XÁC ĐỊNH KIỂU GEN VÀ CÁC ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC CỦA SIÊU VI VIÊM GAN B BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI potx

XÁC ĐỊNH KIỂU GEN VÀ CÁC ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC
CỦA SIÊU VI VIÊM GAN B BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH
TỰ CHUỖI

Tóm Tắt
Mở đầu: Tám kiểu gen của siêu vi viêm gan B (HBV) đã được xác
định (Từ A đến H) dựa vào sự khác nhau trên 8 % của bộ gen HBV, và sự
phân bố của các kiểu gen khác nhau ở các châu lục, các nước khác nhau.
Việc xác định kiểu gen của HBV ngày càng được quan tâm bởi vì kiểu gen
HBV có liên quan đến biểu hiện triệu chứng lâm sàng, diễn tiến của bệnh
cũng như đáp ứng với điều trị của viêm gan siêu vi B. Bên cạnh đó, vấn đề
phát hiện đột biến kháng thuốc, đặc biệt là các đột biến kháng Lamivudine
trong điều trị HBV giữ một vai trò rất quan trọng để từ đó chúng ta mới có
lựa chọn thuốc đúng và hiệu quả trong điều trị viêm gan siêu vi B.
Mục tiêu và phương pháp: Chúng tôi ứng dụng kỹ thuật giải trình tự
chuỗi (Sequencing) trên hệ thống OpenGene với bộ thuốc thử TruGene
(Bayer) trong việc xác định kiểu gen và các đột biến kháng thuốc
Lamivudine đã được công bố của HBV. Trong thời gian từ tháng 8/2004 đến
tháng 5/2006, tại phòng xét nghiệm Trung Tâm Y Khoa MEDIC, chúng tôi
thực hiện giải trình tự chuỗi cho 122 trường hợp bệnh nhân Việt Nam viêm
gan siêu vi B mãn tính đang điều trị Lamivudine.
Kết quả: Nam chiếm 97 trường hợp (79,5%), nữ 25 trường hợp
(20,5%), với tuổi trung bình của bệnh nhân 33,9 ± 10,4. Tất cả các trường
hợp đều HBVDNA [+], trong đó HBeAg [+] là 100 trường hợp (82,0%) và
HBeAg [-] là 22 trường hợp (18,0 %). Chỉ có 2 kiểu gen của HBV là kiểu
gen B và C, trong đó kiểu gen B là 76 trường hợp (62,3 %) và kiểu gen C là
46 trường hợp (37,7 %). Tổng cộng có 78 trường hợp (63,9%) có đột biến
kháng Lamivudine, tỷ lệ và các kiểu đột biến như sau: L180M & M204I
(11,5%); L180M & M204V (36,1%); L180M, M204V & V173L (0,8%);
L180M, M204V & V207I (0,8%); M204I (12,3%); M204I & V207I (0,8%);
M204V (1,6%). Trong 76 trường hợp kiểu gen B có 49 trường hợp (64,5%)

có đột biến kháng Lamivudine, và 46 trường hợp kiểu gen C có 29 trường
hợp (63,0%) có đột biến kháng Lamivudine. Tất cả bệnh nhân đang điều trị
Lamivudine với thời gian điều trị trung bình là 2,5 ± 0,9 năm với số trường
hợp tương ứng cho điều trị 1, 2, 3, 4 năm là 18, 41, 45, 18 trường hợp. Tỷ lệ
có đột biến kháng Lamivudine sau 1, 2, 3, 4 năm điều trị Lamivudine là
27,8%; 63,4%; 71,1%; 83,3%.
Kết luận: Qua kết quả bước đầu đạt được chúng tôi thấy rằng kỹ thuật
giải trình tự chuỗi giữ một vai trò rất quan trọng trong việc xác định kiểu gen
siêu vi viêm gan B cũng như việc nhận diện được các đột biến kháng thuốc
Lamivudine để từ đó chúng ta có một phác đồ điều trị tối ưu.
ABSTRACT
APPLYING SEQUENCING TO IDENTIFY HEPATITIS B VIRUS
GENOTYPES AND Background: Hepatitis B Virus (HBV) can be
classified into 8 genotypes A through H based on an intergroup divergence
of 8% or more in the complete nucleotide sequence, and the different
distribution of various genotypes in different continents, countries. The
identification of HBV genotypes are more concerned as it is HBV genotypes
relating to clinical manifestation, activity of liver disease as well as
treatment responses of Hepatitis B. Additionally, the discovery of resistance
to medicines in HBV treatment plays a very important role from which we
can have an appropriate and effective choice in Hepatitis B treatment.
Objective and methods: We have applied the Sequencing by
OpenGene system with Trugene HBV Genotyping kit (Bayer) to identify
Hepatitis B Virus Genotypes and Lamivudine – resistant mutation. From
August 2004 to May 2006, in MEDIC laboratory, we have implemented
sequencing for 122 cases Vietnamese with Chronic Hepatitis B on
Lamivudine treatment.
Results: 97 cases are males (take 79.5%) and 25 cases are females
(take 20.5%), medium age: 33.9±10.4. All cases are HBVDNA [+] in which:
100 cases are HBeAg [+] (82.0%) and 22 cases are HBeAg [-] (18.0%). There

