CƠ CHẾ TÁC DỤNG CỦA KHÁNG SINH ppsx

Khoỏ luận tốt nghiệp Phạm Thị Ngọc

Lời cảm ơn
Với lòng biết ơn sâu sắc tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới thầy
hướng dẫn PGS.TS Cao Văn Thu, người đã hướng tận tình và giúp đỡ tôi
hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Đồng cảm ơn các thầy cô giảng dạy tại
Khoa Công nghệ Sinh học - Đại học Mở Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi trong
suốt quá trình học tập.
Xin cảm ơn tới gia đình, bạn bè và những người đã giúp đỡ và động viên
tôi trong thời gian qua. Với khát vọng thì nhiều nhưng thời gian và kiến thức
của bản thân có hạn nên đề tài khó tránh khỏi những sai sót. Tôi rất mong sự
chỉ bảo của thầy cô và sự góp ý của các bạn. Tôi xin chân thành cảm ơn.
Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2006
Sinh viên
Phạm Thị Ngọc
Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp 02-02
Khoỏ luận tốt nghiệp Phạm Thị Ngọc
Chú giải chữ viết tắt
ADN : axit Deoxyribonucleic
B.cereus : Bacillus cereus ATCC 9946
B.pumilus : Bacillus pumilus ATCC 10441
B.subtilis : Bacillus subtilis ATCC 6633
D : Đường kính vòng vô khuẩn (mm)
Dmhc : Dung môi hữu cơ
E.Coli : Escheriachia Coli ATCC 25922
P.aeruginosa: Pseudomonas Nhiễm sắc thể aeruginosa VM 201
P.mirabilis : Proteus mirabilis BV 108
S(Spiral) : Xoắn lò xo
s : độ lệch chuẩn đã hiệu chỉnh
S.typhi : Salmonella typhi DT220
S.flexneri : Shigella flexneri DT 122

S.lutea : Sarcina lutea ATCC 9314
Sm(smooth) : Nhẵn
S.aureus : Staphylococus aureus ATCC 1228
VSV : Vi sinh vật
ISP : Chương trình Streptomyces Quốc tế
MT : Môi trường
dd : Dung dịch
VK : Vi khuẩn
Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp 02-02
Khoỏ luận tốt nghiệp Phạm Thị Ngọc
Đặt vấn đề
Hiện nay cùng với sự phát triển của công nghệ thông tin thì công nghệ
sinh học cũng được coi là một trong những ngành công nghệ hàng đầu của thế
giới. Trong đó phải kể đến công nghệ sinh học vi sinh vật sản xuất kháng sinh,
vitamin và các hoạt chất ứng dụng trong y học cũng như các lĩnh vực khác
phục vụ đời sống con người đang có những phát triển vượt bậc.
Từ những phương pháp sinh tổng hợp và bán tổng hợp thì công nghệ vi
sinh sinh tổng hợp kháng sinh tiếp tục khẳng định vai trò của mình. Trong số
hơn 10.000 chất kháng sinh được tìm ra thì có khoảng 2.000 chất do thực vật
tạo ra còn khoảng 8.000 chất là kháng sinh do vi sinh vật tổng hợp, trong đó xạ
khuẩn tổng hợp hơn 60%. Các công trình nghiên cứu đã chứng minh
Streptomyces là một chi xạ khuẩn gồm nhiều loài có khả năng sinh tổng hợp
kháng sinh đa dạng về cấu trúc và đặc điểm kháng khuẩn. Đặc biệt một số loài
trong chi này có khả năng tổng hợp các chất chống ung thư và điều trị HIV-
AIDS.
Tuy nhiên có một vấn đề gây lo âu lớn đối với các nhà nghiên cứu, đó là
sự xuất hiện của các vi sinh vật kháng kháng sinh và các chất hóa trị liệu khác.
Do đó các nhà khoa học và các chuyên gia y tế đã không ngừng tìm kiếm
những phương sách để chống lại hiện tượng này.
Tại bộ môn Vi sinh và Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội, chúng tôi tiến

hành phân lập và nghiên cứu về chủng Streptomyces 40.16 với các mục đích sau:
+ Từ chủng Streptomyces đã được phân lập, chọn giống sinh tổng hợp
kháng sinh tốt nhất bằng chọn lọc ngẫu nhiên và đột biến,
+ Nghiên cứu môi trường nuôi cấy và điều kiện lên men tối ưu,
+ Nghiên cứu đặc điểm, hình thái và sinh lý nhằm xác định tên khoa học
của chủng Streptomyces 40.16 theo khóa phân loại ISP,
Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp 02-02
Khoỏ luận tốt nghiệp Phạm Thị Ngọc
+ Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết, tách sản phẩm và các đặc tính
của kháng sinh do xạ khuẩn Streptomyces 40.16 tổng hợp lên.
PHần 1
TổNG QUAN
1.1. VÀI NẫT VỀ KHÁNG SINH [5][6][8][11]
1.1.1.Lịch sử
Năm 1928, nhà vi khuẩn học người Anh Alexander Fleming trong khi
nghiên cứu tụ cầu khuẩn ông nhận thấy xung quanh khuẩn lạc mốc xanh nhiễm
vào hộp peptri nuôi tụ cầu tạo thành vũng vụ khuẩn. Hiện tượng kỡ lạ này đó
được Fleming nghiên cứu và phân lập thuần khiết và xác định được mốc xanh
đó là Penicillium notatum một chủng tạo ra penixilin.
Năm 1941 penixilin được nghiên cứu sản xuất phục vụ điều trị cho
thương binh trong đại chiến thế giới thứ II và kỷ nguyên của chất kháng sinh
được thừa nhận. Cho đến nay người ta đó phỏt hiện và mụ tả khoảng hơn 8000
chất kháng sinh khác nhau có nguồn gốc từ nấm mốc, xạ khuẩn và vi khuẩn.
Thuật ngữ kháng sinh (antibiotic) được Waksman N.A gọi từ 1944 khi ụng
phỏt minh ra streptomycin từ mụi trường nuôi cấy Streptomyces griseus
1.1.2 Định nghĩa
Kháng sinh là những hợp chất hóa học do vi sinh vật tiết ra có tác dụng
ức chế sự phát triển hay tiêu diệt một cách chọn lọc một nhóm vi sinh vật xác
định (vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn, protozoa, virus) hay cả tế bào ung thư ở nồng
độ thấp.

