XÁC ĐỊNH KIỂU GEN SIÊU VI VIÊM GAN B TRÊN BỆNH NHÂN XƠ GAN ppt

XÁC ĐỊNH KIỂU GEN SIÊU VI VIÊM GAN B TRÊN BỆNH
NHÂN XƠ GAN

Tóm tắt
Đặt vấn đề: Cấu trúc phân tử của siêu vi viêm gan B (SVVGB) được
khảo sát nhằm tìm hiểu mối liên quan giữa kiểu gen siêu vi với những biểu
hiện lâm sàng khác nhau của bệnh.
Mục tiêu: Khảo sát tỉ lệ nhiễm các kiểu gen siêu vi viêm gan B trong
nhóm bệnh nhân xơ gan và tìm hiểu sự liên quan giữa các kiểu gen với độ
tuổi, giới và men gan. PHƯƠNG PHÁP: dựa vào sự hiện diện của HBV
DNA trong mẫu bệnh phẩm, chúng tôi ứng dụng kỹ thuật Multiplex PCR để
xác định kiểu gen của siêu vi viêm gan B.
Kết Quả: có một trường hợp nhiễm kiểu gen A (1,82%), 39 trường
hợp nhiễm kiểu gen B (70,91%), 13 trường hợp nhiễm kiểu gen C (23,64%),
1 trường hợp tái tổ hợp hai kiểu gen B và C (1,82%), một trường hợp chưa
xác định được kiểu gen, và không có trường hợp nào là kiểu gen D, E hoặc F
cả. Như vậy tỉ số kiểu gen C/ kiểu gen B là 1/3. Khảo sát sự phân bố kiểu
gen B và C theo phái thì thấy không có khác biệt. Kiểu gen B xuất hiện
nhiều nhất ở độ tuổi 41 – 60, còn kiểu gen C thì xuất hiện nhiều nhất ở độ
tuổi 51 – 60. Ngoài ra, người nhiễm kiểu gen B còn có men ALT cao hơn
người nhiễm kiểu gen C với P = 0,085 nếu chọn ngưỡng là P < 0,1.
Kết Luận: Kiểu gen B của siêu vi viêm gan B là kiểu gen xuất hiện
nhiều hơn cả trong nhóm bệnh nhân xơ gan và người nhiễm kiểu gen B
thường có men ALT cao hơn người nhiễm kiểu gen C.
ABSTRACT
Background: The molecular structure of hepatitis B virus (HBV) has
been identified to investigate the relation between genotypes and different
clinical outcomes of the disease.
Objective: to establish the rate of HBV genotype infection among
cirrhotic patients and to establish the relation between genotypes and age,
sex and liver enzymes.

Method: based on the presence of HBV DNA in the samples of
cirrhotic patients, we applied Multiplex PCR to identify genotypes of
hepatitis B virus.
Results: there were one patient infected with genotype A (1.82%), 39
patients infected with genotype B (70.91%), 13 patients infected with
genotype C (23.64%), 1 patient infected with B and C recombinant, 1
undetermined case and no patients infected with genotypes D, E or F were
found. Between genotype B and C, there was no significant difference in
gender. The rate of genotype B was highest from the age of 41 to 60, while
that of genotype C was highest from 51 to 60. Besides, patients infected with
genotype B had higher level of ALT than patients infected with genotype C
with P = 0.085 if we choose P < 0.1.
Conclusion: HBV genotype B is the most common genotype among
cirrhotic patients and patients infected with genotype B often have higher
level of ALT than patients infected with genotype C.
ĐẠI CƯƠNG
Trong hơn một thập niên qua, đã có nhiều nghiên cứu về cấu trúc
phân tử của siêu vi viêm gan B (SVVGB) nhằm tìm hiểu mối liên quan giữa
cấu trúc siêu vi với những biểu hiện lâm sàng khác nhau của bệnh. Các bệnh
cảnh lâm sàng nhiễm SVVGB rất thay đổi, chúng phụ thuộc một mặt nào đó
vào độ tuổi của bệnh nhân và sự đáp ứng miễn dịch, mặt khác thì phụ thuộc
vào chủng siêu vi gây nhiễm cho ký chủ. Cho đến nay người ta đã ghi nhận
có 8 kiểu gen của SVVGB dựa vào sự khác biệt trên 8% của trình tự
nucleotid, được đặt tên từ A đến H, và được phân bố theo những vị trí địa lý
khác nhau trên thế giới. Kiểu gen A hiện diện ở Bắc Mỹ, Bắc Âu, Trung Phi
và An độ. Kiểu gen B hiện diện ở Trung quốc, Indonesia, Nhật, Đài Loan và
Việt nam. Kiểu gen C hiện diện ở Trung quốc, Hàn quốc, Nhật, Việt nam và
Nam Thái Bình Dương. Kiểu gen D hiện diện ở Địa Trung Hải, Trung đông,
An độ, Bắc Mỹ, Tây Ban Nha và Nga. Kiểu gen E hiện diện ở Tây và Nam
châu Phi. Kiểu gen F hiện diện ở Nam và Trung Mỹ, Polynesia và ở Mỹ

