CHẨN ÐOÁN NHANH LAO MÀNG NÃO Ở TRẺ EM BẰNG PHƯƠNG PHÁP POLYMERASE CHAIN REACTION doc

CHẨN ÐOÁN NHANH LAO MÀNG NÃO Ở TRẺ EM BẰNG
PHƯƠNG PHÁP POLYMERASE CHAIN REACTION

TÓM TẮT
Chúng tôi đã sử dụng phương pháp Polymerase chain reaction (PCR) trong
việc chẩn đoán sớm các trường hợp nghi ngờ lao màng não (LMN) ở trẻ em.
Với phương pháp này, vi khuẩn M. tuberculosis trong dịch não tủy được xác
định ở 24 trẻ trong số 78 trẻ bị LMN, không có một trường hợp nào dương
tính ở 59 trẻ bị viêm màng não mủ. Ðối với kết quả cấy vi khuẩn lao thì có
13 trường hợp trong số 78 trường hợp LMN dương tính. Thời gian để trả lời
kết quả PCR là 48 giờ. Ðây là một phương pháp hữu ích trong việc chẩn
đoán nhanh LMN so với các phương pháp thông thường khác.
SUMMARY
RAPID DIAGNOSIS OF TUBERCULOUS MENINGITIS IN CHILDREN
BY POLYMERASE CHAIN REACTION
Nguyen Ngoc Lan, Tran Ngoc Duong, Le Quoc Thinh, Pham Hung Van * Y
hoc TP. Ho Chi Minh * 1999, vol. 3, N
0
2: 90-94
Polymerase chain reaction (PCR) was developed for early diagnosis of
tuberculous meningitis. By this method, within 48 hours the specific DNA
segment come from IS6110 of Mycobacterium tuberculosis (M.
tuberculosis) was detected from the CSF of 24 of 78 children with
tuberculous meningitis. None of the CFS from 59 children with bacterial
meningitis was detected the present of M. tuberculosis DNA. Of 78 cases of
tuberculous meningitis, 13 cases give positive culture results. This is highly
useful method for the rapid diagnosis of tuberculous meningitis over other
conventional method.
ÐặT VấN ĐỀ
Hiện nay, bệnh lao vẫn còn là vấn đề lớn đối với sức khỏe con người trên thế
giới và ngay cả ở các nước đã phát triển thì tần suất bệnh lao cũng cao do số

người bị nhiễm HIV ngày càng gia tăng
(1,18)
. Trong số những thể lâm sàng
bệnh lao thì lao màng não (LMN) là một dạng nặng nhất. Ngoài tỉ lệ gây tỉ
vong cao, lao màng não còn để lại những di chứng rất nặng nề đối với bệnh
nhân đặc biệt đối với trẻ em như não úng thủy, liệt một phần cơ thể, tổn
thương não cục bộ Tất cả những di chứng hay tỉ lệ tử vong cao thường là
do kết quả của sự điều trị chậm trễ
(3,8,16)
. Việc chẩn đoán LMN thường gặp
rất nhiều khó khăn do dấu hiệu biểu hiện lâm sàng không đặc hiệu và các xét
nghiệm hỗ trợ thì thiếu tin cậy (công thức máu, sinh hóa dịch não tủy ).
Phương pháp soi trực tiếp tìm vi khuẩn lao trong dịch não tủy là một phương
pháp nhanh và đơn giản nhưng thiếu độ nhạy vì muốn xác định được vi
khuẩn thì nồng độ vi khuẩn phải trên 10
4
/ml
(2)
. Do đó hết các chẩn đoán
LMN đều có kết quả soi trực tiếp âm tính. Phương pháp nuôi cấy nhạy hơn
phương pháp soi trực tiếp nhiều lần và nó cho phép phân lập, định danh
được chủng vi khuẩn nhưng đòi hỏi nhiều tuần lễ (6-8 tuần lễ). Do đó, khó
có thể xem nuôi cấy là phương pháp chẩn đoán nhanh LMN
(9,17)
.
Một kỹ thuật mới cho kết quả nhanh, nhạy cảm và xác định đặc hiệu đối với
lao đó là kỹ thuật Polymerase chain reaction (PCR)
(10-12,15)
. Kỹ thuật này
dựa vào sự khuếch đại ADN của M. tuberculosis. Qua kỹ thuật này, chúng

