: Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng lại có khả năng
phát triển yếu trong môi trường thiếu oxy.
 Độ pH: Bacillus subtilis thích hợp nhất với pH = 7,0 - 7,4.
 Môi trường
Môi trường thạch đĩa TSA: khuẩn lạc dạng tròn, rìa răng cưa không đều,

có tâm sẫm màu, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm. Sau 1 - 4 ngày bề mặt nhăn
nheo, màu hơi nâu.
Môi trường thạch nghiêng TSA: dễ mọc, tạo thành màu xám, rìa nhăn gợn sóng.
Môi trường gelatin: phát triển và làm tan chảy gelatin.
Thạch khoai tây: phát triển đều, màu vàng lấm tấm hạt.
5
Môi trường canh TSB: Bacillus subtilis phát triển làm đục môi trường, tạo
màng nhăn, lắng cặn kết lại như vẩn mây ở đáy, lắc lên khó tan đều.
2.1.5. Đặc điểm sinh hoá
Lên men không sinh hơi các loại đường: glucose, maltose, mannitol,
saccharose, xylose, arabinose.
Indol (-), VP (+), Nitrat (+), H
2
S (-), NH
3
(+), catalase (+), amylase (+),
casein (+), citrat (+), di động (+), hiếu khí (+).
Phản ứng sinh hoá
Kết quả
Hoạt tính catalase
+
Sinh indol
-
MR
+
VP
+
Sử dụng citrate
+
Khử nitrate

+
Tan chảy gelatin
+
Di động
+
Phân giải tinh bột
+
Arabinose
+
Xylose
+
Saccharose
+
Mannitol
+
Glucose
+
Lactose
-
Maltose
+

(Theo Holt, 1992) (trích Lý Kim Hữu, 2005).
6
2.1.6. Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis
2.1.6.1. Cấu tạo bào tử
Ngoài cùng của bào tử là một lớp màng, dưới lớp màng là vỏ. Vỏ bào tử có
nhiều lớp. Đây là những lớp có tác dụng ngăn chặn sự thẩm thấu của nước và các
chất hoà tan trong nước. Dưới lớp vỏ là lớp màng trong của bào tử và trong cùng là
một khối tế bào chất đồng nhất. Trong các bào tử tự do không tồn tại sự trao đổi

chất, vì vậy có thể giữ ở trạng thái tiềm sinh trong nhiều năm (Lê Đỗ Mai Phương, 2004).
Bào tử khác tế bào dinh dưỡng về cấu trúc, thành phần hoá học và tính chất sinh lý.
2.1.6.2. Khả năng tạo bào tử
Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacillus subtilis là khả năng tạo
bào tử trong những điều kiện nhất định. Bacillus subtilis có khả năng hình thành
bào tử theo chu trình phát triển tự nhiên hoặc khi vi khuẩn gặp điều kiện bất lợi
(dinh dưỡng trong môi trường bị kiệt quệ) (Tô Minh Châu, 2000).
Sự tạo bào tử diễn ra gồm nhiều giai đoạn, tổng cộng gần 8 giờ để hoàn tất.
Lúc đầu lớp nguyên sinh chất trong tế bào được sử dụng. Tế bào chất và nhân tập
trung tại một vị trí nhất định trong tế bào. Tế bào chất tiếp tục cô đặc lại và tạo
thành tiền bào tử (Prospore). Tiền bào tử bắt đầu được bao bọc dần bởi các lớp
màng. Tiền bào tử phát triển và trở thành bào tử. Khi bào tử trưởng thành, tế bào
dinh dưỡng tự phân giải và bào tử được giải phóng khỏi tế bào mẹ. Khi gặp điều
kiện thuận lợi, bào tử sẽ hút nước và bị trương ra. Sau đó, vỏ của chúng bị phá huỷ
và bào tử nảy mầm phát triển thành tế bào mới. Mỗi tế bào dinh dưỡng chỉ tạo ra
một bào tử (Lê Đỗ Mai Phương, 2004).
2.1.7. Tính chất đối kháng
Với vi sinh vật gây bệnh, mỗi loài sinh vật khác nhau sẽ thích hợp ở điều
kiện môi trường khác nhau, sinh khuẩn lạc khác nhau. Thay đổi môi trường hoặc
các yếu tố môi trường bất lợi là làm thay đổi điều kiện sống, làm hạn chế hoặc ức
chế sự phát triển của vi sinh vật. Thực tế khi môi trường nuôi cấy nấm bệnh có sự
hiện diện của Bacillus subtilis với một số lượng lớn sẽ xảy ra sự cạnh tranh dinh