nhưng hiếm. Kiểu gen G được phát hiện ở châu Âu và ở Mỹ (hiếm). Kiểu
gen H được phát hiện ở Trung Mỹ và ở Nhật (hiếm)
(10,17)
. Hai kiểu gen sau
cùng, G và H là hai kiểu gen được phát hiện gần đây nhất (4, 10, 13). Hai
kiểu gen SVVGB hiện diện nhiều nhất ở Đông Nam Á là kiểu gen B và kiểu
gen C. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tìm hiểu về sự phân bố các kiểu gen
của SVVGB trên những bệnh nhân bị xơ gan do nhiễm SVVGB và sự liên
quan giữa các kiểu gen này với độ tuổi, phái và hoạt tính transaminase.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Đây là một nghiên cứu cắt ngang, với số mẫu khảo sát gồm 55 mẫu
huyết thanh của những bệnh nhân bị xơ gan nhập viện tại Bệnh viện Bệnh
Nhiệt đới TP Hồ Chí Minh hoặc khám tại Bệnh viện Đại học Y Dược TP Hồ
Chí Minh trong khoản thời gian từ tháng 6/2005 đến tháng 8/2006, dựa trên
tiêu chuẩn bệnh nhân có HBsAg dương tính có hội chứng suy tế bào gan và
hội chứng tăng áp lực tĩnh mạch cửa, có hình ảnh siêu âm xơ gan.
Ly trích ADN của siêu vi viêm gan B (HBV DNA) bằng guanidine
thiocyanate, ethanol 70% và aceton, định tính HBV DNA bằng PCR
(12)
, và
sau đó ứng dụng kỹ thuật PCR tổ và Multiplex PCR đã được mô tả bởi
Naito, 2001
(8)
để định kiểu gen.
Sản phẩm PCR được chạy điện di trên thạch agarose 2% nhuộm với
ethidium bromide và đọc kết quả với ánh sáng của đèn cực tím. Kích thước
của các đoạn ADN đặc hiệu dựa vào chứng dương và một thang ADN chuẩn
có những vạch cách nhau 100 đôi base (bp). Kích thước đoạn đặc hiệu của
mỗi kiểu gen như sau: kiểu gen A 68 bp, kiểu gen B 281 bp, kiểu gen C 122
bp, kiểu gen D 119 bp, kiểu gen E 167 bp, kiểu gen F 97 bp.

