Xây dựng kỹ thuậ t RT – PCR phát hiện viêm gan siêu vi C pdf

Xây dựng kỹ thuật RT – PCR phát hiện viêm gan siêu vi C đồng thời định
genotype HCV bằng lai trên vạch dò đặc hiệu của thanh inoLIPA
Hồng Hiếu Ngọc
( 1 ) ,
Phạm Hùng Vân
( 2 )
Tóm tắt
Đặt vấn đề: Viêm gan siêu vi C là một trong những ngun nhân gây xơ gan và ung thư gan
(1-8 )
. Qui trình kỹ
thuật RT – PCR nhằm phát hiện, xác định genotype HCV do chúng tơi xây dựng với mục đích giúp định hướng
và theo dõi điều trị viêm gan siêu vi C.
Mục tiêu: Xây dựng kỹ thuật RT – PCR để phát hiện HCV đồng thời xác định kiểu gen của virus viêm gan C
bằng kỹ thuật lai trên vạch dò đặc hiệu của thanh InoLipa của Bayers.
Phương pháp nghiên cứu: Chúng tơi xây dựng kỹ thuật RT – PCR dùng mồi đặc hiệu cho vùng 5’ khơng mã
hóa của bộ gen HCV có gắn biotin để phát hiện RNA HCV. Sau đó, những sản phẩm PCR này được định
genotype bằng phương pháp lai trên vạch dò đặc hiệu INOLiPA do gắn sẵn chất đánh dấu biotin trước đó. 45
mẫu huyết thanh HCV (+) và 15 mẫu HCV (-) đã xác định bằng kỹ thuật RT – PCR thơng thường, lấy trong
thời gian từ 3/2005 đến 7/2005, được tiến hành thử nghiệm phát hiện RNA HCV bằng qui trình kỹ thuật mới
cùng với kỹ thuật RT – PCR thơng thường và kỹ thuật Nested PCR của Bayer. Những sản phẩm PCR có HCV
(+) sẽ tiếp tục định genotype bằng phương pháp lai.
Kết quả: Với mỗi qui trình PCR, chúng tơi đều thu được kết quả 45 mẫu HCV (+) và 15 mẫu HCV (-) như ban
đầu. Các mẫu HCV (+) từ kỹ thuật PCR thơng thường khơng thể tiếp tục định genotype HCV vì khơng có chất
đánh dấu biotin. Các mẫu HCV (+) từ kỹ thuật Nested PCR và kỹ thuật do chúng tơi xây dựng đều xác định
được genotype và cho kết quả genotype giống như nhau.
Kết luận: Qui trình kỹ thuật RT – PCR phát hiện RNA HCV bằng mồi có gắn biotin và định genotype HCV
bằng phương pháp lai trên vạch do chúng tơi xây dựng và thử nghiệm đã thành cơng, cho kết quả chính xác như
đối với kỹ thuật RT – PCR thơng thường và Nested PCR.
Abstracts
Setting up the RT – PCR technique to detect hepatitis C virus and determine genotype HCV by
hybrilizing PCR products on specific inoLIPA strip.

Background: Hepatitis C virus is one of reasons that causes cirrhosis and hepatic cell carcinoma. The new RT
– PCR technique is set up to detect HCV and determine its genotypes with the aim of orientating and following
treatment of HCV.
Objectives: Setting up RT – PCR technique to detect hepatitis C virus and determine genotype HCV by
hybrilizing PCR products on specific Inolipa stripe.
Method: The primers bound to biotin were designed specifically to 5’ noncoding region of HCV genome and
detected RNA HCV by using RT – PCR. These PCR products then can be used to find HCV genotypes by
hybridizing to immobilized probes on nitrocellulose stripes. 45 serum samples with HCV (+) and 15 serum
samples with HCV (-), which had been known by ordinary RT – PCR, will be tested by new RT – PCR
technique, ordinary RT - PCR and Nested PCR. Then PCR products with HCV (+) will be determined HCV
genotypes.
Results: From each process, we gather 45 positive samples with HCV and 15 negative samples as before.
Positive HCV PCR products from ordinary RT – PCR can not be followed to find out HCV genotypes. Positive
HCV PCR products from the last two processes can be used to determine HCV genotypes and results from
them are the same.
Conclusion: The new RT – PCR technique set up to detect HCV and determine its genotypes is success. The
results from it are similar to from ordinary RT – PCR and Nested PCR.
Đặt vấn đề
Hiện nay, viêm gan siêu vi C là một bệnh lý
được nhiều nhà lâm sàng, dòch tễ học cũng
như nghiên cứu y học đặc biệt quan tâm.
Những nghiên cứu trên thế giới cho thấy có sự
tương quan rõ rệt giữa bệnh gan mãn tính, xơ
gan và ung thư tế bào gan với nhiễm HCV
(1-8)
– thậm chí có liên quan đến từng type HCV
riêng biệt
(9,10)
. Ngoài ra, để có được chỉ đònh
điều trò đặc hiệu cũng như theo dõi được hiệu