7
dưỡng. Cạnh tranh không gian sinh sống giữa vi khuẩn và nấm. Do vi khuẩn phát
triển nhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ sử dụng phần lớn các chất dinh dưỡng trong môi
trường, đồng thời tạo ra một số loại kháng sinh nên sự sinh trưởng của nấm bị ức
chế (Nguyễn Lân Dũng và Hoàng Đức Thuận, 1976).
2.2. Giới thiệu về enzyme amylase và enzyme protease
2.3.1. Enzyme amylase

2.3.1.1. Lịch sử nghiên cứu
Những nghiên cứu thực nghiệm đầu tiên về enzyme nói chung và về enzyme
amylase nói riêng được bắt đầu vào những năm 1811 – 1814. Những nghiên cứu
này gắn liền với tên tuổi của nhà bác học người Nga – Viện sĩ K.S Kirhof. Ông
nghiên cứu quá trình phân giải tinh bột dưới tác dụng của dịch chiết đại mạch nảy mầm
(malt) và nhận thấy rằng trong malt có chứa các chất phân giải tinh bột thành đường.
Các enzyme amylase có trong nước bọt, dịch tiêu hóa của người và động vật,
trong hạt nẩy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn. Theo tính chất và phương
pháp tác dụng lên tinh bột người ta phân biệt α-amylase, β-amylase, gluco-amylase
(γ-amylase), oligo- 1,6 -glucoxydase (dextrinase).
2.3.1.2. Vi sinh vật tạo amylase
Vi sinh vật tạo amylase được dùng nhiều hơn cả đó là nấm mốc, nấm men
và vi khuẩn, còn xạ khuẩn thì ít hơn. Để thu amylase người ta thường dùng các
giống vi sinh vật sau:
Nấm mốc: Aspergillus, Rhizopus.
Nấm men: Candida, Saccharomyces, Endomycopsis, Endomyces (Gratrova, 1975;
Conovalov, 1972; Fukumoto, 1962; Hattori, 1961).
Vi khuẩn: Bacillus mesentericus, B. subtilis, B. macecassavanum, Clostridium
acetobutylium, Penicillium saccharophila,… Các vi khuẩn ưa nhiệt có khả năng sinh
trưởng nhanh (4 – 6 lần so với vi khuẩn ưa ẩm) và phát triển tốt ở nhiệt độ tương
đối cao, nên khi nuôi chúng ở nhiệt độ cao ít bị nhiễm vi sinh vật khác.
Trong số vi khuẩn ưa ấm tạo amylase mạnh, thì Bacillus subtilis được nghiên cứu

8
và sử dụng rộng rãi nhất. Riêng ở Nhật, hàng năm người ta sản xuất tới hàng chục
nghìn tấn chế phẩm amylase và protease từ loài vi khuẩn ưa ấm và hiếu khí này.
Nhiệt độ sinh trưởng tối thích của Bacillus subtilis là 37
0
C.
2.3.1.3. Đặc tính của amylase

