ĐỊNH LƯỢNG ALPHA-FETOPROTEIN TRONG HUYẾT THANH NGƯỜI BẰNG HỆ THỐNG ĐỊNH ppsx

ĐỊNH LƯỢNG ALPHA-FETOPROTEIN
TRONG HUYẾT THANH NGƯỜI BẰNG HỆ THỐNG ĐỊNH LƯỢNG

TÓM TẮT
Mục tiêu nghiên cứu: So sánh kết quả định lượng alpha-fetoprotein
trong huyết thanh người từ hệ thống định lượng sử dụng kháng thể đơn
dòng kháng alpha-fetoprotein được sản xuất từ chuột LOU (AFP-L) với hệ
thống định lượng của hãng Maxim Biotech và Abbott.
Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu thực nghiệm.
Kết quả: Kết quả định lượng nồng độ AFP trong các mẫu huyết
thanh của hai hệ thống định lượng AFP-L và Maxim Biotech không có sự
khác biệt với p = 0,533 (>0,05), và hệ số tương quan nội lớp là: 0,94. Kết
quả định lượng nồng độ AFP trong các mẫu huyết thanh của hai hệ thống
định lượng AFP-L và Abbott không có sự khác biệt với p = 0,345 (>0,05),
và hệ số tương quan nội lớp là: 0,97. Đối với mẫu huyết thanh của bệnh
nhân u gan thì mức nồng độ trên 500 ng/ml ở cả 3 hệ thống là: 76%
(19/25), mức từ 200 – 300 ng/ml: 16% (4/25), mức dưới 100 ng/ml: 8%
(2/25)
Kết luận: Hệ thống định lượng dựa trên kháng thể đơn dòng kháng
AFP của chuột LOU (AFP-L) tương đương với hệ thống định lượng của
hãng Maxim Biotech và Abbott.
ABSTRACT
EVALUATE THE RESULT OF QUANTITATVE
DETERMINATION
OF ALPHA-FETOPROTEIN SERUM BY USING ANTI-ALPHA-
FETOPROTEIN MONOCLONAL
ANTIBODIES OF THE B LYMPHOCYTES OF LOU RAT AND
IR983 CELLS
Phan Ngoc Tien * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 11 - No 2 - 2007:
168 – 173
Purpose: Compare the result of quantitive determination of AFP

serum by using anti-AFP monoclonal antibodies of the Lou rat (AFP-L)
with that of Maxim Biotech and Abbott.
Method: Experimental research.
Results: The results of quantification of AFP in serum samples of
AFP-L and Maxim Biotech are similar with p = 0.533 (>0.05) and ICC
(Intraclass Correlation Coefficient): 0.94; the results of quantification of
AFP in serum samples of AFP-L and Abbott are similar with p = 0.345
(>0.05) and ICC (Intraclass Correlation Coefficient): 0.97. The
concentrations of AFP of patients with hepatoma of three systems are >
500 ng/ml (76%, 19/25), 200-300 ng/ml (16%, 4/25), <100ng/ml (8%,
2/25).

Conclusion: The results of quantitive determination of AFP serum
by using anti-AFP monoclonal antibodies of the Lou rat (AFP-L), Maxim
Biotech and Abbott are equivalent.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong các xét nghiệm định lượng sử dụng phương pháp thử nghiệm
miễn dịch men (ELISA)
(8,9)
, việc sử dụng kháng thể đơn dòng có nhiều ưu
điểm vì kháng thể đơn dòng có độ đặc hiệu và độ nhạy rất cao. Với hệ
thống định lượng alpha-fetoprotein (AFP) bằng phương pháp ELISA sử
dụng kháng thể đơn dòng kháng alpha-fetoprotein được sản xuất từ tế bào
lymphô B của chuột LOU đã mẫn cảm với AFP và dòng tế bào IR983
(7)
chúng tôi tiến hành định lượng AFP và so sánh với hệ thống định lượng sử
dụng phương pháp thử nghiệm miễn dịch men của hãng Maxim Biotech và
Abbott.
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
So sánh kết quả định lượng alpha-fetoprotein trong huyết thanh