quả điều trò thì việc xác đònh kiểu gen HCV
trong máu cũng rất quan trọng. Việc ứng dụng
kỹ thuật PCR trong phát hiện những tác nhân
vi sinh vật đã và đang được sử dụng ở Việt
Nam. Bên cạnh nhiều giá trò lợi ích hơn so với
các xét nghiệm huyết thanh chẩn đoán, vấn
đề giá cả của kỹ thuật này lại là một yếu tố
cần được quan tâm cân nhắc. Vì thế, chúng tôi
tiến hành xây dựng một qui trình kỹ thuật RT
– PCR nhằm phát hiện và xác đònh genotype
1
*Tác giả chính,
1
Bộ mơn Hóa sinh, Khoa Y, Đại Học Y Dược TP. HCM.
2
Bộ Mơn Vi Sinh, Khoa Y, Đại Học Y
Dược TP. HCM
HCV với mong muốn tìm hiểu độ tin cậy và sự
chính xác của kỹ thuật này trên những mẫu
bệnh phẩm so với những qui trình khác hiện
đang được sử dụng. Chúng tôi cũng đánh giá
các lợi ích về mặt kinh tế của kỹ thuật này để
có hướng đưa ra áp dụng trên thực tế hiện nay
tại các phòng thí nghiệm có trang bò PCR.
Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Mẫu máu bệnh phẩm từ bệnh nhân đã được
chẩn đoán nhiễm HCV sẽ được tách chiết
huyết thanh. Mẫu huyết thanh không nhiễm
HCV – là những mẫu lưu trữ ở -70
o

C tại công
ty Nam Khoa. Các mẫu này đã được xác đònh
RNA – HCV (-) qua kỹ thuật RT – PCR phát
hiện HCV thực hiện tại công ty Nam Khoa.
Tiến hành ly trích RNA từ những mẫu huyết
thanh bệnh nhân HCV (+) và HCV (-) dựa
trên nguyên tắc dùng Guanidine 14M và urea
với phenol và các chất tẩy khác để làm các
chất gây biến tính protein nhờ đó ly trích được
RNA toàn phần ra khỏi DNA và protein. Thực
hiện RT tổng hợp cDNA từ những mẫu RNA
được ly trích với nguyên tắc phiên mã ngược
toàn bộ RNA thành cDNA bằng mồi ngẫu
nhiên. Giai đoạn này dùng kit tổng hợp cDNA
của công ty Nam Khoa với chu kỳ nhiệt như
sau: 25
o
C trong 5 phút; 42
o
C trong 30 phút;
85
o
C trong 5 phút; Thực hiện PCR: Chúng tôi
thực hiện 3 qui trình đồng thời. (1) Qui trình
PCR và mồi bình thường: Là qui trình PCR
sử dụng bộ kit RT – PCR phát hiện HCV của
công ty Nam Khoa sản xuất. Qui trình này sử
dụng một cặp mồi đặc hiệu cho một đoạn dài
#244 bp trong vùng 5’ không mã hóa của bộ
gen HCV. Sau đó, sản phẩm sẽ được điện di

và đọc kết quả dưới ánh sáng tia cực tím. (2)
Qui trình Nested PCR với mồi OP và NP
của Bayer: Qui trình này dựa trên nguyên tắc
dùng mồi OP khuếch đại một đoạn dài 300 bp.
Sau đó dùng sản phẩm PCR khuếch đại bằng
mồi OP này làm khuôn để chạy qui trình
nested PCR với mồi NP để cho sản phẩm
khuếch đại dài #240 bp, cuối cùng, sản phẩm
được phát hiện qua chạy điện di trên thạch
agarose. Sản phẩm nested PCR có một đầu
gắn biotin do mồi NP có gắn biotin. Nhờ vậy,
sản phẩm PCR này sẽ dùng để xác đònh
genotype bằng phương pháp lai trên vạch dò
đặc hiệu HCV – INOLiPA. Cả hai lần chạy
chương trình PCR bằng máy iCycler của
BioRad đều theo chu kỳ nhiệt như sau: 94
o
C
trong 1 phút; 94
o
C trong 15 giây; 55
o
C trong 30
giây; 72
o
C trong 30 giây; Lập lại 40 chu kỳ;
72
o
C trong 5 phút. (3) Qui trình PCR với mồi
gắn biotin: Đây là qui trình PCR do chúng tôi

