Sự di truyền tính trạng chiều dài và chiều rộng là đòng và lá công năng trong các tổ hợp lai giữa dòng lúa dự đột biến và các giống lúa tẻ cao sản không thơm

THIẾT LẬP BẢN ĐỒ GEN RẦY NÂU TRÊN QUẦN
THỂ F2 CÂY LÚA (ORYZA SATIVA)

Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu
Viện Lúa Đồng Băng Sông Cửu Long

I. MỞ ĐẦU

Tính kháng sâu, bệnh hại lúa là mục tiêu quan trọng
trong chương trình cải tiến giống lúa. Tuy nhiên, tính
kháng sâu bệnh thường bị phá vỡ sau vài năm giống được
đưa ra sản xuất. Chiến lược chồng gen kháng nhờ sự giúp
đỡ của Chỉ thị ADN, với nguồn gen được khai thác từ lúa
hoang, lúa địa phương đang được khuyến khích. Chúng ta
vẫn chưa biết hết những bí ẩn của tương tác giữa ký sinh và
ký chủ, sự phá vở tính kháng do sức ép chọn lọc cao. Thí
dụ như tính kháng rầy nâu và bệnh đạo ôn được điều khiển
bởi gen đơn, nhưng sự thể hiện tính kháng này vô cùng
phức tạp, người ta phải sử dụng thuật ngữ "complex", vì
tính kháng không ổn định trong điều kiện thâm canh cao và
chiến lược quản lý giống trong sản xuất không hợp lý, sự
biến dị trong pathogen hoặc loại hình sinh học (biotype).
Việc áp dụng các tiến bộ kỹ thuật marker phân tử trong
chọn giống lúa chống chịu sâu bệnh hại chính đang được
phát triển. Với sự thuận lợi của những chỉ thị trên cơ sở kỹ
thuật PCR, chúng ta đã giảm rất nhiều chi phí nghiên cứu
so với sử dụng RFLP.Tuy nhiên để chọn lựa chỉ thị nào liên
kết với một gen kháng bệnh, bản đồ di truyền của gen phải
được thiết lập.

Lập bản đồ di truyền trên cây lúa bằng chỉ thị phân tử

Mc. Couch và ctv (1988) thiết lập bản đồ liên kết gen
trên cây lúa đầu tiên với RFLP bao gồm 135 loci. Bản đồ
phủ trên 12 nhiễm sắc thể với chiều dài tổng cộng 1.389
cM trên hệ gen cây lúa từ cặp lai IR34583 (indica) và Bulu
Dalam (javanica).

Ba năm sau đó, bản đồ thứ hai được thiết lập từ quần thể
IRAT117(japonica) và Apura (indica) (Mc Couch 1991,
Tanksley và ctv 1991). Một nhóm tác giả khác là Saito và
ctv (1991) thiết lập một bản đồ di truyền dựa trên cặp lai
Kasalath (indica) và Fl134 (japonica) với 347 chỉ thị RFLP,
phủ trên 12 nhiễm sắc thể, với chiều dài tổng cộng 1.836
cM trên hệ gen cây lúa.

Causse và ctv (1994) thiết lập một bản đồ khác dùng chỉ thị
RFLP để xây dựng bản đồ di truyền từ quần thể hồi giao
(backcross) giữa O.sativa (dạng hình indica) và
O..longistaminata. Chúng bao gồm những chỉ thị từ hệ gen
cây lúa với ký hiệu RG và RZ , từ lúa mì với ký hiệu CDO
và lúa mạch với ký hiệu BCD. Tổng số 600 chỉ thị phủ trên
12 nhiễm sắc thể.

Kurata và ctv (1994) dùng quần thể F
2
của Nipponbare
(japonica) và Kasalath (indica) để thiết lập lập bản đồ di
truyền. Bản đồ được bao phủ trên 12 nhiễm sắc thể với
tổng cộng chiều dài 1.575 cM. Vịệc thiết lập bản đồ trên
tâm động (centromere) cũng được thực hiện với 170 chỉ thị

RFLP (Singh và ctv. 1996).

Lập bản đồ cho gen rầy nâu

Đối với rầy nâu, việc dùng chỉ thị trên cơ sở kỹ thuật
PCR, để lập bản đồ gen rất phức tạp và khó khăn. Ishii và
ctv. (1994) đã thiết lập bản đồì RFLP và xác định gen Bph-
10 kháng biotype 2 và 3, định vị trên nhiễm sắc thể 12 liên
kết với RG457. Cặp primer được thiết kế từ RG457 (chỉ thị
STS ) đã phát hiện được gen kháng rầy nâu Bph-10 với
khoảng cách di truyền 1.7 cM trên quần thể lúa hoang
Oryza australiensis và những dòng con lai có xuất xứ từ
loài lúa hoang này (Lang và ctv. 1999). Trong báo cáo này,
chúng tôi muốn trình bày tính khả thi của việc sử dụng vật
liệu lúa địa phương để xây dựng quần thể con lai, áp dụng
trong kỹ thuật thiết lập bản đồ liên kết gen với chỉ thị phân
tử trên cơ sở kỹ thuật PCR, nhằm phát hiện gen kháng rầy
nâu, kháng bệnh đạo ôn và bạc lá, phục vụ chiến lược MAS
(chọn giống nhờ chỉ thị phân tử)