1.1.3.Cơ chế tác dụng của kháng sinh.
Các kháng sinh tác dụng cơ bản qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp
rất khác nhau của tế bào vi sinh vật gây bệnh. Chúng liên kết vào các vị trí
chính xác hay các phân tử đích của tế bào vi sinh vật mà tạo ra các phản ứng
trao đổi chất. Các đích tác dụng đặc trưng cho từng nhóm kháng sinh, tuy nhiên
Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp 02-02
Khoỏ luận tốt nghiệp Phạm Thị Ngọc
trong nhiều trường hợp người ta vẫn chưa biết được chính xác hết. Có 6 mức
tác dụng khác nhau đối với tế bào vi khuẩn hoặc nấm: Tác dụng lên thành tế
bào, tác dụng lên màng nguyên sinh chất, tác dụng lên quá trình tổng hợp
ADN, tác dụng lên quá trình tổng hợp protein, tác dụng lên sự trao đổi chất hô
hấp và cuối cùng là tác dụng lên sự trao đổi chất trung gian.
1.1.4.Phân loại kháng sinh
Phân loại kháng sinh có thể theo nhiều cách, nhưng theo cấu trúc hóa học
là khoa học nhất.Bảng 1 giới thiệu một số nhóm kháng sinh quan trọng.
Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp 02-02
Khoỏ luận tốt nghiệp Phạm Thị Ngọc
Bảng 1: Các chất kháng sinh được phân loại theo cấu trúc hoá học
Phân loại Nhóm kháng sinh Kháng sinh cụ thể
1. Các kháng sinh có chứa
đường trong phân tử
Aminoglycosid
Orrthsomycin
N-glycosid
C-glycosid
Glycolipid
Streptomycin,
neomycin
Everninomycin
Streptothricin

Vancomycin
Moenomycin
2. kháng sinh chứa vũng
lacton lớn (macrocyclic
lacton)
Kháng sinh macrolid
Kháng sinh polyen
Ansamycin
Macrotetrolid
Erythromycin
Candicidin, nistatin
Rifamicin
Tetranactin
3. Quinon và các kháng
sinh cựng họ
Anthracyclin
Naphthoquinon
Benzoquinon
Cỏc tetracyclin
Adriamycin
Actinorhodin
Mitomycin
Tetracyclin,
teramycin
4. Các kháng sinh
aminoacid và peptid
Dẫn xuất aminoacid
Khỏng sinh betalactam
Khỏng sinh peptid
Chromopeptid

Depsipeptid
Cycloserin
Penicilin,
Cephalosporin
Bacitraxin,
polymycin
Actinomycin
Valinomycin
5. Khỏng sinh dị vũng
chứa nitơ
Cỏc Khỏng sinh nucleosid Polyoxin
6.Khỏng sinh dị vũng
chứa oxy
Cỏc Khỏng sinh polyether Monensin
7. Các Kháng sinh nhân
thơm
Dẫn xuất benzen, các ête thơm Cloramfenicol
Novobiocin
1.1.5 Khỏi niệm về khỏng khỏng sinh
Kháng kháng sinh là hiện tượng VSV mất đi tính nhậy cảm ban đầu của
nó trong một thời gian vĩnh viễn với tác dụng của kháng sinh hay hoá trị liệu.
Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp 02-02
Kho lun tt nghip Phm Th Ngc
Khỏng sinh ch yu mt tỏc dng theo 3 c ch: Thay i v trớ ớch,
gim tớnh thm ca thuc hoc do tỏc ng ca enzym lm mt hot tnh ca
khng sinh. Tớnh khỏng khỏng sinh c di truyn cho cỏc th h tip theo. Bn
cht di truyn tớnh khỏng thuc c khng nh nh tỏc nhõn gõy t bin v
plasmid. Cỏc quỏ trỡnh ny lan truyn tớnh khỏng thuc ngoi nhim sc th xy
ra mc phõn t, ti np nh bacteriophage v bin np vo vi khun v
tip hp.

1.1.6 S mụ t quy trỡnh sn xut khỏng sinh
T i n h c h ế
G i ố n g t r u y ề n ủ t r o n g p h ò n g t h í n g h i ệ m
S i n h k h ố i
S i n h k h ố i k h ô
D ị c h
c h i ế t s i n h k h ố i
S ả n p h ẩ m
T i n h c h ế
B ì n h n h â n g i ố n g C 1 , C 2 , C 3
B ì n h l ê n m e n t ạ o k h á n g s i n h
T i n h c h ế
D ị c h l ọ c
D ị c h c h i ế t K S
đ ậ m đ ặ c
S ả n p h ẩ m đ ã k i ể m
n g h i ệ m
n g h i ệ m
S
ả n
p h ẩ m đ ó n g g ó i
S ả n p h ẩ m
T i n h c h ế
L ọ c
D ị c h s a u l ê n m e n
Khoa Cng Ngh Sinh Hc Lp 02-02
Khoỏ luận tốt nghiệp Phạm Thị Ngọc
Hình 1. Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh
Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp 02-02
Khoỏ luận tốt nghiệp Phạm Thị Ngọc