KẾT QUA
Các dữ liệu được nhập và xử lý theo chương trình Stata 9. Tổng số
mẫu khảo sát là 55 mẫu, trong đó nữ là 17 (tỉ lệ 31%) và nam là 38 (tỉ lệ
69%). Tỉ số nam / nữ là 38/17 = 2,24. Tuổi trung bình bị xơ gan là 51 +
12,32.
Khảo sát bệnh nhân bị xơ gan theo độ tuổi, kết quả được ghi nhận như
sau:
Độ
tuổi
N %
25 – 2 3,6%
30
31 –
40
41 –
50
51 –
60
61 –
70
> 70
10
13
18
9
3
18,2%
23,6%
32,7%
16,4%

5,5%
Tổng 55 100%
Như vậy, tuổi bị xơ gan nhiều nhất là trong khoản 51 – 60 tuổi.
Trong 55 mẫu có HBV DNA dương tính trên, chúng tôi thực hiện PCR tổ
và multiplex PCR để xác định kiểu gen. Kết quả được minh họa ở hình 1.

Hình 1. Kết quả điện di kiểu gen SVVGB trên một số bệnh nhân xơ
gan. Giếng M: thang ADN; A, B, C: các chứng dương kiểu gen A, kiểu gen
B và kiểu gen C; mẫu 28, 31, 33 – 38: kiểu gen B; mẫu 29, 30, 32: kiểu gen
C.

Kết quả trên 55 bệnh nhân được ghi nhận như sau:
Kiểu
gen
N %
A 1 1,82%
B 39 70,91%

C 13 23,64%
Tái t
ổ
hợp B,C
1 1,82%
D, E
hoặc F
0 0%
Chưa
xác đ
ịnh
được

1 1,82%
Tổng 55 100%
Như vậy kiểu gen A chỉ có một trường hợp và kiểu gen B thì nhiều
nhất (70,91%). Có một trường hợp tái tổ hợp 2 kiểu gen B và C. Không phát
hiện được kiểu gen nào là D, E, F cả. Và tỉ số kiểu gen C/B là 13/39 = 1/3,
nghĩa là kiểu gen B xuất hiện nhiều gấp 3 lần kiểu gen C.
Vì kiểu gen B và C chiếm đa số, nên chúng tôi tập trung khảo sát tiếp
trên hai kiểu gen này và trên số bệnh nhân là 52 bệnh nhân.
So sánh sự phân bố kiểu gen B và C theo phái, chúng tôi ghi nhận:
Kiểu gen
B C
Tổng
cộng
N

12 3 15 Nư
%
theo
kiểu
gen
30,77%

23,08%

28,85%

N

27 10 37
Phái

Nam

%
theo
kiểu
gen
69,23%

76,92%

71,15%

Tổng cộng N

39 13 52
%
theo
kiểu
gen
100% 100% 100%
Nhận xét: sự phân bố kiểu gen B ở bệnh nhân nữ là 30,77%, ở bệnh
nhân nam là 69,23%; sự phân bố kiểu gen C ở bệnh nhân nữ là 23,08%, ở
bệnh nhân nam là 76,92%. Sự phân bố kiểu gen B và C theo phái không có
gì khác biệt (P = 0,733).

Khảo sát sự phân bố các kiểu gen B, C theo độ tuổi:
Kiểu gen
B C
Tổng

cộng
N

2 0 2
Độ
tuổi
25
- 30
%
theo
kiểu
gen
5,13% 0% 3,85%
N

7 2 9
31
- 40
%
theo
kiểu
gen
17,95%

15,38%

17,31%

N

10
2 12
41
- 50
%
theo
kiểu
gen
25,64%

15,38%

23,08%

N

10 7
17
51
- 60
%
theo
kiểu
gen
25,64%

53,85%

32,69%

61
N

7 2 9
- 70
%
theo
kiểu
gen
17,95%

15,38%

17,31%

N

3 0 3
>
70
%
theo
kiểu
gen
7,69% 0% 5,77%
N

39 13 52
Tổng cộng
%

theo
kiểu
gen
100% 100% 100%
Nhận xét: kiểu gen B xuất hiện nhiều nhất ở độ tuổi 41 – 60, còn kiểu
gen C thì xuất hiện nhiều nhất ở độ tuổi 51 - 60.
Khi phân bệnh nhân xơ gan làm 2 nhóm tuổi, nhóm bệnh nhân trẻ (< 40
tuổi) và nhóm bệnh nhân lớn tuổi (> 40 tuổi) thì sự phân bố kiểu gen như sau:
Kiểu gen
B C
T
ổng
cộng
N