II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Quần thể con lai từ những vật liệu sau đây để nghiên cứu
tính kháng rầy nâu



Thanh lọc rầy nâu : quần thể con được thử và đánh gía
kháng rầy nâu

+ Nguồn rầy nâu thu thập tại Viện Lúa Ô Môn.

+ Các dụng cụ nuôi rầy và thanh lọc rầy , trong nhà lưới.

+ Giống lúa mùa Tài nguyên và TN1 được cung cấp làm
thức ăn cho rầy

Thanh lọc theo phương pháp hộp mạ của IRRI,ba lần nhắc
lại, giống TN 1, IR 64 làm chuẩn nhiễm và PTB 33, Hoa
Lài làm chuẩn kháng. Khi cây mạ ở giai đoạn 2 đến 3 là,
tiến hành thả rầy tuổi 1 đến 3, mật số 4-6 con / cây.

Quan sát lúc giống TN 1 cháy rụi (cấp 9), đánh giá cấp hại
đối với vật liệu thí nghiệm theo thang điểm 9 cấp của IRRI.

Phương pháp phân tích PCR-based MAS

Chỉ thị STS theo phương pháp Lang 2002

Microsatellite: Sản phẩm PCR được chuẩn bị trong
10mM Tris-HCl (pH 8), 50mM KCl, 1.5mM MgCl
2
, 1 unit
của TAKARA Taq, 4 nmol dNTP, 10pmol primer và 50ng
ADN. Sử dụng thermal cycler 9600 (Perkin-Elmer), chu kỳ
nhân gen được thiết kế như sau: tách dây đơn ở 95
o
C trong
5 phút, tiếp theo đó là 35 chu kỳ: 94
o

C trong 60 giây, 55
o
C
trong 30 giây, 72
o
C trong 60 giây. Lần kéo dài phản ứng
cuối là 72
o
C trong 5 phút. Sau khi thực hiện PCR, chúng tôi
thêm vào 13l dung dịch đệm (98% formamide, 10mm
EDTA, 0.025% bromophenol blue, 0.025% xylene cyanol.
Mức độ đa hình của sản phẩm PCR được phát hiện nhờ
ethidium bromide sau khi điện di trên 5% agarose gel.
Microsatellite marker được ghi nhận sự có băng kháng và
nhiễm theo số 1 (chống chịu mặn) và 2 (nhiễm).
Thiết lập bản đồ: nhờ phần mềm MAPMARKER version
3.0

III.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

IV.1. Xây dựng các tổ hợp lai và quần thể con lai

Vật liệu bao gồm các giống lúa địa phương cổ truyền,
giống lúa cải tiến trong chương trình lai, với giống đối
chứng kháng quốc tế là PTB33 giống chuẩn nhiễm là TN1.

Sử dụng quần thể F
2
của tổ hợp lai IR64 / HOALAI. Thu
hoạch hai hạt trên mỗi bông của mỗi cá thể F

2
để theo dõi
sự phân ly ở F
3
. Quần thể F
2
của tổ hợp lai
IR54742/IR31917, PTB33 / TN1 được phân tích kiểu gen
với chỉ thị STS và quần thể ì F
2
của IR 64 / Hoa Lài được
phân tích với microsatellite marker.

Rầy nâu dung chỉ thị STS

Quần thể F
2
của tổ hợp lai ì PTB33 / TN1 được phân
tích kiểu gen với chỉ thị STS
Bản đồ liên kết gen RFLP đã đánh dấu gen Bph-10 với chỉ
thị RG457 trên nhiễm sắc thể 12 (Ishi và 1994). Sau đó,
một loạt các cặp primer đã được thiết kế để sử dụng PCR
trong việc tìm kiếm gen kháng ở quần thể con lai (Lang và
ctv.1999). Giống PTB33 có nguồn gốc từ ấn Độ, kháng rầy
nâu biotype 2 và 3. Giống TN1 nhiễm rất nặng đối với tất
cả biotype của rầy nâu được biết.(hình 1)

Kết qủa đánh giá kiểu hình cóí 12 / 50 cây kháng, 11/50
cây nhiễm và 27/50 cây kháng trung bình, theo tỉ lệ phân ly
Mendel ở F

2
là 1:2:1

Hình 1 Đánh giá kiểu hình trên hộp mạ rầy nâu, bố, mẹ và
con lai F
2