are only two genotypes of HBV: genotype B and genotype C, in which 76
cases are genotypes B (62.3%) and 46 cases are genotype C (37.7%). Totally
there are 78 cases (63.9%) mutations with following established proportion
and types: L180M & M204I (11.5%); L180M & M204V (36.1%); L180M,
M204V & V173L (0.8%); L180M, M204V & V207I (0.8%); M204I (12.3%);
M204I&V207I (0.8%); M204V (1.6%). There are 49 cases mutations in 76
cases of genotypes B (64.5%) and 29 cases in 46 cases of genotypes C
(63.0%). All patients are on Lamivudine treatment with average time is
2.5±0.9 years, the corresponding number of patients in treatment period of 1,
2, 3, 4 year are 18, 41, 45, 18. The proportion of developing mutations after 1,
2, 3, 4 years of treatment with Lamivudine is 27.8%; 63.4%; 71.1%; 83.3%.
Conclusions: We have found that - with above preliminary results -
the sequencing plays a very important role in identifying Hepatitis B Virus
Genotypes and Mutations. From those results we can approach an optimal
treatment course.
Đặt vấn đe
Những tiến bộ mới trong điều trị viêm gan do siêu vi B (HBV) đã góp
phần đáng kể trong việc hạn chế những biến chứng của bệnh. Cho đến nay
đã có 4 loại thuốc điều trị HBV đã được FDA (Food and Drug
Administration: Cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ) công nhận là
Interferone, Lamivudine, Adefovir và Entecavir
1,6,7,10,17
, trong đó
Lamivudine vẫn được xem là thuốc uống được lựa chọn đầu tiên. Tuy nhiên
trong quá trình điều trị Lamivudine đã có vấn đề phát sinh: Vấn đề đột biến
kháng Lamivudine của HBV, tỉ lệ đột biến kháng này xảy ra ngày càng cao
tăng theo thời gian dùng thuốc Lamivudine
1,6,18,19
.
Một vấn đề mới ngày càng được quan tâm là kiểu gen của HBV (HBV