1.1.7 Ứng dụng của khỏng sinh
Kháng sinh được sử dụng trong y học từ 1940 (penixilin) sau đó một loạt
các chất kháng sinh khác từ xạ khuẩn được phát minh ra và nhanh chóng được
sử dụng để diều trị bệnh nhiễm trùng hiểm nghèo.
Bảng 2 :Một vài khỏng sinh quan trọng cú giỏ trị kinh tế cao
Tờn khỏng sinh Vi sinh vật sản xuất khỏng sinh Hoạt phổ
Penicilin G Penicillium chrysogenum Khỏng khuẩn
Streptomycin S. griseus Khỏng lao
Tetracyclin S. aureofaciens Khỏng khuẩn
Chloramfenicol S. venezuela Khỏng khuẩn
Oxytetracyclin Str. Rimosus Khỏng khuẩn
Cephalosporin C Cephalosporium acremonium Khỏng khuẩn
Actinomycin D S. antibioticus Kháng ung thư
Bleomycin S. verticillum Kháng ung thư
Daunorubicin S. peucetius Kháng ung thư
Mitomycin C Streptomyces sp Kháng ung thư
Kanamycin S. kanamyceticus Khỏng khuẩn
Nistatin S. noursei Khỏng nấm
Fumagillin Aspergillus fumigatus Khỏng protozoa
Griseofulvin Penicillium griseofulvum Khỏng nấm
Nisin Streptococcus sp. Bảo quản thực phẩm
Natamycin Streptococcus sp. Bảo quản thực phẩm
Rifamycin Nocardia mediteranei. Khỏng lao
Polymyxin B Bacillus polymyxa Khỏng khuẩn
Gentamycin Micromonospora purpurea. Khỏng khuẩn
Khỏng sinh cũn được sử dụng trong thú y để điều trị các bệnh nhiễm
trùng của động vật như viêm phổi ở trâu bũ, tụ huyết trựng ở lợn, v.v…Trong
chăn nuôi kháng sinh được sử dụng làm chất bổ sung vào thức ăn nhằm kích
Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp 02-02
Khoỏ luận tốt nghiệp Phạm Thị Ngọc

thích tăng trọng. Rất nhiều chẩt kháng sinh được ứng dụng với mục đích này
(các kháng sinh nhóm tetracyclin, monenzin,…).
Khỏng sinh cũn được ứng dụng trong nông nghiệp trước hết để tiêu diệt
các nấm và vi khuẩn gây bệnh cho cây trồng như các bệnh khô vằn, vàng lụi ở
lúa (validamyin, blasticidin S, kasugamyxin, v.v…), bệnh thối cổ rễ ở các cây
có củ,v.v…Kháng sinh cũn kớch thớch nẩy mầm của hạt. Thường ngâm hạt
trong dung dịch kháng sinh trước khi gieo vừa để kích thích nẩy mầm, vừa tiêu
diệt mầm bệnh trong đất.
Khỏng sinh cũn được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm để bảo quản
thực phẩm đóng hộp.Nếu dùng kháng sinh thực phẩm đóng hộp sẽ bảo quản
được lâu hơn, khử trùng ở nhiệt độ thấp hơn nên chất lượng thực phẩm giữ
được tốt hơn(ví dụ nizin).
1.2.ĐẠI CƯƠNG VỀ XẠ KHUẨN [1][9][11][14][15]
1.2.1 Đặc điểm của xạ khuẩn
* Đặc điểm chung của xạ khuẩn: (Actinomycetes) là một nhóm vi khuẩn
thật (Eubacteria) có cấu tạo sợi như nấm (nấm tia) nhưng lại có khích thước và
cấu tạo tế bào gần giống vi khuẩn, chúng phân bố rộng rãi trong tự nhiên: trong
đất, nước và trong các chất hữu cơ.
- Những đặc điểm đặc trưng của xạ khuẩn :
+ Kích thước của xạ khuẩn nhỏ bé tương tự như vi kích thước vi khuẩn
+ Nhân của xạ khuẩn là nhân không điển hình
+ Màng tế bào xạ khuẩn khụng chứa xenlulo và kitin
+ Sự phân chia tế bào của xạ khuẩn theo kiểu của vi khuẩn
+ Xạ khuẩn không có giới tớnh
- Tuy vậy xạ khuẩn lại có hình thái, cấu tạo sợi, phát triển bằng phân
nháh thành những sợi nhỏ, dài gọi là khuẩn ti (hipha), mỗi khuẩn ti do một tế
bào hình thành, tập hợp của các khuẩn ti này gọi là hệ khuẩn ti.
* Đặc điểm cấu tạo tế bào xạ khuẩn :
Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp 02-02
Khoỏ luận tốt nghiệp Phạm Thị Ngọc

- Đường kính khuẩn ti xạ khuẩn khoảng 0,2 - 3,0
μ
m
- Màu sắc của khuẩn ti khí sinh rất phong phú: màu trắng, vàng, đỏ, lục,
tía, nâu, đen…
- Thành tế bào dày từ 7,5-10,0 nm, không có xenlulo và kitin
- Phân chia tế bào theo kiểu phân bào vụ tớnh.
* Phân loại:
Actinomycetales
Actinoplanaceae Actinomycetaceae Streptomycetaceae
Nocardia Streptomyces Micromonospora
Hình 2: Sơ bộ phân loại xạ khuẩn
1.2.2.Đặc điểm hình thái và sinh lý của xạ khuẩn chi Streptomyces
* Đặc điểm hỡnh thỏi:
- Khuẩn lạc tạo thành từng cụm, bề mặt khụ rỏp, xự xỡ, dạng phấn ,
khụng trong suốt, cú cỏc nếp toả ra theo hỡnh phúng xạ.
- Khuẩn lạc có chân khá vững chắc, khó tách ra khỏi môi trường nuôi
cấy.
- Khẩn ty cơ chất tiết ra môi trường một số loại sắc tố, có sắc tố hoà tan
trong nước, có sắc tố chỉ hoà tan trong dung môi hữu cơ.
+ Khuẩn ty cơ chất mọc trong môi trường nuôi cấy, không phân cách
trong suốt quá trình phát triển
Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp 02-02
Khoỏ luận tốt nghiệp Phạm Thị Ngọc
- Khuẩn ty khí sinh: khuẩn ty cơ chất phát triển một thời gian dài trong
không khí thành những khuẩn ty khí sinh và có đường kính từ 1,0-1,4
μ
m.
+ Chuỗi bào tử: được hình thành từ khuẩn ty ký sinh, có nhiều hình dạng
khác nhau: thẳng, móc câuu, xoắn, uốn cong.