người từ hệ thống định lượng sử dụng kháng thể đơn dòng kháng alpha-
fetoprotein được sản xuất từ chuột LOU với hệ thống định lượng của hãng
Maxim Biotech và Abbott.
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu thực nghiệm.
Đối tượng nghiên cứu
Kháng thể đơn dòng kháng AFP và kháng thể đơn dòng kháng AFP
có gắn men peroxidase sản xuất từ chuột LOU.
Tiêu chuẩn chọn mẫu huyết thanh
Cỡ mẫu
Chọn 90 mẫu huyết thanh, trong đó:
+ 55 mẫu huyết thanh bệnh lý của bệnh nhân được khám và điều trị
tại Trung Tâm Ung Bướu Tp. HCM.
- 25 mẫu huyết thanh của nệnh nhân có siêu âm hoặc CT scan phát
hiện u gan, tuổi trên 40 gồm 20 nam và 5 nữ.
- 16 mẫu huyết thanh của bệnh nhân được chẩn đoán viêm gan siêu
vi B cấp, trong đó gồm 9 nam và 7 nữ, tuổi trên 18, HBsAg (+).
- 14 mẫu huyết thanh của bệnh nhân đến khám tại phòng khám Ngoại
Chẩn TTUB Tp.HCM có HBsAg (+) nhưng không có biểu hiện lâm sàng, gồm
10 nam – 4 nữ, tuổi trên 18.
+ 35 mẫu huyết thanh của người bình thường
- Người khỏe mạnh.
- HBsAg (-).
Lưu trữ và bảo quản huyết thanh:
Lấy khoảng 2ml máu, sau đó lấy huyết thanh và huyết thanh được
lưu trữ ở nhiệt độ –24
o
C cho đến khi sử dụng.
Phương pháp thu thập số liệu

- Định lượng nồng độ AFP trong các mẫu huyết thanh bằng hệ thống
định lượng AFP của hãng MAXIM BIOTECH, và bằng hệ thống định lượng
AFP của chuột LOU
Trong phần này chúng tôi sử dụng xét nghiệm bằng kỹ thuật ELISA
của Maxim Biotech (Mỹ)
(9)
.
- Nguyên tắc
Hệ thống này dùng 1 kháng thể kháng AFP cố định trên pha rắn và 1
kháng thể của chuột khác kháng AFP gắn men peroxidase (conjugate).
- Chuẩn bị mẫu huyết thanh:
Chuẩn bị 90 mẫu huyết thanh được đánh số thứ tự từ 1 đến 90, trong
đó 35 mẫu huyết thanh của người bình thường được đánh số từ 1 đến 35,
14 mẫu huyết thanh của bệnh nhân có HBsAg (+) được đánh số từ số 36
đến 49, 16 mẫu huyết thanh của bệnh nhân viêm gan siêu vi B cấp được
đánh số từ 50 đến 65, 25 mẫu huyết thanh của bệnh nhân u gan được đánh
số từ 66 đến 90. Lần 1 mẫu huyết thanh định lượng không pha loãng, lần 2
những mẫu huyết thanh có nồng độ trên 350 ng/ml ở lần 1 sẽ được pha
loãng với tỉ lệ 1:2. Những mẫu huyết thanh nào tiếp tục có nồng độ trên
350ng/ml thì chúng tôi quyết định lấy kết quả cuối cùng là trên 500 ng/ml.
- Tiến hành định lượng nồng độ AFP trong các mẫu huyết thanh bằng
hệ thống của hãng Maxim Biotech
(9)
với phương pháp ELISA.
Định lượng AFP trong huyết thanh bằng hệ thống định lượng
của hãng Abbott
(5)
:
- Nguyên tắc:
Axsym hệ thống dựa trên kỹ thuật thử nghiệm miễn dịch men vi hạt

(MEIA: Microparticle Enzyme Immuno Assay).
- Quá trình phản ứng xảy ra theo trình tự sau:
Mẫu thử, chất pha loãng và vi hạt được gắn kháng thể kháng AFP
được phân phối vào một giếng của buồng phản ứng. Trong khi ủ, AFP của
mẫu thử sẽ gắn vào kháng thể kháng AFP được gắn trên vi hạt tạo thành
phức hợp kháng nguyên – kháng thể.
Một phần hỗn hợp phản ứng được chuyển vào buồng ma trận. Vi hạt
sẽ gắn không đảo ngược được vào ma trận sợi thủy tinh.
Buồng ma trận sẽ được rửa để loại bỏ những chất không gắn.
Kháng thể kháng AFP gắn Akaline phosphatase được cho vào buồng
ma trận và gắn vào phức hợp kháng nguyên – kháng thể.
Buồng ma trận sẽ được rửa để loại bỏ những chất không phản ứng.
Chất nền: 4 – Methylum belliferyl phosphate được cho vào và tạo
huỳnh quang. Sau đó huỳnh quang được đo bằng bộ phận quang học
MEIA.
- Đối với hệ thống định lượng Abbott, công bố nồng độ AFP thấp
nhất có thể định lượng là 0,4ng/ml và cao nhất là 350ng/ml.
- Quá trình thu thập kết quả nồng độ AFP trong mẫu huyết thanh:
Trong 55 mẫu huyết thanh bệnh lý, chúng tôi chỉ thu thập kết quả
nồng độ AFP của 25 bệnh nhân u gan và 16 bệnh nhân viêm gan siêu vi B
cấp, 14 mẫu huyết thanh còn lại không có chỉ định định lượng nồng độ AFP
bằng hệ thống định lượng của hãng Abbott.
Xử lý số liệu
Chúng tôi sử dụng chương trình Point To Point (KC4: Kineticalc for
Windows) xử lý số liệu trong kỹ thuật ELISA, để tính kết quả định lượng
nồng độ AFP; chương trình SPSS 11.5; chương trình Excel 2000.
KẾT QUẢ
Kết quả định lượng nồng độ AFP trong các mẫu huyết thanh
bằng hệ thống định lượng AFP của hãng MAXIM BIOTECH
- Từ kết quả mật độ quang (DO) và nồng độ AFP chuẩn, ta thiết lập