Genotype). Khác với kiểu gen siêu vi viêm gan C (HCV) có vai trò quan
trọng trong việc đánh giá điều trị đặc hiệu thì vai trò của kiểu gen HBV chưa
được rõ ràng lắm. Sự phân bố của kiểu gen HBV thay đổi tùy theo vùng địa
dư, mỗi châu lục hay mỗi nước sẽ có các kiểu gen vượt trội khác nhau
4,8
.
Có nhiều kỹ thuật sinh học phân tử có thể dùng để xác định các đột
biến kháng thuốc của HBV cũng như xác định kiểu gen của HBV. Chúng tôi
sử dụng kỹ thuật giải trình tự chuỗi (Sequencing) để đồng thời vừa xác định
các đột biến kháng thuốc Lamivudine của HBV vừa xác định được kiểu gen
HBV, khảo sát kiểu gen nào vượt trội ở người Việt Nam cũng như đánh giá
các loại và tỉ lệ đột biến kháng Lamivudine theo thời gian điều trị
Lamivudine.
Mục tiêu của nghiên cứu này là: (1) Xác định kiểu gen của HBV ở bệnh
nhân Việt Nam; (2) Khảo sát các kiểu đột biến và tỉ lệ đột biến kháng
Lamivudine ở bệnh nhân điều trị Lamivudine liên tục.
Đối tượng - phương pháp nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu
Bệnh nhân người Việt Nam, đã được chẩn đoán viêm gan siêu vi B
mãn tính đang được điều trị liên tục bằng Lamivudine.
Các bệnh nhân được chia làm 4 nhóm với thời gian điều trị liên tục
Lamivudine tương ứng là 1, 2, 3, 4 năm.
Có xét nghiệm HBVDNA dương tính.
Không bị đồng nhiễm siêu vi viêm gan C.
Kỹ thuật thực hiện
Kỹ thuật giải trình tự chuỗi
Huyết thanh bệnh nhân được tách và lưu trong ống mẫu tinh sạch, nếu
mẫu chưa thực hiện ngay thì được lưu ở nhiệt độ – 20
0
C. DNA của HBV

được tách chiết theo nguyên tắc hấp thụ trên hạt Silicate (Phương pháp
BOOM) rồi rửa bằng Ethanol 70%. Thực hiện phản ứng trùng hợp chuỗi
(PCR) trên bộ thuốc thử TruGene HBV Genotyping (Bayer), máy luân nhiệt
Bio-Rad theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sau khi kiểm tra có sản phẩm
khuếch đại (Amplicons) bằng điện di trên thạch Agarose thì tiếp tục thực
hiện phản ứng cắt đoạn (Clip reaction) theo hướng dẫn của nhà sản xuất trên
máy luân nhiệt, tiếp tục thực hiện điện di trên thạch Acrylamide với hệ
thống OpenGene. Tín hiệu sẽ tự động thu nhận từ hệ thống điện di và phần
mềm máy tính sẽ sắp xếp trình tự chuỗi của mẫu, và trình tự chuỗi này sẽ
được so sánh với thư viện gen (Gene Librarian) có sẵn được cung cấp bởi
nhà sản xuất (Bayer). Kết quả thu nhận được là kiểu gen của HBV và các
đột biến kháng Lamivudine đã được công bố.
HBeAg
Kỹ thuật thực hiện theo phương pháp điện hóa phát quang, thuốc thử
của hãng Abbott, thực hiện trên máy Architect (Abbott).
Phương pháp nghiên cứu
Cắt ngang.
Thống ke
Phần mềm SPSS for Win, Ver. 7.5.
Kết qua
Tổng số có 122 trường hợp được thực hiện giải trình tự chuỗi:
- Tuổi nhỏ nhất là 10, lớn nhất là 63 với độ tuổi trung bình là 33,9
± 10,4.
- Nam có 97 trường hợp chiếm 79,5% và nữ có 25 trường hợp
chiếm 20,5%.
Kiểu gen của HBV trong 122 trường hợp:
Chỉ có 2 kiểu gen của HBV được xác định là kiểu gen B và C. Trong đó
kiểu gen B là 76 trường hợp (62,3%) và kiểu gen C là 46 trường hợp (37,7%).
Kết quả HBeAg
Tất cả 122 trường hợp đều có HBVDNA dương tính, trong đó HBeAg

âm tính là 22 trường hợp (18%) và HBeAg dương tính là 100 trường hợp
(82%). Kết quả của HBeAg trong các kiểu gen khác nhau cũng được ghi
nhận.
Bảng 1. Tỉ lệ HBeAg và các kiểu gen B, C.
Kiểu gen B Kiểu gen C

S
ố
lượng
Phần
trăm
S
ố
lượng
Phần
trăm
HBeAg
âm tính
12

15,8%

10

21,7%

HBeAg
dương tính
64

84,2%

36

78,3%

Kiểu gen HBV và các đột biến kháng Lamivudine
Bảng 2. Tỉ lệ của đột biến kháng Lamivudine và kiểu gen HBV.
Kiểu gen B Kiểu gen C


