XÂY DỰNG MÔ HÌNH GÂY NHIỄM CANDIDA ALBICANSÂM ĐẠO CHUỘT NHẮT TRẮNG pot

XÂY DỰNG MÔ HÌNH GÂY NHIỄM CANDIDA ALBICANS
ÂM ĐẠO CHUỘT NHẮT TRẮNG

TÓM TẮT
Mục tiêu: xây dựng mô hình gây bệnh Candida albicans âm đạo ở chuột
nhắt trắng và áp dụng được mô hình vào nghiên cứu tác dụng của các chất kháng
nấm ở in vivo.
Phương pháp: chuột nhắt trắng cái, cân nặng khoảng 18 -22g, chưa sinh
sản, được gây nhiễm vi nấm Candida albicans ATCC 10231 vào âm đạo sau khi
làm suy yếu hệ miễn dịch bằng Estradiol valerat (EV) và gây rối loạn vi khuẩn chí
trong âm đạo với Cloramphenicol theo 5 mô hình khác nhau về liều lượng và thời
gian. Các lô chuột bị viêm âm đạo do Candida gây nhiễm sẽ được điều trị bằng
clotrimazol để khảo sát các tiêu chuẩn đánh giá mức độ bệnh của chuột sau gây
nhiễm.
Kết quả: có thể gây nhiễm C. albicans âm đạo chuột để thử tác dụng của
các chất kháng nấm in vivo bằng mô hình: cloramphenicol 1%, tiêm 2ml/ngày x 7
ngày trước gây nhiễm, Estradiol valerat 0,05mg/100ml tiêm dưới da trong 3 ngày
trước gây nhiễm, 3 ngày trong gây nhiễm và 2 ngày sau gây nhiễm, tiêm 20ml C.
albicans 10
6
CFU/ml.
Kết luận: một số điều kiện gây suy giảm miễn dịch và rối loạn cân bằng vi
sinh ở âm đạo chuột nhắt trắng đã được dò tìm để đưa ra mô hình gây nhiễm bệnh
thực nghiệm C. albicans âm đạo trên chuột nhắt trắng. Mô hình này có thể áp dụng
để thử tác dụng kháng C. albicans của các chất kháng nấm in vivo.
ABSTRACT
Objectives: Desining a protocol for the infection by Candida albicans at the
vagina of the white mouse. Applying this protocol to test in vivo the action of
antifungus substances.
Methods: Test animals were young female white mice, of 18- 22g weigh,
and no previous birth experience. Estradiol valerat (EV) treatment had weakened

their immunity system, and 5 different treaments of Cloramphenicol on quantity
and time had disturbed the micro flora of their vagina. The micro-organism strain
was Candida albicans ATCC 10231. Clotrimazol will treat samples of mic that got
vagina inflamation by Candida infection. Hence their sicness degree will be
evaluated and will constitute criteria for clinical examination.
Results: the C. albicans infection of the mouse vagina was done by this
prescription: Cloramphenicol 1% injection 2µl/day, on 7 days before
contamination; Estradol valerate 0.05 mg/100ml under-skininjection on 3 days
before contamination, on 3 days during contamination and on 2 days after
contamination. Contamination by injection of 20µl C. albicans 10
6
CFU/ml.
Conclusions: Determining the conditions of weakening the immune system
of the mouse, disturbing the balance of micro flora in the vagina of white mouse,
and the protocol for experimental infection of C. albicans vagina. This protocol
can be used in the test in vivo of antifungus action on C. albicans.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Candida albicans là vi nấm sống hoại sinh ở da và niêm mạc, có thể gây
bệnh khi gặp cơ hội, hiện nay bệnh do Candida rất thường gặp ở người suy giảm
miễn dịch.
Ngoài việc thường gây bệnh, kháng thuốc còn là vấn đề được đặt ra gần
đây với nhóm nấm này. Vì vậy, việc sử dụng kháng sinh kháng nấm hợp lý trong
điều trị cũng như tìm thêm thuốc mới kháng Candida được xem là vấn đề cấp
thiết. Từ yêu cầu trên, chuẩn hóa mô hình xác định hoạt lực kháng sinh kháng nấm
in vitro và in vivo đang được quan tâm. Hiện nay để xác định hoạt lực các chất
kháng nấm in vitro trên nấm men, NCCLS đã đưa ra qui trình thử nghiệm chuẩn
M27- A2, bên cạnh đó một số mô hình xác định mức độ tác dụng của thuốc kháng
nấm in vivo trên C. albicans cũng đã được đề nghị. Tuy nhiên mô hình gây nhiễm
bệnh Candida âm đạo ở thú chỉ mới được thực bước đầu trên chuột cống
(1) (3)