được một đường chuẩn có mối quan hệ tuyến tính. Và đường chuẩn này chỉ
có giá trị cho một bộ định lượng tương ứng.

Đồ thị 1: Đường cong chuẩn của hệ thống định lượng AFP của hãng
MAXIM BIOTECH
Giá trị chẩn đoán và độ nhạy
Hệ thống định lượng AFP của hãng Maxim Biotech có khả năng
định lượng nồng độ AFP ở mức thấp nhất là 2 ng/ml. Theo nghiên cứu của
hãng, nồng độ AFP trên 350ng/ml thì có ý nghĩa chỉ điểm ung thư gan
nguyên phát.
Kết quả định lượng nồng độ AFP trong các mẫu huyết thanh
bằng hệ thống định lượng AFP của hãng MAXIM BIOTECH

Bảng 1
Số
th
ứ tự
mẫu
huyết
thanh
S
ố
mẫu
huyết
thanh
Giá
tr
ị nhỏ
nhất
Giá

trị lớn nhất

Giá tr
ị
trung bình
1-
35
35

0,90 8,50 2,6754
36-
49
14

0,90 7,60 4,3093
50-
65
16

3,5 152,27

34,4175
Giá trị trung bình nồng độ AFP của những bệnh nhân u gan (mẫu
huyết thanh từ số 66 đến 90) đa số là > 500 ng/ml (76%), chỉ 6 mẫu là có
nồng độ AFP < 500 ng/ml (24%).
Kết quả định lượng nồng độ AFP trong các mẫu huyết thanh
bằng hệ thống định lượng AFP dựa trên kháng thể đơn dòng kháng
AFP của chuột LOU (AFP-L)

Bảng 2

Số
th
ứ tự
mẫu
S
ố
mẫu
huyết
Giá
tr
ị nhỏ
nhất
Giá
trị lớn nhất

Giá tr
ị
trung bình
huyết
thanh
thanh
1-
35
35

1,08

7,26 2,7780
36-
49

14

0,91

6,08 3,7993
50-
65
16

6,2 113,53

32,1806

Giá trị trung bình nồng độ AFP của những bệnh nhân u gan (những
mẫu huyết thanh từ số 66 đến 90) đa số là > 500 ng/ml (76%), chỉ 6 mẫu là
có nồng độ AFP < 500 ng/ml (24%).
Kết quả nồng độ AFP của 16 bệnh nhân viêm gan siêu vi B cấp
và 25 bệnh nhân u gan được định lượng bằng hệ thống định lượng của
hãng Abbott

Bảng 3
Số
th
ứ tự
mẫu
huyết
thanh
S
ố
mẫu

huyết
thanh
Giá
trị nh
ỏ
nhất
Giá
trị lớn nhất

Giá tr
ị
trung bình
50-
65
16

5,50

118,67

34,0681

Giá trị nồng độ AFP của những bệnh nhân u gan (chỉ lấy kết quả
nồng độ AFP trong huyết thanh cao nhất là >350 ng/ml). Và nhóm u gan,
với hệ thống định lượng của Abbott thì đa số nồng độ đều >350ng/ml
(76%), chỉ có 6 mẫu có nồng độ AFP dưới 350ng/ml (24%).

So sánh nồng độ AFP (ng/ml) trong mẫu huyết thanh của hai hệ
thống định lượng AFP dựa trên kháng thể đơn dòng kháng AFP của
chuột LOU (AFP-L) và Maxim Biotech