S
ố
lượng
Phần
trăm
S
ố
lượng
%
Không
có đ
ột biến
kháng
Lamivudine
27

35,5%

17

37%

Có đ
ột
bi
ến kháng
Lamivudine
49

64,5%

29

63%

Các kiểu đột biến kháng Lamivudine và tỉ lệ đột biến kháng
Lamivudine theo thời gian điều trị
Tổng cộng có 78 (63,9%) trường hợp có đột biến kháng Lamivudine.
Bảng 3. Tỷ lệ các loại đột biến kháng Lamivudine và tỉ lệ phần trăm.
L
o
ại đột
biến
L1
80M,
M204I
L1
80M,
M204V

L1
80M,
M204V
& V173L

L1
80M,
M204V
& V207I

M
204I
M
204I,
V207I
M
204V
S
ố
lượng
14

44

1 1 15

1 2
T
ỉ lệ %
11,

5
36,
1
0.8

0,8

12
,3
0,
8
1,6

Ghi chú: L (Leucine); M (Methionine); I (Isoleucine);
V (Valine).
Có 4 nhóm bệnh nhân được khảo sát dựa trên thời gian điều trị
Lamivudine, số lượng bệnh nhân sau 1, 2, 3, 4 năm điều trị Lamivudine
tương ứng là 18, 41, 45, 18 trường hợp. Thời gian điều trị Lamivudine trung
bình là 2,5 ± 0,9 năm.
Bảng 4. Tỉ lệ đột biến kháng Lamivudine và thời gian điều trị
Lamivudine.
1 năm 2 năm 3 năm 4 năm

S
ố
lượng

Ph
ần trăm

S
ố
lượng

Ph
ần trăm

S
ố
lượng

Ph
ần trăm

S
ố
lượng

Ph
ần trăm

Kh
ông có
đ
ột biến
kháng
Lamivudi
ne
1
3

72,
2%
1
5
36,
6%
1
3
28,
9%
3
16,
7%
Có
đ
ột biến
kháng
Lamivudi
ne
5
27,
8%
2
6
63,
4%
3
2
71,
1%

1
5
83,
3%
Bàn luận
Kiểu gen HBV
Có 2 cách phân loại HBV
Kiểu huyết thanh (Serotype) và kiểu gen (Genotype). Trước đây người
ta phân HBV thành 4 kiểu huyết thanh adr, adw, ayr và ayw dựa vào các
kháng nguyên của kháng nguyên bề mặt HBV (HBsAg). Tuy nhiên những ý
nghĩa của kiểu huyết thanh chưa được nghiên cứu nhiều. Với sự phát triển
của sinh học phân tử, ngày nay người ta phân loại HBV dựa vào nghiên cứu
trên bộ gen của HBV và phân HBV thành 8 loại đặt tên từ A đến H dựa vào
sự khác nhau trên 8% của toàn bộ bộ gen của HBV
4,6,8
. Có nhiều kỹ thuật
dùng để xác định kiểu gen HBV
8,13
như kỹ thuật giải trình tự chuỗi
(Sequencing), sự đa hình của các đoạn cắt giới hạn (RFLP), phản ứng lai các
đoạn dò (LiPA), phản ứng trùng hợp chuỗi với các đoạn mồi đặc hiệu (PCR
with Specific Primers), phản ứng miễn dịch gắn men (Enzyme-linked
immunoassay) Kỹ thuật chúng tôi dùng để xác định kiểu gen của HBV là
kỹ thuật giải trình tự chuỗi vì bên cạnh việc xác định được kiểu gen của
HBV chúng tôi còn tìm được các đột biến kháng Lamivudine chỉ trong một
lần thực hiện giải trình tự chuỗi.
Vai trò của kiểu gen HBV chưa được nghiên cứu nhiều cũng như có
nhiều nghiên cứu với số liệu nhỏ, rãi rác công bố với kết quả không phù hợp
nhau, điều này khác với vai trò của kiểu gen HCV trong vấn đề điều trị viêm
gan siêu vi C