tôi khuếch đại một trình tự nucleotid nằm ở đoạn IS6110, một đoạn đặc hiệu
đối với M. tuberculosis và có nhiều bản copy (khoảng 8-16) trong nhiễm
sắc thể của các vi khuẩn trong phức hợp M. tuberculosis. Ðể kiểm tra sự ức
chế bên trong của phản ứng nhằm chắc chắn kết quả là âm thật, chúng tôi
dùng vi khuẩn M. smegmatis 1008 tái tổ hợp có chứa đoạn IS6110
(10)
.
PCR là một kỹ thuật có thể xác định chẩn đoán lâm sàng của lao trong vòng
2 ngày. Do đó bệnh nhân có thể được điều trị sớm. Chúng tôi báo cáo kết
quả PCR được thực hiện trên dịch não tủy của các bệnh nhi có dấu hiệu,
triệu chứng lâm sàng nghi lao và trên cả dịch não tủy các bệnh nhi đã chẩn
đoán viêm màng não mủ (VMNM).
BệNH PHẩM VÀ PHƯƠNG PHÁP
Bệnh phẩm
Dịch não tủy được lấy từ 78 bệnh nhi nhập viện tại trung tâm Lao và bệnh
Phổi Phạm Ngọc Thạch với chẩn đoán lâm sàng nghi ngờ bị viêm màng não
do lao và 59 bệnh nhi đã được chẩn đoán xác định viêm màng não mủ ở
bệnh viện Nhi Ðồng 1 nhờ kết quả vi trùng dương tính trong dịch não tủy
qua phương pháp nhuộm Gram, cấy hay latex từ tháng 12/95 tới 12/96. Tất
cả bệnh nhân từ 4 tháng đến 14 tuổi và không một bệnh nhân nào có điều trị
đặc hiệu trước khi có chọc dò dịch não tủy.
Phương pháp
Tất cả các mẫu dịch não tủy đều được thực hiện các bước sau đây:
Soi kính hiển vi
Phết trực tiếp dịch não tủy trên lam và đưa nhuộm Ziehl-Neelsen, nhuộm
Gram và nhuộm mực tàu.
Cấy vi khuẩn lao
78 Mẫu dịch não tủy của các bệnh nhi được chẩn đoán LMN được cấy
khoảng 1ml trên mỗi hai ống môi trường Lowenstein-Jensen và được ủ ở
nhiệt độ 37

o
C. Các ống môi trường này được xem xét mỗi tuần để khảo sát
sự mọc của vi khuẩn. Thời gian kết luận vi trùng không mọc là 12 tuần lễ.
Cấy vi khuẩn
59 Mẫu dịch não tủy của bệnh nhi VMNM đều được cấy trên môi trường
thạch nâu (chứa 5% hồng cầu cừu và NAD 15g/ml) và môi trường Mac
Conkey. Tất cả các môi trường đều ủ ở 37
o
C/ 5-7% CO
2
và đọc kết quả sau
24-48 giờ. Các vi khuẩn phân lập trên môi trường đều được định danh theo
qui trình kinh điển. Ngoài ra các mẫu dịch não tủy đều được làm phản ứng
ngưng kết latex (Slidex Meningite Kit 5, Pháp) để phát hiện kháng nguyên
hòa tan của một số vi trùng gây viêm màng não mủ thường gặp gồm có N.
meningitidis (type A, B, C), S. pneumoniae và H. influenzae type b.
Ly trích DNA từ dịch não tủy
Một cách tóm tắt, 90l dịch não tủy được xử lý với 10l dung dịch
proteinase K và ủ cách thủy 56
o
C qua đêm. Sau đó DNA được ly trích và
thuần khiết theo phương pháp Boom trong đó dùng guanidinium thiocyanate
để ức chế DNAse và RNAse, rồi hấp thu DNA lên các hạt diatom. Cuối
cùng DNA được thôi ra từ diatom bằng hai bước 60l và 40l với dung dịch
đệm Tris-EDTA (10mM Tris-HCl ở pH 8,3; 1mM EDTA)
(10-12,14,15)
.
Thực hiện thử nghiệm PCR
Phản ứng khuếch đại được thực hiện với PCR mix mà đoạn mồi (primer)
được sử dụng trong nghiên cứu này là Pt18 và INS2. Ðây là những

oligonucleotid nằm trong trình tự IS6110 và nó sẽ cho ra các sản phẩm PCR
có độ dài là 249bp. Chúng tôi dùng DNA của M. smegmatis 1008 có chứa
một đoạn IS6110 để xác định phản ứng có bị ức chế nhằm loại trừ kết quả
âm tính giả. Sản phẩm PCR từ IS6110 của M. smegmatis sẽ có độ dài 305bp.
Do đó sẽ phân được với kích thước của sản phẩm PCR từ M. tuberculosis
đích. Ðồng thời để loại trừ kết quả dương tính giả do có thể bị nhiễm những
lần thử nghiệm trước, chúng tôi sử dụng PCR mix có chứa dUTP thay cho
dTTP và men Uracil DNA glycosylase (UNG) của hãng Gibco BRL
(10-12,4,5)
.