+ Bào tử trần: được hỡnh thành do sự phân cắt của sợi bào tử, là cơ quan
sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn. Bào tử trần có thể hình cầu, hình elipsoid, hình
que, hình trụ. Các bào tử tập hợp với nhau thành chuỗi 3- 50 bào tử hoặc nhiều
hơn. Bề mặt của bào tử có thể có dạng trơn nhẵn (sm), xự xỡ (wa), cú gai (sp),
hoặc cú túc (ha).
* Đặc điểm sinh lý:
- Streptomyces là vi sinh vật dị dưỡng, có tính oxy hoá cao. Để phát triển
chúng phân giải các hydrat cacbon làm nguồn thức ăn cung cấp vật chất và
nguồn năng lượng đồng thời thuỷ phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh
bột. Chúng cũng có thể khử nitrat thành nitrit.
- Streptomyces là vi sinh vật có thành tế bào kiểu CW1 có chứa L-DAP
(diaminopimelat) và glycin.
- Streptomyces là loài xạ khuẩn hụ hấp hiếu khí. Nhiệt độ tối ưu của
chúng thường là 25-30
0
C, một vài loài có thể mọc ở nhiệt độ cao hơn, pH tối ưu
thường từ 6,8-7,5.
- Khả năng tạo sắc tố của Streptomyces: sắc tố tạo thành từ Streptomyces
được chia thành bốn loại: sắc tố hoà tan, sắc tố khuẩn ty cơ chất, sắc tố
melanoid, sắc tố khuẩn lạc.
1.2.3.Phân loại Streptomyces
Chi Streptomyces bao gồm một số lượng lớn các xạ khuẩn có khả năng
sinh tổng hợp ra các kháng sinh được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác
nhau .Việc phân loại và xác định tờn xạ khuẩn là rất quan trọng. Có rất nhiều
khoỏ phõn loại Streptomyces khác nhau: phân loại theo Krasillkow, Waksman,
Gauze, Shirling & Gottlieb, ngoài ra cũn cú thể phân loại theo kiểu gen. Hội
Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp 02-02
Khoỏ luận tốt nghiệp Phạm Thị Ngọc
nghị "Vi sinh vật thế giới lần X" (được tổ chức tại Mexico vào năm 1970) chọn
khoá phân loại của E.B.Shirling & Gottlieb làm khoá phân loại chính để phân

loại chi Streptomyces và đặt tên quốc tế là International Streptomyces Project
(ISP)
Khoá phân loại dựa vào các đặc điểm:
- Đặc điểm hình thái học của xạ khuẩn :
+ Màu sắc của khuẩn ty cơ chất, khuẩn ty khí sinh,
+ Hình dạng chuỗi bào tử,
+ Bề mặt bào tử.
- Đặc điểm sinh lí học:
+ Khả năng tạo sắc tố hoà tan,
+ Khả năng tạo sắc tố melanoid,
+ Khả năng sử dụng các nguồn đường của xạ khuẩn.
1.2.4 Khả năng sinh tổng hợp khỏng sinh của Streptomyces
Một số khỏ lớn khỏng sinh do các loài Streptomyces sinh tổng hợp, rất đa
dạng, có trong hầu hết các nhóm phân loại kháng sinh.
1.3 CẢI TẠO GIỐNG VI SINH VẬT [1][5][8][10][11][15]
1.3.1.Mục đích
Trong thực tế không thể phân lập được từ tự nhiên một chủng VSV có
khả năng tạo chất kháng sinh mong muốn với hàm lượng đủ để thỏa mãn yêu
cầu của sản xuất công nghiệp. Các VSV phân lập từ cơ chất tự nhiên thường có
hoạt tính thấp đồng thời trong quá trình nuôi cấy, hoạt tính của chúng thường
giảm dần. Vì vậy việc cải tạo giống VSV bằng nhiều biện pháp khác nhau
nhằm thu được những chủng có hoạt tính cao, ổn định là một trong những điều
kiện quan trọng và cần thiết ở quy mô phòng thí nghiệm trước khi đưa ra công
nghiệp hóa.
Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp 02-02
Khoỏ luận tốt nghiệp Phạm Thị Ngọc
1.3.2.Phân lập giống xạ khuẩn
Người ta thường lấy mẫu từ các nguồn cơ chất khác nhau: đất ruộng,
bùn, nước cống… để phân lập xạ khuẩn sinh kháng sinh. Từ các mẫu trên đem
phân lập khiết những xạ khuẩn sinh kháng sinh bằng các phương pháp đặc

trưng và trên các môi trường chọn lọc.
Các phương pháp phân lập giống xạ khuẩn: phương pháp cấy dịch chiết
trên bề mặt thạch, phương pháp cấy đất trực tiếp trên bề mặt thạch đã chứa sẵn
VSV kiểm định, phương pháp làm giàu đất, phương pháp thêm kháng sinh vào
môi trường phân lập, phân lập VSV sinh kháng sinh chống ung thư.
1.3.3. Các phương pháp cải tạo giống
A. Phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên:
Chọn lọc tự nhiên hay còn gọi là sàng lọc ngẫu nhiên là tuyển chọn lấy
những dạng chủng có những đặc tính sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất, xuất
hiện ngẫu nhiên do sự tác động của các điều kiện ngoại cảnh.
B.Đột biến nhân tạo
Đột biến nhân tạo là quá trình xử lý tế bào bằng các tác nhân gây đột
biến (lý, hóa, sinh học…). Các tác nhân này khi sử dụng với liều lượng thích
hợp sẽ giết chết hầu hết các VSV, những cá thể sống xót sẽ có sự biến đổi ở
NST, gây ra đột biến gen liên quan đến cấu trúc gen làm thay đổi 1 hay nhiều
nucleotit trong trình tự mã hóa gọi là đột biến điểm. Đây là loại đột biến có ý
nghĩa trong công nghiệp kháng sinh, làm thay đổi tính trạng cũng có thể dẫn
đến làm mất khả năng tạo kháng sinh (đột biến âm tính), hay tăng cường.
*ánh sáng UV khả năng đâm xuyên kém nhưng với những tế bào VSV có kích
thước nhỏ (0,3-3
μ
m) thì nó có thể xuyên thấu tới nhân. Vì vậy được dùng phố
biến trong đột biến cải tạo giống.
*Cơ chế: Tia UV tác dụng lên ADN và mạnh nhất ở vùng 260nm gây
dime hóa thymin (do làm đứt các liên kết hyđro trong mạch kép ADN của tế
bào VSV). Mà thymin gần nhau liên kết cộng hóa trị với nhau ở C
5
và C
6
. Hậu

Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp 02-02
Khoỏ luận tốt nghiệp Phạm Thị Ngọc
quả là sao chép bị sai lầm vì ADN polymeraza dễ lắp 1 nucleotit không chính
xác vào vị trí trên. Đồng thời trên sợi AND cũng xuất hiện một dimepyrimidin
khác gọi là quang sản phẩm 6-4. ở đây C
6
của 5’ (thymin hoặc cytozin) được
liên kết với C
4
của 3’ (thường là Cytozin). Các sản phẩm này là nguyên nhân
chủ yếu của đột biến gây nên bởi ánh sáng UV.
*Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả gây chết vầ tần số phát sinh đột
biến:
-Liều lượng chiếu: Được đặc trưng bởi 3 yếu tố là thời gian chiếu,
khoảng cách chiếu, độ pha loãng bào tử. Thực nghiệm cho thấy những đột biến
dương thường xuất hiện ở những liều lượng chiếu có độ sống sót bào tử từ 0,1-
1%, còn đột biến âm thường xuất hiện ở liều lượng chiếu cao hơn.
-ánh sáng thường: Sau khi đột biến bằng tia tử ngoại, nếu đem chiếu ánh
sáng thường (bước sóng
λ
=320-480nm) trở lại thì sẽ có khoảng 50-80% tế bào
được phục hồi do tác dụng của men photolyase. Hiện tượng này gọi là quang
phục hoạt.
Ngoài ra, các yếu tố nhiệt độ, pH, môi trường nuôi cấy, trạng thái sinh lí
của vi sinh vật cũng ảnh hưởng đến hiệu quả đột biến của ánh sáng UV.
1.3.4. Bảo quản giống xạ khuẩn.
Các giống vi sinh vật rất rễ bị thoái hóa, nhầm lẫn, mất. Vì vậy việc bảo
quản giữ giống vi sinh vật là rất quan trọng không chỉ ở các trung tâm giữ
giống quốc gia mà ngay cả ở phòng thí nghiệm cũng rất cần thiết.
Nhiệm vụ của công tác giữ giống vi sinh vật là thực hiện các thao tác kĩ

thuật cần thiết để giữ cho giống VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di
truyền ổn định và không bị tạp nhiễm bởi các VSV khác.
Có rất nhiều phương pháp giữ giống VSV khác nhau. Tùy vào loại VSV
để chúng ta chọn phương pháp giữ giống cho phù hợp. Đối với giữ giống xạ
khuẩn trong phòng thí nghiệm có thể sử dụng phương pháp giữ giống trên môi
trường thạch nghiêng để trong tủ lạnh 2
0
C.
Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp 02-02
Khoỏ luận tốt nghiệp Phạm Thị Ngọc
1.4. Dinh dưỡng và môi trường nuôi cấy [5]
Trong quá trình sống, tế bào VSV luôn luôn phải trao đổi chất với môi
trường xung quanh. Tế bào VSV tuy rất nhỏ nhưng vì hấp thu các chất dinh
dưỡng và thải các sản phẩm chất qua toàn bộ bề mặt, cho nên cường độ trao đổi
chất của chúng là rất lớn. Các chất dinh dưỡng qua màng vào tế bào và được
chuyển hóa thành những chất riêng biệt cho việc xây dựng tế bào. Nhờ quá
trình đồng hóa và dị hóa các tế bào mới có thể phát triển, sinh trưởng, đồng thời
tạo ra các sản phẩm trao đổi chất.
Những VSV dùng trong công nghiệp vi sinh kháng sinh đều là các VSV
dị dưỡng. Để phát triển VSV cần một lượng đầy đủ các nguyên tố C, H, O, N,
P… và một trong những nguyên tố vi lượng là Mn, Mo, Zn, Cu… Môi
trường dinh dưỡng phải chứa tất cả các nguyên tố cần thiết cho sinh trưởng và
tạo thành sản phẩm của VSV. Thông thường các môi trường nuôi cấy sử dụng
nước máy thì không cần phải bổ sung các nguyên tố vi lượng vì các chất này đã
có đủ trong các cơ chất dinh dưỡng ở dạng tạp chất. Trong quá trình lên men
người ta có thể thêm một số nguyên tố vi lượng đặc biệt hoặc tiền chất là chất
đặc hiệu cho sản phẩm tạo thành như tiền chất axít phenoxyacetic trong quá
trình lên men sản xuất penicillin V. ở đây cũng cần lưu ý, một môi trường nuôi
cấy thuận lợi cho sự phát triển của một VSV không nhất thiết sẽ là môi trường
đảm bảo cho sản xuất sản phẩm trao đổi chất tốt nhất. Môi trường lên men tốt