4,11,23
.
Kiểu gen của HBV phân bố ở các châu lục và vùng lãnh thổ khác nhau
thì khác nhau. Kiểu gen HBV chủ yếu ở Đông Nam Á là kiểu gen B và C
4,14
,
điều này cũng phù hợp với kết quả của chúng tôi với 122 trường hợp thực hiện
giải trình tự chuỗi có 76 trường hợp (62,3%) kiểu gen B và 46 trường hợp (37,7%)
kiểu gen C. Trong 122 trường hợp thực hiện giải trình tự chuỗi (HBV DNA
dương tính) chúng tôi ghi nhận trong đó HBeAg âm tính là 22 trường hợp (18%)
và HBeAg dương tính là 100 trường hợp (82%). Có vài nghiên cứu đã được công
bố cho thấy đối với kiểu gen B của HBV có thải trừ HBeAg cao hơn so với kiểu
gen C
4,5,16
. Tuy nhiên kết quả của chúng tôi (Bảng 1) không có sự khác biệt rõ rệt
giữa tỉ lệ HBeAg âm tính ở kiểu gen B và C (15,8% và 21,7%). Vai trò của kiểu
gen HBV trong diễn tiến của bệnh viêm gan siêu vi B cũng được nghiên cứu, kết
quả cho thấy kiểu gen C dường như làm cho rối loạn chức năng gan nhiều hơn
kiểu gen B cũng như kiểu gen C dễ diễn tiến đến xơ gan nhiều hơn kiểu gen
B
4,6,8,11
. Mối liên hệ giữa kiểu gen HBV và ung thư tế bào gan cũng được ghi
nhận: Kiểu gen B thường kết hợp với sự phát triển ung thư tế bào gan ở người trẻ
tuổi, một nghiên cứu khác lại cho thấy kiểu gen C thường kết hợp với ung thư tế
bào gan và có tỉ lệ tái phát ung thư tế bào gan cao hơn sau khi được phẫu thuật cắt
bỏ ung thư tế bào gan so với kiểu gen B
4,6,15
. Anh hưởng của kiểu gen HBV với
đáp ứng điều trị Lamivudine cũng chưa được nghiên cứu nhiều, một nghiên cứu
cho thấy dường như bệnh nhân kiểu gen B dễ phát triển đột biến kháng

Lamivudine hơn các kiểu gen khác
4
, cũng như kiểu gen D có đột biến kháng
Lamivudine cao hơn kiểu gen A
2
. Kết quả của chúng
tôi ghi nhận (Bảng 2) tỉ lệ có đột biến kháng Lamivudine ở kiểu gen B
(64,5%) và kiểu gen C (63%) là gần bằng nhau. Do đó các vấn đề về ảnh hưởng
của kiểu gen HBV cần phải được nghiên cứu lâu dài và số lượng bệnh nhân nhiều
hơn.
Các kiểu và tỷ lệ đột biến kháng Lamivudine ở bệnh nhân điều trị
Lamivudine
Lamivudine là thuốc uống được lựa chọn đầu tiên trong điều trị viêm
gan siêu vi B mãn tính vì có nhiều ưu điểm như giá thành có thể chấp nhận
được, an toàn, ít tác dụng phụ, dễ sử dụng (Dùng đường uống), tuy nhiên có
một nhược điểm mà ngày càng được nhiều người quan tâm là vấn đề đột
biến kháng Lamivudine của siêu vi viêm gan B và tỉ lệ đột biến kháng thuốc
Lamivudine tăng theo thời gian sử dụng Lamivudine.
Vị trí đột biến kháng Lamivudine xảy ra trên vùng C (Domain C)
của đoạn gen sao chép ngược (RT: Reverse Transcriptase) của HBV chủ yếu
là kiểu YMDD (tyrosine-methionine-aspartate-aspartate), ở đó Methionine
sẽ được thay bằng Valine, Isoleucine và hiếm khi là Serine (Đột biến
rtM204V/I/S). Những đột biến khác cũng liên quan đến kháng Lamivudine
như đột biến thay Leucine thành Methionine ở vùng B (Domain B) là đột
biến rtL180M; Đột biến V173L; Đột biến V207I
3,9,12,19,20,21,24
. Trong 122
trường hợp giải trình tự chuỗi thì có 78 trường hợp (63,9%) có đột biến
kháng Lamivudine. Có nhiều kiểu đột biến kháng Lamivudine, chủ yếu là
đột biến ở vị trí 204 và có kèm hoặc không các đột biến rtL180M, V173L,