nghiên cứu trong đó chúng tôi dùng một cặp
mồi đặc hiệu cho một đoạn dài #244 bp tại
đầu 5’ không mã hóa của bộ gen HCV. Một
trong hai đầu được chúng tôi gắn chất đánh
dấu biotin. Sản phẩm được chạy PCR để
khuếch đại, sau đó, có thể dùng để xác đònh
được genotype HCV bằng phương pháp lai
trên vạch dò đặc hiệu của HCV – INOLiPA.
Chạy chương trình PCR bằng máy iCycler của
hãng BioRad như sau: 1 chu kỳ 40
o
C trong 10
phút; 1 chu kỳ 95
o
C trong 5 phút; 40 chu kỳ
94
o
C trong 30 giây; 60
o
C trong 30 giây; 72
o
C
trong 1 phút; 1 chu kỳ72
o
C trong 10 phút;
Tổng thời gian thực hiện phản ứng là 2 giờ 10
phút. Phát hiện genotype HCV: Phát hiện
genotype HCV bằng phương pháp lai trên
vạch dò đặc hiệu cho genotype của thanh
HCV - INOLiPA. Nguyên tắc kỹ thuật là: sản

phẩm khuếch đại được biến tính thành những
chuỗi DNA đơn. Đầu 5’ của sản phẩm khuếch
đại HCV có gắn với biotin được lai với những
đoạn mồi ngắn. Đoạn mồi ngắn này một đầu
được gắn cố đònh trên giấy nitrocellulose, đầu
còn lại tự do, có trình tự nucleotid bổ sung với
trình tự nucleotid của đầu 5’ không dòch mã
đặc hiệu cho từng genotype HCV. Biotin của
đầu 5’sẽ gắn với phức hợp streptavidine –
alkalin phosphatase. Cuối cùng, sản phẩm lai
được phát hiện bằng sự xuất hiện màu do
phức hợp streptavidine – alkalin phosphatse
tương tác với chất nền BCIP/NBT chromogen.
Kết quả
Với những mẫu huyết thanh HCV (+) và (-)
ban đầu, chúng tôi tiến hành thực hiện đồng
thời 3 qui trình PCR nói trên trong đó phương
pháp PCR có mồi gắn biotin là của nhóm
nghiên cứu: Với 45 mẫu HCV (+) ban đầu, sau
khi chạy RT – PCR bằng ba phương pháp, kết
quả đều (+). Với 15 mẫu HCV (-) ban đầu, sau
khi chạy RT – PCR bằng ba phương pháp, kết
quả đều (-). 45 mẫu HCV [+] này đều được
tiến hành xác đònh kiểu gen bằng phương
pháp lai trên vạch với bộ thuốc thử do hãng
2
BioRad cung cấp và kết quả được đọc theo
thang chuẩn của hãng này
Các kết quả genotype được ghi lại như sau:
Kiểu gen 1b chiếm tỉ lệ cao nhất 22 trường

hợp (52,38%). Tỉ lệ nhiễm type 1 thấp nhất 1
trường hợp (2,4%). Có 7 trường hợp đồng
nhiễm 2 type (1 trường hợp nhiễm 1a/1b, 6
trường hợp nhiễm 2a/2c) và 1 trường hợp đồng
nhiễm 3 type (2a/2c/1b).
Kết luận
Với những kết quả thử nghiệm do phương
pháp 1 mang lại, chúng tôi không thể tiếp tục
thực hiện xác đònh genotype HCV bằng kỹ
thuật lai trên vạch vì trong thành phần của sản
phẩm không có biotin – một chất dùng để phát
hiện sản phẩm bằng cách hiện màu. Thử
nghiệm đònh genotype từ phương pháp Nested
PCR của Bayer và phương pháp PCR có mồi
gắn biotin của chúng tôi cho kết quả như nhau
vì sản phẩm PCR thu được từ hai phương pháp
đều có gắn biotin ở đầu 5’. Do đó đều có thể
được phát hiện bằng chất hiện màu. Kết quả
phát hiện RNA HCV và đònh genotype giữa
phương pháp Nested PCR và phương pháp của
chúng tôi đã được trình bày ở phần trên càng
xác đònh độ tin cậy của qui trình PCR có mồi
gắn biotin mới được xây dựng so với hai qui
trình còn lại. Như vậy, qui trình kỹ thuật của
chúng tôi vừa có khả năng phát hiện RNA
HCV vừa tạo ra được những sản phẩm PCR có
thể tiến hành đònh genotype HCV bằng
phương pháp lai trên vạch. Với cùng kết quả
như trên, qui trình kỹ thuật do chúng tôi thiết
kế chỉ cần sử dụng 1 cặp mồi để phát hiện