. Vì
vậy, mục tiêu của đề tài này nhằm xây dựng được mô hình gây bệnh Candida
albicans âm đạo ở chuột nhắt trắng, dễ tìm hơn chuột cống trắng, và áp dụng được
mô hình này trong nghiên cứu tác dụng của các chất kháng nấm ở in vivo.
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Nguyên liệu
Chuột nhắt trắng cái, trong lượng từ 18-22 g, chưa sinh sản.
Vi nấm Candida albicans ATCC 10231
Estradiol valerat (EV), Cloramphenicol
Môi trường Sabouraud, thạch bột ngô.
Phương pháp
Nguyên tắc xây dựng mô hình: bệnh Candida không phải là bệnh tự nhiên ở
chuột, vì vậy để gây được bệnh cho chuột cần thiết phải gây suy giảm miễn dịch
và xáo trộn cân bằng tự nhiên ở âm đạo chuột bằng cách sử dụng estradiol valerat
(3) (4)
và cloramphenicol theo sơ đồ sau:
Chuột nuôi quen chuồng
Estradiol valerat/cloramphenicol
Gây nhiễm
Cấy + phết ướt
Thời gian (ngày)






Sơ đồ 1. Các bước thực hiện mô hình gây nhiễm Candida âm đạo chuột
nhắt trắng
Chi tiết trong từng bước thực hiện mô hình như liều estradiol valerat, thời gian

cho cloramphenicol, liều và thời gian gây nhiễm C. albicans ở âm đạo chuột, được
thay đổi theo bảng 1 để tìm điều kiện thích hợp gây ra bệnh nhiễm ở chuột.
Mức độ bệnh của chuột được đánh giá dựa trên các tiêu chuẩn sau:
- Mật độ C. albicans dạng sợi ở phết ướt âm đạo chuột
(2)
.
- Mật độ khúm nấm men cấy từ dịch âm đạo chuột trước và sau gây nhiễm
lên môi trường Sabouraud. Mật độ sợi nấm trong phết ướt âm đạo chuột và khúm
nấm men cấy trên thạch Sabouraud được mã hóa thành điểm để xử lý thống kê
theo F test và T test.
Bảng 1. Tóm tắt các điều kiện áp dụng trong các bước thực hiện mô hình
MH 1 MH 2 MH 3 MH 4
Liều EV
0,2mg/100
ml
0,1mg/100
ml
0,0
5mg/100
ml
0,05mg/100
ml ml

Đường cho EV

Tiêm dư
ới
da
Uống
Tiêm dư

ới
da
Tiêm dư
ới
da da

MH 1 MH 2 MH 3 MH 4
Th
ời gian cho
EV
1 lần
3 ngày
trước gây nhiễm
1 lần/ngày

Liên t
ục 3
ngày trư
ớc gây
nhiễm
1 lần/ngày
Liên t
ục 3
ngày trư
ớc gây
nhiễm
1 lần/ngày
Liên t
ục 3
ngày trư

ớc gây
nhiễm
3 ngày khi
gây nhiễm
2 ngày sau
gây nhiễm
ngày trư
nhi
gây nhi
gây nhi
Cloramphenicol
Không Không
Ngày 1 l
ần,
liên tục 3 ng
ày
trư
ớc khi gây
nhiễm
Ngày 1 lần