9 2 11
<
40
%
theo
kiểu
gen
23,08

15,38

21,15

N

30 11
41
Nhóm

tuổi
>
40
%
theo
kiểu
gen
76,92

84,62

78,85

Tổng cộng N

39 13 52
%
theo
kiểu
gen
100%

100%

100%

Nhận xét: Cả hai kiểu gen B và C đều xuất hiện ở bệnh nhân xơ gan trên 40
tuổi nhiều hơn bệnh nhân trẻ.
Khảo sát hoạt độ men gan
Ki
ểu
gen
Tr
ung
bình (IU/L)

Độ
lệch
chuẩn
B
135
129

ALT

C
87
63
B 145 167

AST

C 127 90
Những người nhiễm kiểu gen B có ALT trung bình là 135 ± 129 IU/L,
và AST trung bình là 145 ± 167 IU/L, trong khi những người nhiễm kiểu
gen C có ALT trung bình là 87 ± 63 IU/L, và AST trung bình là 127 ± 90

IU/L. Người nhiễm kiểu gen B có men ALT cao hơn người nhiễm kiểu gen
C với P = 0,085 nếu chọn ngưỡng là P< 0,1.
BÀN LUẬN
Trên thế giới gần đây đã có một số công trình nghiên cứu về sự liên
quan giữa các kiểu gen SVVGB với bệnh cảnh xơ gan, cụ thể như sau:
Kiểu gen C thường gặp ở bệnh nhân xơ gan hơn so với người lành
mang bệnh cùng độ tuổi
(5)
. Tần suất bệnh nhân nhiễm kiểu gen C bị xơ hóa và
xơ gan thì cao hơn so với bệnh nhân nhiễm kiểu gen B
(5,9,16)
. Kiểu gen
SVVGB có ảnh hưởng đến sự phát triển của viêm gan mạn sang xơ gan; ở
bệnh nhân có kiểu gen B thì sự phát triển từ viêm gan mạn sang xơ hóa và xơ
gan xảy ra ít hơn so với kiểu gen C
(6,9)
. Mặc dù bệnh nhân nhiễm kiểu gen B
phát triển đến xơ hóa chậm hơn và có chuyển đổi huyết thanh sớm hơn bệnh
nhân nhiễm kiểu gen C nhưng nguy cơ suốt đời phát triển đến xơ hóa và ung
thư gan thì không có khác biệt so với kiểu gen C
(16,19)
.
Nghiên cứu của chúng tôi trên 55 bệnh nhân xơ gan là một nghiên cứu cắt
ngang, mục đích tìm hiểu sự hiện diện của các kiểu gen và tần suất của các kiểu
gen này, đồng thời tìm hiểu sự liên quan giũa kiểu gen SVVGB với tuổi, phái và
men transaminase, do đó chúng tôi không theo dõi được từ đầu quá trình phát
triển đến xơ gan của những bệnh nhân nhiễm SVVGB.
Về sự xuất hiện của kiểu gen A, có một trường hợp trên 55 trường
hợp, tỉ lệ là 1,82%. Theo y văn thế giới thì kiểu gen A xuất hiện ở Bắc Mỹ,
Bắc Âu, Trung Phi và An độ. Tuy nhiên, một số nghiên cứu trên người Việt