RNA – HCV so với Bayer phải sử dụng 2 cặp
mồi. Ngoài ra, trong thành phần genotype
HCV PCR mix của chúng tôi có dUTP và
UNG để chống ngoại nhiễm còn trong bộ PCR
master mix của Bayer thì không. Như vậy,
trong mục tiêu này, điểm lớn nhất mà chúng
tôi đạt được là không hề bò ngoại nhiễm sản
phẩm khuếch đại nên kết quả xác đònh
genotype luôn rõ ràng, không có các vạch
màu tạp nhiễm khiến việc đọc kết quả khó
khăn. Để thực hiện đònh genotype HCV dựa
trên qui trình kỹ thuật HCV – INOLiPA của
Bayer, kinh phí sẽ là 300.000 VNĐ cho phát
hiện HCV – RNA, 300.000 VNĐ cho PCR
trước khi đònh type với mồi OP và NP,
1.300.000 VNĐ cho lai trên vạch dò đặc hiệu.
Do đó tổng giá thành là 1.900.000 VNĐ. Để
đònh genotype HCV với qui trình của chúng
tôi thì giá thành sẽ là 300.000 VNĐ PCR phát
hiện và đònh genotype, 1.300.000 VNĐ cho lai
trên vạch dò đặc hiệu. Tổng giá thành sẽ là
1.600.000, tiết kiệm được 300.000 VNĐ so với
cách làm của Bayers.
Tài liệu tham khảo.
1. DAVID L.THOMAS, STANLEY M.LEMON.
Hepatitis. Mandell, Douglas, and Bennett’s
Principles & Practice of Infectious diseases.
Gerald L.Mandell, John E.Bennett. Raphael
Dolin. 2000;143:1736 – 1760.
2. DI BISCEGLIE AM, GOODMAN ZD, ISHAK

KG. et al. Long-terms clinical and
histopathological follow-up of chronic
posttransfusion hepatitis. Hepatology.
1991;14:969 - 974.
3. HOPF U, MOLLER B, KUTHER D, et al.
Long-term follow-up of posttransfusion and
sporadic chronic hepatitis non-A. non-B and
frequency of circulating antibodies to hepatitis
C virus (HCV). J Hepatol. 1990;10:69 - 76.
3
HCV 244 bp
HCV 240 bp
HCV 244 bp
Hình 1: Kết quả HCV [+] trên thạch điện di,
với 3 phương pháp; A: phương pháp PCR với
mồi bình thường, B: Phương pháp PCR với mồi
OP và NP, C: Phương pháp PCR mồi gắn biotin
A B C
2,4%
11,9%
52,38%
2,4%
14,29%
14,29%
2,4%
0
5
10
15
20

25
Số trường hợp
1 1b 2a/2c 2a/2c/1b
Kiểu gen
Biểu đồ 1: Tỉ lệ phân bố kiểu
gen.
4. KORETZ RL, ABBEY H, COLEMAN E, et al.
Non-A. non-B post-transfusion hepatitis.
Looking back in the second decade. Ann intern
Med. 1993:119:110 - 115.
5. MATTSSON L. SONNERBORG A,
WEILAND O. Outcome of acute symptomatic
non-A, non-B hepatitis: A 13-year follow-up
study of hepatitis C virus markers.
Liver.1993;13:274 - 278.
6. SEEFF LB. Natural history of hepatitis C.
Hepatology. l997;26:21S – 28S.
7. TONG MJ, EL-FARRA NS, REIKES AR, et
al. Clinical outcomes after transfusion
associated hepatitis C. N Engl J Med.
1995;332:1463 – 1466.
8. TREMOLADA F, CASARIN C, ALBERTI A,
et al. Long-term follow-up of non-A non-B (type
C) post-transfuston hepatitis. J Hepatol.
1992;16:273 - 281.
9. BRUNO S. SILINI E, CROSIGNANI A., et al.
Hepatitis C virus genotypes and risk of
hepatocellular carcinoma in cirrhosis: A
prospective study. Hepatology. 1997;25:734 –
758.

10. MAHANEY. K, TEDESCHI. V., MAERTENS.
G., et al. Genotypic analysis of hepatitis C
virus in American patients. Hepatology.
1994;20 :1405.
4