Liên t
ục 7
ngày trư
ớc gây
nhiễm
ngày trư
nhi
C. albicans
10

5

CFU/20 ml
10
5

CFU/20 ml
10
6

CFU/ml
10
6

CFU/ml
CFU/ml
MH 1 MH 2 MH 3 MH 4
1 ngày
2 ngày
liên tiếp
3 ngày liên
tục
3 ngày liên
tục tục

CLZ Không Không Không
Ngày th
ứ 3
sau gây nhi
ễm.

Liên tục 6 ngày
sau gây nhi
Liên t
Th
ời gian đánh
giá sau gây nhiễm
3 ngày 3 ngày 6 ngày 8 ngày



Bảng 2. Mật độ vi nấm xuất hiện trong dịch âm đạo chuột
Biểu
thị mật độ
Tần
s
ố xuất hiện
s
ợi nấm /
phết ư
ớt âm
Lư
ợng
khúm n
ấm
men trên đ
ĩa
Đi
ểm
đạo chuột Petri
-

Không
g
ặp / 10 thị
trường
0 0
(+/-) Xuất
hiện r
ãi rác
(1-5/10 th
ị
trường)
< 10 0,5
(+) 1-
5 / 5
thị trường
10-50 1
(++) 6-
20 /
5 thịtrường
50-199

2
(+++)

20-40
/ 1 thịtrường

200-
300
3

(++++)

Rất >300 4
nhi
ều (dầy
đ
ặc)/ 1
thịtrường
Xác định khúm nấm men trên thạch Sabouraud đúng là C. albicans bằng cách
lấy ngẫu nhiên 5-10 khúm nấm men, cấy lại lên thạch bột ngô, phải có sự hiện diện
của sợi nấm giả và bào tử bao dày
(1)
.






KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Mô hình gây nhiễm 1 được thực hiện theo sơ đồ 2
Ngày
Estradiol valerat 0,2 mg/100 ml
C. albicans
10
5
CFU/20 ml
Cấy + phết ướt
Nuôi quen chuồng / 1 tuần
-3

-2
-1
0
1
2
3









Sơ đồ 2. Các bước thực hiện mô hình gây nhiễm 1
Bảng 3: Kết quả gây nhiễm theo mô hình 1
Những biến đổi ở dịch âm đạo chuột theo thời gian (ngày) Chuột

Trước gây nhiễm G
ây
nhiễm
Sau gây nhiễm
-3

-2

-1 0 1 2 3
1
BT

BT
BT

BT

2
BT
BT
Ch
ết
-
3
BT
BT
Ch
ết
-
4
BT
BT
BT

BT

+ Quan sát b
ằng mắt
thường: âm đ
ạo chuột không có
biểu hiện bệnh lý
+ Phết ư

ớt: Mật độ nấm
men (+),
+ Mật độ sợi nấm (-).
+ M
ật độ khúm nấm
men cấy trên đĩa thạch: (+)
(Ghi chú: BT – bình thường)
Mô hình 1 chưa gây được bệnh nhiễm ở chuột.
Estradiol valerat
0,1 mg/20 ml
C. albicans
10
5
CFU/20 ml
Cấy + phết ướt
Ngày
Nuôi quen chuồng/ 7 ngày
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
Mô hình gây nhiễm 2 được thực hiện theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 3. Các bước thực hiện mô hình gây nhiễm 2

Bảng 4. Kết quả gây nhiễm theo mô hình 2
Những biến đổi ở dịch âm đạo chuột theo thời gian (ngày)
Trước gây nhiễm Gây nhiễm Sau gây nhiễm
Chuột

-4 -3 -2 -1 0 1

2

3

1
BT
BT
BT
BT
BT
+ Âm đ
ạo
Những biến đổi ở dịch âm đạo chuột theo thời gian (ngày)
Trước gây nhiễm Gây nhiễm Sau gây nhiễm
Chuột

-4 -3 -2 -1 0 1

2

3

2
BT
BT
BT
BT
BT
3
BT
BT
BT
BT
BT
4
BT
BT
BT
BT
BT
chu
ột không có biểu
hiện bệnh lý.
+ K
ết quả xem
phết ư
ớt: nấm men
(+), nấm sợi (-).