nhất phải là môi trường đảm bảo cho sản xuất tốt nhất với hiệu suất cao trong
thời gian ngắn và chi phí thấp với chủng VSV cho trước.
Thành phần môi trường và chế độ tối ưu hóa được xác định theo hai
cách: tối ưu hóa kinh điển và sử dụng phương pháp toán học quy hoạch thực
nghiệm.
Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp 02-02
Khoỏ luận tốt nghiệp Phạm Thị Ngọc
1.5. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh [2][5][8]
1.5.1. Bản chất của quá trình lên men
Lên men thực chất là phản ứng ôxi hóa khử sinh học xảy ra nhờ xúc tác
của các enzim do VSV tự tổng hợp với mục đích cung cấp năng lượng và tạo ra
các sản phẩm trao đổi chất trong dịch lên men.
1.5.2. Giống vi sinh vật
Trong lên men công nghiệp, kỹ thuật chỉ là công cụ tác động và điều
khiển lên quá trình sinh học còn giống vẫn là khâu quan trọng, quyết định giá
trị kinh tế của quá trình sản xuất. Giống VSV dùng trong quá trình lên men
phải là các tế bào sinh dưỡng đang ở giai đoạn phát triển mạnh và có khả năng
đồng hóa vật chất cao nhất. Do đó trước khi lên men phải có giai đoạn tạo
giống. Giống VSV được tạo ra qua các cấp nhân giống kế tiếp nhau, trên máy
lắc tròn hoặc bình nón, rồi đến bình giống.
1.5.3. Các phương pháp lên men
* Phương pháp lên men bề mặt:
Lên men bề mặt là quá trình nuôi cấy VSV trên bề mặt môi trường rắn,
đặc hay lỏng. VSV hấp thụ các chất dinh dưỡng của môi trường và sử dụng ôxi
không khí để hô hấp trên bề mặt môi trường dinh dưỡng. Vì vậy yêu cầu của
công nghệ lên men bề mặt là bề mặt môi trường phải đủ rộng, lớp môi trường
không quá sâu (5-10cm), đồng thời phải giữ độ ẩm môi trường khoảng 60% (có
trường hợp 90- 100%) để tránh khô bề mặt môi trường.
Lên men bề mặt có ưu điểm đơn giản, dễ thực hiện, đầu tư ban đầu thấp.
Nhưng có nhược điểm là đòi hỏi mặt bằng lớn, hiệu xuất sử dụng thường thấp,

khó cơ giới hóa và tự động hóa. Chính vì lý do đó mà ngày nay, công nghiệp
kháng sinh không áp dụng lên men bề mặt trong sản xuất mà chỉ áp dụng trong
các phòng thí nghiệm để chọn giống.
Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp 02-02
Khoỏ luận tốt nghiệp Phạm Thị Ngọc
* Phương pháp lên men chìm:
Phương pháp lên men chìm là kiểu lên men mà VSV phát triển trong
không gian 3 chiều của môi trường lỏng
Trước khi lên men phải có giai đoạn tạo giống
- Giống cấp 1: Nuôi cấy trong bình nón trên máy lắc (100ml/500ml),
- Giống cấp 2: Nuôi cấy trong bình giống 80l,
- Giống cấp 3: Nuôi cấy trong bình 1-5m
3
.
Tỷ lệ giống trong môi trường là 1-10%. Tỷ lệ giống phụ thuộc vào quy
mô của bình lên men.
Quá trình lên men có thể làm thay đổi các điều kiện ban đầu của môi
trường: thay đổi pH, nồng độ các thành phần trong môi trường, các sản phẩm
trao đổi chất, tạo bọt trên bề mặt môi trường. Để đảm bảo những điều kiện tối
ưu cho sự phát triển của VSV trong quá trình lên men người ta đã đưa ra một số
biện pháp như: cho thêm các chất phá bọt (mỡ cá voi, dầu thực vật, chất điều
chỉnh pH hay dùng hệ đệm để ổn định pH). Cũng có thể lấy mẫu dịch lên men
phân tích để đánh giá các tham số và có sự điều chỉnh (nếu cần) quá trình lên
men .
- ưu điểm của phương pháp lên men chìm là:
+ Sử dụng môi trường dinh dưỡng tối ưu, đáp ứng được nhu cầu sinh lý
của VSV,
+ Hệ số sử dụng không gian cao (3 chiều), hiệu suất lên men cao,
+ Các thiết bị dễ cơ giới hóa, tự động hóa, tiết kiệm mặt bằng và tốn ít
nhân công.

- Nhược điểm:
Đòi hỏi phải có trang thiết bị chuyên dùng (thiết bị chịu áp lực, điều kiện
vô trùng tuyệt đối) do đó chi phí đầu tư lớn.
Lên men chìm chia thành 4 kiểu chính:
- Lên men gián đoạn (lên men mẻ):
Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp 02-02
Khoỏ luận tốt nghiệp Phạm Thị Ngọc
Quá trình lên men gián đoạn được xem như một hệ thống kín. Trong suốt
thời gian lên men không tác động hay bổ sung gì thêm vào môi trường lên men,
trừ việc cung cấp ôxi (dưới dạng không khí nén), chất phá bọt (nếu cần), điều
chỉnh pH. Trong quá trình lên men VSV phát triển qua 4 giai đoạn: Pha tiềm
tàng, pha log (lũy thừa), pha dừng, pha suy tàn ( hình 3).

lnx
Pha dừng
Pha log Pha suy tàn
Pha
tiềm
tàng
t(h)
Hình 3: Đường cong biểu diễn các giai đoạn phát triển của VSV trong MT
lỏng.Với:
x: sinh khối khô VSV trong dịch lên men
t: thời gian lên men.
Trong công nghiệp, quá trình lên men kết thúc phụ thuộc vào việc sinh
tổng hợp hoạt chất dừng lại ở pha nào trong chu kì sinh trưởng của VSV hoặc
khi việc sinh tổng hợp hoạt chất đã bị chậm lại, nếu tiếp tục lên men sẽ không
mang lại hiệu quả kinh tế.
- Lên men có bổ sung:
Lên men có bổ sung là biến tướng phát triển của lên men mẻ đống kín.