Bảng 4
So sánh cặp đôi
Kho
ảng tin cậy
95% của sự khác biệt

t

Giá
tr
ị trung
bình
Đ
ộ
lệch
chuẩn
Trung
bình sai s
ố
chuẩn
Th
ấp
nhất
Cao
nhất

Đ
ộ
tự do
Cặp

AFP-L -
Maxim

0,6

7,8

0,97 -1,33

2,54

0,626

64


Qua kết quả trên chúng tôi nhận thấy với p = 0,533 (>0,05) Như vậy,
kết quả định lượng nồng độ AFP trong mẫu huyết thanh của hai hệ thống
định lượng AFP-L và Maxim Biotech không có sự khác biệt.
Bên cạnh đó, hệ số tương quang nội lớp (ICC: Intraclass Correlation
Coefficient hay R: Reliability Coefficient) là: 0,944. Như vậy: hệ thống
định lượng AFP-L và Maxim Biotech tương đương nhau.
So sánh nồng độ AFP (ng/ml) trong mẫu huyết thanh bệnh nhân
u gan của hai hệ thống định lượng AFP-L và Maxim Biotech
Đối với mẫu u gan: thì mức nồng độ trên 500 ng/ml ở cả 2 phương
pháp là: 76% (19/25), mức từ 200 – 300 ng/ml: 16% (4/25), mức dưới 100
ng/ml: 8% (2/25). Như vậy hệ thống định lượng dựa trên kháng thể đơn
dòng kháng AFP của chuột LOU (AFP-L) tương đương với hệ thống địng
lượng của hãng Maxim Biotech.
Bảng so sánh nồng độ AFP (ng/ml) trong mẫu huyết thanh của

hai hệ thống định lượng AFP-L và Abbott
Bảng 5
So sánh cặp đôi
Kho
ảng tin cậy
95% của sự khác biệt

t

Giá
tr
ị trung
bình
Độ
lệch
chuẩn
Trung
bình sai s
ố
chuẩn
Th
ấp
nhất
Cao
nhất

Đ
ộ
tự do
Cặp

A
bott
-AFP-L
1,98

7,74

1,93 -2,24

6,01

0,98

15



Qua kết quả trên, chúng tôi nhận thấy kết quả định lượng nồng độ
AFP trong mẫu huyết thanh của hai hệ thống định lượng AFP-L và Abbott
không có sự khác biệt p = 0,345 (>0,05).
Bên cạnh đó, hệ số tương quang nội lớp (ICC: Intraclass Correlation
Coefficient hay R: Reliability Coefficient) là: 0,97. Như vậy: hệ thống định
lượng AFP-T và Abbott tương đương nhau.
Bảng so sánh nồng độ AFP (ng/ml) trong mẫu huyết thanh bệnh
nhân u gan của hai hệ thống định lượng AFP-L và Abbott
Đối với mẫu huyết thanh u gan, nếu so sánh nồng độ AFP của AFP-
L với hãng Abbott thì lấy mức trên 350ng/ml. Lý do là: tại TTUB Tp HCM
định lượng nồng độ AFP trên 350ng/ml là có ý nghĩa ung thư gan nguyên
phát, nên không cần thiết pha loãng để có giá trị chính xác của nồng độ
AFP.

Bảng 6
Mức
nồng đ
ộ AFP
(ng/ml)
AFP-
L
Abbott

>350 19
(76%)
19
(76%)
100-
300
4
(16%)
4
(16%)
<100 2
(8%)
2 (8%)

Như vậy hệ thống định lượng AFP-L tương đương với hệ thống định
lượng của hãng Abbott.
KẾT LUẬN
- Xét về độ nhạy và mức định lượng cao nhất thì 3 hệ thống này
tương đương nhau, riêng nồng độ thấp nhất có thể định lượng của hãng
Maxim Biotech là 2ng/ml, tuy nhiên điều này không ảnh hưởng đến việc
định lượng AFP vì bình thường nồng độ AFP trong huyết thanh là rất thấp

chỉ vài ng/ml.
Bảng 7
Độ nhạy

Mức
đỊnh lượng
cao nhất
AFP-L 0,5ng/ml

350ng/ml

ABBOTT

0,4ng/ml

350ng/ml

MAXIM

2ng/ml 300ng/ml

- Kết quả định lượng nồng độ AFP trong các mẫu huyết thanh của
hai hệ thống định lượng AFP-L và Maxim Biotech không có sự khác biệt
với p = 0,533 (>0,05), và hệ số tương quang nội lớp là: 0,944. Như vậy: hệ
thống định lượng AFP-L và Maxim Biotech tương đương nhau.
- Kết quả định lượng nồng độ AFP trong mẫu huyết thanh của hai hệ
thống định lượng AFP-L và Abbott không có sự khác biệt với p = 0,345
(>0,05), và hệ số tương quang nội lớp là: 0,97. Như vậy: hệ thống định
lượng AFP-T và Abbott tương đương nhau.
- Đối với mẫu huyết thanh của bệnh nhân u gan thì mức nồng độ trên

500 ng/ml ở cả 3 hệ thống là: 76% (19/25), mức từ 200 – 300 ng/ml: 16%
(4/25), mức dưới 100 ng/ml: 8% (2/25). Như vậy hệ thống định lượng dựa
trên kháng thể đơn dòng kháng AFP của chuột LOU (AFP-L) tương đương
với hệ thống địng lượng của hãng Maxim Biotech và Abbott.