nam vẫn có thấy xuất hiện kiểu gen A, như trong nghiên cứu của Lê H. Song
thực hiện bằng phương pháp PCR – RFLP để phát hiện kiểu gen trên bệnh
nhân xơ gan ở khu vực miền Bắc
(7)
thì có đến 10/92 bệnh nhân mang kiểu
gen A, tỉ lệ là 10,8%, tức là nhiều hơn nghiên cứu của chúng tôi. Nguyễn
Thị Chí Mỹ với phương pháp multiplex PCR cũng đã phát hiện trong số 37
trường hợp có 2 trường hợp nhiễm kiểu gen A (5,4%) và bệnh nhân là những
người bị viêm gan siêu vi B mãn tính
(3)
. Bùi Hữu Hoàng với phương pháp
INNO – LiPA cũng thấy có một trường hợp mang kiểu gen A trong số 25
người lành mang HBsAg mãn tính
(2)
. Như vậy, bằng những phương pháp
khác nhau và những bệnh cảnh lâm sàng khác nhau vẫn thấy xuất hiện kiểu
gen A với một số lượng rất thấp ở bệnh nhân Việt nam.
Trong nghiên cứu này, tần suất kiểu gen B thì cao hơn tần suất kiểu
gen C (70,91% so với 23,64%). Nghiên cứu của Lê H. Song trên bệnh nhân
xơ gan ở khu vực miền Bắc là 8/92 (8,7%) bệnh nhân nhiễm kiểu gen B và
13/92 bệnh nhân (14,1%) bệnh nhân nhiễm kiểu gen C, vậy theo tác giả này
trong xơ gan thì kiểu gen C là nhiều hơn kiểu gen B
(7)
. Còn trong một nghiên
cứu của Bùi Hữu Hoàng năm 2003, trong 24 bệnh nhân xơ gan nhập viện tại
bệnh viện Chợ rẫy thì có một bệnh nhân không xác định được kiểu gen, 10
bệnh nhân nhiễm kiểu gen B và 13 bệnh nhân nhiễm kiểu gen C
(2)
. So kết
quả của chúng tôi với nghiên cứu này chúng tôi có nhận xét như sau:

Ki
ểu gen
B
Kiểu
gen C
Không
xác đ
ịnh,
ho
ặc kiểu
gen A, ho
ặc
tái tổ hợp
T
ổng
số mẫu
Bùi
Hữu Hoàng
10
(42%)
13
(54%)
1
(4%)
24
Chúng
tôi
39
(70,91%)

13
(23,64%)

3
(5,46%)

55
Như vậy, với số lượng mẫu của chúng tôi là nhiều hơn, chúng tôi đã
xác định được kiểu gen B là kiểu gen chiếm ưu thế ở bệnh nhân xơ gan khu
vực miền Nam.
Trong một nghiên cứu khác của Kao năm 2000 tại Đài Loan thì trong
30 bệnh nhân bị xơ gan, có 9 bệnh nhân bị nhiễm kiểu gen B (30%) và 18
bệnh nhân bị nhiễm kiểu gen C (60%)
(5)
. Trong nghiên cứu của Orito năm
2001 tại Nhật thì trong 29 bệnh nhân bị xơ gan, có 12 bệnh nhân bị nhiễm
kiểu gen B và 112 bệnh nhân bị nhiễm kiểu gen C
(11)
. Vậy ở Đài Loan cũng
như ở Nhật, tỉ lệ bệnh nhân xơ gan có kiểu gen C thì cao hơn so với nghiên
cứu của chúng tôi.
Nhận xét về một trường hợp tái tổ hợp kiểu gen B và C được phát
hiện trong nghiên cứu của chúng tôi, thì theo y văn cũng có xác nhận một số
trường hợp tái tổ hợp B và C
(7, 15, 20)
.
KẾT LUẬN
Theo nghiên cứu của chúng tôi:
1. Trong xơ gan do nhiễm SVVGB, có 3 kiểu gen siêu vi được ghi
nhận: A, B và C, trong đó tỉ lệ kiểu gen B là cao nhất (70,91%); tỉ số kiểu

gen C/B là 1/3.
2. Độ tuổi bị nhiễm nhiều nhất với cả 2 kiểu gen là 51 - 60 tuổi.
3. Trong xơ gan, bệnh nhân nhiễm kiểu gen B thường có men ALT
cao hơn bệnh nhân nhiễm kiểu gen C.