+ K
ết quả cấy:
Vi khu
ẩn (++++), nấm
men (±)
Ghi chú BT: Bình thường
Mô hình 2 chưa gây được sự nhiễm nấm ở chuột
Mô hình gây nhiễm 3
Estradiol valerat
0,05 mg/100 ml
C. albicans
10
6
CFU/ml
Cấy + phết ướt
Ngày
-4
-3
-2
-1
1
2
3
4
-5
5
6
0
Cloramphenicol
Nuôi quen chuồng/7 ngày

Sơ đồ 4. Các bước thực hiện mô hình gây nhiễm 3
Bảng 5. Mật độ sợi nấm trong phết ướt âm đạo chuột khi gây nhiễm theo
mô hình 3.
M
ật độ sợi nấm trong dịch âm đạo chuột sau
gây nhiễm (ngày)


1 2

3

4

5

6
1

0,5

1

2

2

3

2
2

1 2

2

3

4

Chết

3

1 2

1

1

1

2
4

1 1

2

3

3

Chết

Nhận xét
- 1 ngày sau gây nhiễm, sợi nấm xuất hiện trong phết ướt âm đạo chuột,
mật độ sợi nấm tăng dần đến ngày thứ 5 sau gây nhiễm.
- Ở các chuột thử nghiệm, ngoài sợi nấm và nấm men, mật độ vi khuẩn
trong phết ướt âm đạo chuột còn cao.
Bảng 6: Mật độ khúm nấm men trên đĩa thạch sau khi cấy từ dịch âm đạo
chuột
M
ật độ khúm nấm thay đổi sau gây
nhiễm (ngày)
Chu
ột
1
2
3

4

6
1 0,5

1

2

2

3
2 1 2

4

3

Chết

3 1 2

3
4
4
4 1 3

4
3

Chết

Tương tự, mật độ khúm nấm cấy từ dịch âm đạo chuột cũng tăng dần sau
khi gây nhiễm từ ngày thú 1 đến ngày thứ 4. Các khúm nấm trên thạch Sabouraud
được cấy chuyển sang môi trường thạch bột ngô chứa 1% Tween 80 đều cho sợi
nấm giả và bào tử bao dầy.
Mô hình 3: đã tạo được bệnh nhiễm Candida âm đạo chuột nhắt, tuy nhiên 2/4
chuột chết vào ngày thứ 6, ở các chuột chết, mật độ vi khuẩn trong phết ướt âm đạo
chuột vào ngày thứ 4 vẫn cao.
Mô hình gây nhiễm 4
Chuột dùng thử nghiệm gây nhiễm với mô hình 4 được chia thành 3 lô, mỗi
lô 6 chuột
Lô C
o
: chuột không gây nhiễm
Lô C
1
: chuột gây nhiễm với C. albicans, không điều trị
Lô CLZ: Chuột gây nhiễm với C. albicans, điều trị với dung dịch
clotrimazol 1%,ngày 1 lần, liên tục 5 ngày.



Estradiol valerat 0,05 mg/100 ml
C. albicans
10
6
CFU/ml
Ngày
Cloramphenicol

-9
-8
-7
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
….
Cấy + phết ướt
Lô chứng







Sơ đồ 5. Các bước thực hiện mô hình gây nhiễm 4
Lô điều trị với clotrimazol 1% (CLZ)
Estradiol valerat 0,05 mg/100 ml

C.albicans
10
6
CFU/ml
Ngày
Cloramphenicol
-9
-8
-7
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2