Trong khi lên men, do nồng độ cao của một số chất (glucoza, các hợp chất
nitơ…) ức chế việc tạo ra sản phẩm trao đổi chất thứ cấp. Bởi vậy khi bắt đầu
Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp 02-02
Khoỏ luận tốt nghiệp Phạm Thị Ngọc
lên men các thành phần đó được đưa vào với một nồng độ thấp và được bổ
sung vào hệ thống trong quá trình lên men.
- Lên men liên tục: quá trình lên men môi trường dinh dưỡng được bổ
sung liên tục vào bình lên men, đồng thời lúc đó lấy ra đồng thể tích dịch lên
men. Quá trình này xem như một hệ mở.
- Lên men bán liên tục: Trong quá trình lên men việc bổ sung thêm môi
trường dinh dưỡng và rút bớt dịch lên men không xảy ra liên tục mà
định kỳ sau những khoảng thời gian xác định.
1.6. Tách chiết và tinh chế [4][7]
Trong hầu hết các trường hợp thì sản phẩm đích (kháng sinh) chỉ là một
lượng rất nhỏ trong tổng số dịch lên men (0,2-30g/l). Kháng sinh là sản phẩm
trao đổi chất thứ cấp, do đó kết thúc quá trình lên men kháng sinh có thể nằm
trong sinh khối (ví dụ: gramicidin, nystatin) hoặc trong dịch lọc (ví dụ:
penixilin, streptomycin) tùy thuộc vào đặc điểm của loài. Vì vậy phải chiết tách
để lấy kháng sinh. Việc lựa chọn phương pháp phụ thuộc vào bản chất của
kháng sinh.
Một số phương pháp tách chiết hay được sử dụng:
- Phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ,
- Phương pháp kết tủa,
- Phương pháp dùng nhựa trao đổi ion.
Dù lựa chọn phương pháp nào thì mục đích cuối cùng vẫn là thu được
một sản phẩm kháng sinh có độ tinh khiết cao. Trong công nghiệp sản xuất
kháng sinh thường áp dụng một số phương pháp chiết tách và tinh chế như: lọc,
chiết, hấp thụ và sắc ký.
1.6.1. Chiết xuất
Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp 02-02

Khoỏ luận tốt nghiệp Phạm Thị Ngọc
* Định nghĩa: Chiết là phương pháp dùng dung môi (đơn hay hỗn hợp)
không đồng tan để tách lấy một chất hay một nhóm chất từ hỗn hợp cần nghiên
cứu.
* Nguyên tắc: Dựa vào sự phân bố chất tan giữa hai pha không đồng tan
với nhau.
* Các phương pháp chiết lỏng – lỏng:
- Chiết đơn (chiết 1 lần): Thường cho hiệu suất thấp nhưng đơn giản, tốn
ít thời gian.
- Chiết lặp (chiết nhiều lần): Hiệu suất chiết cao tuy nhiên tốn thời gian
và công sức.
- Chiết ngược dòng cho kết quả tốt hơn.
1.6.2. Tách sản phẩm
* Định nghĩa: Là một nhóm các phương pháp hóa học, vật lý và hóa lý
nhằm đi từ một hỗn hợp phức tạp đến những hỗn hợp đơn giản và từ hỗn hợp
đơn giản tách riêng từng chất.
* Các phương pháp tách hỗn hợp đồng nhất hay được dùng:
- Phương pháp chia cắt pha: Là phương pháp đi từ hỗn hợp đồng nhất
(một pha) tách thành hỗn hợp không đồng nhất (hai pha).
- Phương pháp chuyển pha: Trong nhóm này có các phương pháp như là:
chiết, thẩm thấu, các phương pháp sắc ký.
* Sắc ký:
Là một nhóm các phương pháp hóa lý dùng để tách các thành phần của
hỗn hợp. Sự tách sắc kí được dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất
khác nhau vào hai pha luôn tiếp xúc và không hòa lẫn vào nhau: một pha tĩnh
và một pha động.
Các phương pháp sắc ký:
- Sắc ký lớp mỏng (SKLM):
Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp 02-02
Khoỏ luận tốt nghiệp Phạm Thị Ngọc

Nguyên tắc: Là phương pháp tách các chất dựa trên khả năng bị hấp phụ
(là chủ yếu) khác nhau của chúng trên bề mặt một chất rắn (chất hấp phụ), ở
đây pha tĩnh là chất rắn, pha động là dung môi. Chọn dung môi và chất hấp phụ
tùy thuộc vào chất cần xác định, nếu chất cần xác định không phân cực thì chọn
chất hấp phụ có hoạt tính cao (hấp phụ mạnh) và dung môi là không hay ít phân
cực. Chất phân cực ta chọn ngược lại.
- Sắc ký trao đổi ion:
Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng trao đổi thuận nghịch giữa các ion trong
dung dịch chất nghiên cứu với các ion trong một chất gọi chung là nhựa ionit.
Nhựa có khả năng trao đổi cation gọi là cationit, nhựa có khả năng trao đổi
anion gọi là anionit. Quá trình trao đổi tuân theo định luật tác dụng khối lượng.
- Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC):
Nguyên tắc: Là phương pháp tách xác định các chất dựa trên sự phân bố
khác nhau của các chất giữa hai pha. Pha tĩnh là chất lỏng bao bọc tạo thành
tấm phim mỏng trên bề mặt một chất rắn trơ (gọi là chất mang có cỡ hạt nhỏ 10
mm) được nhồi vào cột, pha động là dung môi thấm qua toàn bộ bề mặt pha
tĩnh.
* Cô đặc: Sản phẩm trao đổi chất ở nồng độ thấp cần phải cô lại trong
chân không trước khi kết tinh.
* Kết tinh: Kết tinh ở nhiệt độ thấp trên cơ sở độ tan của các chất thường
giảm theo nhiệt độ.
* Sấy khô: Có nhiều phương pháp sấy trên cơ sở dùng nhiệt độ cao, độ
thoáng khí hoặc hút.
* Nghiền vỡ tế bào VSV: Trường hợp kháng sinh là sản phẩm trao đổi
chất nội bào, để thu được kháng sinh cần phá vỡ tế bào VSV, có thể dùng
phương pháp vật lý, hóa học hoặc sinh học.
1.7. Một số nghiên cứu mới trong sản xuất kháng sinh [12][13][16][17].
1.7.1. Kháng sinh Boromycin chống HIV từ xạ khuẩn
Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp 02-02
Khoỏ luận tốt nghiệp Phạm Thị Ngọc