Hiện nay người ta đã biết rõ có 6 loại enzyme amylase trong đó α-amylase,
β-amylase, gluco-amylase (γ-amylase) thủy phân các liên kết α – 1,4 - glucoside của
tinh bột và các polysaccharide; 3 amylase còn lại (dextrine – 6 - glucanhidrolase,
amilopectin - 6 - glucanhidrolase, oligodexin - 6 - glucanhidrolase hay dextrinase)
thuỷ phân các liên kết α – 1,6 - glucoside trong polysaccharide và các dextrin cuối.
Các enzyme amylase có nguồn gốc khác nhau thì thường khác nhau về tính
chất, cơ chế tác dụng cũng như sản phẩm cuối cùng của sự thuỷ phân.
 α-amylase:
α-amylase có khả năng phân cắt các liên kết α – 1,4 - glucoside nằm ở phía
bên trong phân tử cơ chất (tinh bột, glycogen và polysaccharide) một cách ngẫu
nhiên, không theo một trật tự nào. Khi tác dụng lên tinh bột, enzyme này giải phóng
ra glucose ở dạng α- mutamer, nên năm 1924 Kuhn gọi nó là α-amylase.
α-amylase không chỉ thuỷ phân hồ tinh bột mà nó thuỷ phân cả hạt tinh bột
còn nguyên, song với tốc độ rất chậm. Dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể
chuyển thành maltotrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên,
α-amylase thường thuỷ phân tinh bột thành dextrin phân tử thấp không cho màu với
iod và một ít maltose, do đó α-amylase có tác dụng làm giảm độ nhớt của hồ tinh
bột rất mạnh (dịch hoá).
Tinh bột α-amylase α- dextrin + maltose + glucose
(hoặc glucogen) (nhiều) (ít)
α-amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và rượu loãng,
α -amylase bền nhiệt hơn so với các amylase khác. Tất cả các α-amylase đều bị
kiềm hãm bởi kim loại nặng như: Cu
2+
, Ag
+
, Hg
2+
. So với α-amylase của nấm mốc,
amylase của vi khuẩn có hoạt lực dextrin hoá trội hơn hoạt lực đường hóa.

9
α-amylase của nấm mốc hầu như chỉ tấn công những hạt tinh bột bị vỡ, còn
α-amylase vi khuẩn lại có khả năng phân huỷ các hạt tinh bột còn nguyên lẫn hồ
tinh bột (Popadicts và cộng sự, 1971). Amylase của Bacillus subtilis phân giải tinh
bột còn nguyên 2 – 2,5 lần nhanh hơn so với α-amylase của nấm mốc (Lixiuk và
Popadicts, 1969) (trích Lê Minh Cẩm Ngọc, 2005).
Vận tốc phân hủy tinh bột bởi α amylase vi khuẩn ở giai đoạn đầu cao hơn
α–amylase của Aspergillus oryzae tới 25%.
pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ nấm mốc là 4,5 – 4,8; của
vi khuẩn là 5,8 – 6,0 (hoạt động tốt trong vùng pH: 5,8 – 7,0).
Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α–amylase là 50
0
C.
Amylase của vi khuẩn có thể chịu được nhiệt độ 92
0
C, trong khi đó amylase
của nấm mốc bị vô hoạt ở 70
0
C. Tính bền nhiệt cao của α–amylase vi khuẩn là một ưu
điểm lớn: được sử dụng để xử lý nguyên liệu ở các công đoạn phải dùng nhiệt cao.
 β-amylase
β-amylase không thủy phân hạt tinh bột nguyên mà thủy phân mạnh mẽ hồ tinh bột.
β-amylase xúc tác sự thuỷ phân các liên kết α – 1,4 - glucan trong tế bào.
β-amylase chỉ phổ biến trong giới thực vật (có nhiều trong các hạt nảy
mầm). Vi khuẩn không có β-amylase.
 Glucoamylase
Glucoamylase xúc tác sự thuỷ phân các liên kết α – 1,4 và α – 1,6 - glucan
trong polysaccharide.
Glucoamylase có khả năng thuỷ phân hòan toàn tinh bột, glucogen,

amylopeptin, panose, isomantose và mantose tới glucose.
Đa số glucoamylase đều thuộc loại enzyme acid, thể hiện hoạt lực tối đa ở
vùng pH 3,5 – 5.
Glucoamylase bền với acid nhưng lại kém bền với tác dụng của rượu
etylic, aceton.