V207I. Kết quả của chúng tôi cho thấy có rất nhiều dạng của đột biến kháng
Lamivudine (Bảng 3) trong đó chiếm nhiều nhất là đột biến rtL180M và
M204V (36,1%).
Lamivudine được dùng điều trị viêm gan siêu vi B thường với thời
gian điều trị kéo dài, tối thiểu phải là 1 năm. Nhiều nghiên cứu đã công bố
cho thấy tỉ lệ xuất hiện đột biến kháng Lamivudine của HBV lại tăng dần
theo thời gian điều trị Lamivudine. Theo Guan R. và cộng sự, tỉ lệ xuất hiện
đột biến kháng Lamivudine sau 1 năm điều trị Lamivudine là 14%, và tỉ lệ
này tăng dần theo thời gian điều trị Lamivudine là 38%, 49%, 66% và 69%
tương ứng với thời gian điều trị Lamivudine là 2, 3, 4, và 5 năm
1
. Một
nghiên cứu khác của T-T Chang và cộng sự cũng đã cho thấy tỉ lệ đột biến
kháng Lamivudine sau một năm điều trị Lamivudine là 17%, và tăng dần
theo thời gian điều trị Lamivudine 2, 3, 4 năm tương ứng là 40%, 57%,
67%
22
. Kết quả khảo sát tỉ lệ có đột biến kháng Lamivudine trong 4 nhóm
bệnh nhân có điều trị liên tục Lamivudine với 4 nhóm thời gian điều trị khác
nhau (Bảng 4) của chúng tôi cũng cho thấy tỉ lệ có đột biến kháng
Lamivudine sau 1 năm điều trị Lamivudine là 27,8%, và tỉ lệ này cũng tăng
dần theo các nhóm có thời gian điều trị Lamivudine tăng dần là 2, 3, 4 năm
là 63,4%, 71,1% và 83,3%. So sánh với các công trình đã công bố chúng ta
có thể thấy rằng tỉ lệ có đột biến kháng Lamivudine sau một thời gian điều
trị bằng Lamivudine ở nghiên cứu của chúng tôi cao hơn. Có rất nhiều
nguyên nhân ảnh hưởng đến việc xuất hiện đột biến kháng Lamivudine trong
quá trình điều trị, tuy nhiên có một yếu tố quan trọng có thể làm cho tỉ lệ đột
biến kháng Lamivudine cao là vấn đề sử dụng thuốc Lamivudine có đúng
theo hướng dẫn bác sĩ điều trị không, điều trị Lamivudine thành nhiều đợt
khác nhau trước khi bệnh nhân được đưa vào nhóm nghiên cứu. Kết quả này

cho chúng ta thấy một tỉ lệ khá cao của đột biến kháng Lamivudine, và việc
phát hiện đột biến kháng Lamivudine kịp thời giữ một vai trò cực kỳ quan
trọng trong quá trình điều trị viêm gan siêu vi B bằng Lamivudine để từ đó
chúng ta có thể thay đổi thuốc điều trị thích hợp nhằm đạt được mục tiêu
điều trị.
Kết luận
Kiểu gen HBV ở Việt Nam chủ yếu là B và C, tuy nhiên vai trò của
kiểu gen HBV trong diễn tiến bệnh cũng như đáp ứng điều trị chưa được biết
rõ. Các kiểu đột biến kháng Lamivudine của nhóm bệnh nhân chúng tôi thì
đa dạng, đặc biệt tỉ lệ đột biến kháng thuốc Lamivudine cao và tăng dần theo
thời gian dùng thuốc Lamivudine. Qua kết quả bước đầu đạt được chúng tôi
thấy rằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi giữ một vai trò rất quan trọng và có thể
được áp dụng như một xét nghiệm thường qui trong việc xác định kiểu gen
siêu vi viêm gan B cũng như việc nhận diện được các đột biến kháng thuốc
Lamivudine để từ đó chúng ta có một phác đồ điều trị tối ưu.