Boromycin là kháng sinh thuộc nhóm polyête-macrolit được STH từ
Streptomyces sp. A-3376, là kháng sinh chống HIV. Boromycin có khả năng
ngăn chặn sự phát triển HIV ở giai đoạn cuối và có thể ngăn cản quá trình sao
chép của phân tử HIV trong tiến trình trưởng thành.
Trong lên men Streptomyces sp. A-3376 tạo ra một chất ký hiệu là TMC-
25, sau khi nghiên cứu đã chứng minh được TMC-25 có cấu trúc giống hệt của
boromycin, kháng sinh có chứa một nguyên tử Bo. Lên men STH TMC-25
được tiến hành trên máy lắc ở 27
0
C trong 5 ngày.
Dịch lên men thu được lọc loại bỏ sinh khối sau đó chiết bằng n-butanol,
dịch chiết được tinh chế bởi phân đoạn dung môi cho ta kháng sinh ở dạng tủa
thô, tiếp tục tinh chế nhờ sắc ký cột đảo pha trên silicagel ODS và Sephadex
LH-20. Sau đó sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao để thu được TMC-25 dưới
dạng bột vô định hình màu trắng. Cứ 24,5 lít dịch lên men đã loại bỏ sinh khối
sau quá trình chiết xuất và tinh chế sẽ thu được 24,5mg TMC-25.
1.7.2. Tinh chế và đặc trưng của serine proteinaza thuỷ phân Keratin từ
Streptomyces albidoflavus.
Streptomyces albidoflavus là một chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng
hợp enzym serine proteinaza có tác dụng thuỷ phân keratin.
Streptomyces albidoflavus khi nuôi cấy ở môi trường chứa thịt- da có thể
sinh ít nhất 6 loại proteinaza ngoại bào. Dịch lên men chủng Streptomyces
albidoflavus được ly tâm, lọc sơ bộ để loại bỏ sinh khối, sau đó được lọc qua
màng lọc có kích thước 0,45µm( Milipore Corp., Bedford, Mass), rồi được cô
đặc 10 lần bằng máy cất đặc chủng. Khi so sánh độ nhạy để ức chế enzym, các
đặc trưng cơ chất với Streptomyces griseus proteinaza B (SGPB) đã cho thấy
đây là một enzym mới được đặt tên là SAKaza, khá tương đồng với SGPB.
Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp 02-02
Khoỏ luận tốt nghiệp Phạm Thị Ngọc
1.7.3. Sản xuất 8-Demethylgeldanamycin và 4,5-Epoxy-8-

demethylgeldanamycin có tác dụng điều trị ung thư vú từ Streptomyces
hygroscopicus
Geldanamycin thuộc họ kháng sinh benzoquinon gần đây đã được sự thu
hút bởi những đặc tính dược lý học của nó như: ức chế tạo thành tiểu cầu, ức
chế enzym sao mã ngược, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, kháng ung
thư… với nồng độ ức chế tối thiểu (IC
50
) là 13nM khi tiến hành test với dòng tế
bào NCI. Đặc tính kháng ung thư của geldanamycin do ức chế mạnh ATP, làm
bất hoạt sinh tổng hợp protein của tế bào gây ung thư. Các nghiên cứu cũng cho
thấy sử dụng geldanamycin để điều trị ung thư sẽ tăng tính hiệu quả của phư-
ơng pháp điều trị đồng thời, ví dụ: xạ trị. Hiện nay, gendanamycin đang ở trong
giai đoạn 2 giám sát lâm sàng.
Gendanamycin được sinh tổng hợp bởi Streptomyces hygroscopicus
var.geldanus, trong quá trình sinh tổng hợp còn tạo ra 4,5-Epoxy-8-demethyl
geldanamycin, được tinh chế từ dịch lên men bằng sắc ký cột và sắc ký lỏng
hiệu năng cao.
Streptomyces hygroscopicus var.geldanus được lên men trên môi trường
YPD, pH được điều chỉnh ở 6,5 bằng H
2
SO
4
2,5N hoặc NaOH 2,5N, cấp khí
bằng hỗn hợp khí chứa oxy hoà tan là 30%.
Tinh chế hai thành phần trên bằng phơng pháp sắc ký cột HP20, dịch rửa
giải là MeOH.
Gendanamycin và 4,5-Epoxy-8-demethylgeldanamycin là những kháng
sinh có khả năng ứng dụng cao đối với mô hình bệnh tật hiện nay được sinh
tổng hợp từ Streptomyces sp.
1.7.4. Nghiên cứu hoạt chất có tác dụng ức chế enzym Lipoxygenase từ

Streptomyces sp.
Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp 02-02
Khoỏ luận tốt nghiệp Phạm Thị Ngọc
Nhóm các hoạt chất có tác dụng ức chế enzym Lipoxygenase gồm
tetrapetalone B (2, C
28
H
35
NO
9
), C (3, C
26
H
34
NO
8
), D(4, C
28
H
36
NO
10
) từ
Streptomyces sp. USF – 4227, một chủng đồng thời cũng sinh tổng hợp
tetrapetalone A. HLO (Human Lipoxygenase) và COX (cyclooxygenase) là
những enzym xúc tác đầu tiên tương ứng tạo acid arachidonic, là sản phẩm sinh
ra một loạt các chất gây bệnh cho người như leukotrien, lipoxin, prostaglandin.
Nghiên cứu được tiến hành trên Lipoxygenase của đậu nành (SBL: Soybean
Lipoxygenase)
Streptomyces sp. USF – 4727 được nuôi cấy trong môi trường thích hợp,

dịch lọc sau nuôi cấy 10 ngày ở 30
0
C được tinh chế bằng cột Diaion HP20, rửa
giải bằng MeOH và Aceton được gộp lại và làm bốc hơi dưới áp suất giảm, sau
đó tinh chế bằng sắc ký cột silicagel, dung môi rửa giả là n-hexan (1), n-hexan:
ethylacetate =3:7 (2), n-hexan: acetone = 3:7 (3), và acetone (4).
Tetrapetalone B được tìm thấy ở phân đoạn dung môi (1) và (2) , sau đó
sắc khí trao đổi ion bằng cột Sephadex LH – 20, dung môi rửa giả là MeOH,
tinh chế phân đoạn dung môi (1) thu được 10mg bột từ 7,2l môi trường
Tetrapetalone A có IC
50
là 190 (
μ
M)
Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp 02-02