CHƯƠNG IV. CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐƠN pptx

3/24/2011
1
CHƯƠNG IV.
CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY
TẾ BÀO ĐƠN
• “Mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm nhiều
đơn vị nhỏ các tế bào hợp thành“ hay “Tế bào
là đơn vị sống căn bản của mọi cấu trúc thực
vật” (Schleiden và Schwann, 1838).
• Đến năm 1960, Melcher và Bergman là những
tác giả đầu tiên tách và nuôi cấy thành công
tế bào đơn của thực vật trong các bình lên
men với môi trường nhân tạo.

Sản phẩm biến dưỡng của
thực vật
• Sản phẩm sơ cấp: carbohydrate, acid
béo, acid amine,…
• Sản phẩm thứ cấp: alkaloid, nicotine,
berberin, ginsenosid, palitaxel,…
 Sản phẩm thứ cấp giúp đáp ứng
stress, phòng vệ chống vi sinh vật, côn
trùng,…
Ví dụ về hợp chất thứ cấp
Hợp chất ginsenosid
từ cây Nhân sâm (
Panax
ginseng
)
:
• Tác dụng đến hệ thần

kinh trung ương;
• Gia tăng sức đề kháng;
• Tăng cường co bóp cơ
tim
• Hạ đường huyết

Ví dụ về hợp chất thứ cấp
Hợp chất ginsenosid
từ cây Sâm Ngọc Linh
(
Panax vietnamensis
Ha
et Grutzv.)

Ví dụ về hợp chất thứ cấp
• Đan sâm, Đảng sâm, Giác sâm, Hải quy
sâm, Hồng sâm, Khổ sâm, Sa sâm, Sâm
bòng bong, Sâm bố chính, Sâm chèo mèo,
Sâm cuốn chiếu, Sâm đại hành, Sâm đất,
Sâm lông, Sâm nam, Sâm ớt,…
• Sâm Ngọc Linh, Sâm Tam Thất, Sâm Nam
(Ngũ gia bì), Sâm Vũ Diệp (Trúc tiết Nhân
sâm)


3/24/2011
2
• Giới : Plantae
• Ngành : Magnoliophyta
• Lớp : Magnoliopsida

• Bộ : Apiales
• Họ : Araliaceae
• Chi : Panax
Ví dụ về hợp chất thứ cấp
Ví dụ về hợp chất thứ cấp
Saponin:
• Làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi lắc
với nước, có tác dụng nhũ hóa và tẩy sạch.
• Làm vỡ hồng cầu ngay ở những nồng độ rất loãng.
• Độc với cá và động vật máu lạnh; có tác dụng diệt
những loài thân mềm như giun, sán, ốc sên.
• Kích ứng niêm mạc, gây hắt hơi, đỏ mắt.
• Có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các
chất 3-ß-hydroxysteroid khác


Ví dụ về hợp chất thứ cấp
• Saponin steroid phân bố hẹp, được tìm
thấy trong những loài cây một lá mầm và
một ít cây hai lá mầm: Araliaceae,
Agavaceae, Smilacaceae,
• Trong cây, saponin thường tích lũy ở
những bộ phận khác nhau: tích lũy ở quả
như bồ kết, bồ hòn; tích lũy ở rễ như cam
thảo, viễn chí, cát cánh; tích lũy ở lá như
dứa Mỹ,… Hàm lượng trong cây thường rất
cao có một số trường hợp lên đến 10 %


Ví dụ về hợp chất thứ cấp

Hợp chất taxol từ
cây Thông đỏ (
Taxus
wallichiana
Zucc.):



Vt liu thc vt
Tc đ sinh tng
hp đc bit
Hm lưng
paclitaxel TB
(% trng lưng
khô)
V cây trưng thnh
(100 năm tui)
4.70 x 10
-6
mg/g/day
0.017
Cây con
(4 năm tui)
0.34 x 10
-6

mg/g/day
0.005
Nuôi cy mô 0.64 mg/l/day 0.200
Taxomyces andreanae

400 x 10
-6

mg/l/day
-
Tế bào thực vật có thể được nuôi
cấy trong các hệ thống thích hợp
để sản xuất ra những hợp chất thứ
cấp với sản lượng cao hơn cây
nguyên vẹn


3/24/2011
3
Những hợp chất được tạo ra trong
công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật
để s dụng làm thuốc bao gồm: diosgenin,
codeine, morphine, atropine, hyoscy-
amine, scopolamine, digoxin, digitoxin,
quinine, reserpine, artemisinin
Quá trình nuôi cấy



Điểm khác biệt giữa nuôi cấy
tế bào đơn thực vật và VSV
• Mức độ vô trùng
• Tồn tại dưới dạng huyền phù
• Tốc độ phân chia  sinh khối
• Phương thức sinh dưỡng

• Các chất được tạo ra trong quá trình
trao đổi chất
Ưu điểm
• Điều kiện nuôi cấy có thể được kiểm soát
và có thể được tối ưu cho việc sản xuất
sản phẩm trao đổi chất thứ cấp.
• Tế bào có thể được chọn lọc và cải thiện
bằng cách nhân dòng, gây đột biến hoặc
biệt hóa dùng phương pháp hóa học hoặc
phương pháp sinh học.
• Có thể dễ dàng nghiên cứu chuyển hóa
các chất trong tế bào và cơ chế sản xuất
sản phẩm trao đổi chất thứ cấp.

Đặc điểm sinh lý của tế bào
đơn trong nuôi cấy
• Nguyên liệu để nuôi cấy tế bào đơn trong môi
trường lỏng là những tế bào mô sẹo.
• Trong quá trình phát triển trong môi trường
lỏng, các tế bào đơn của thực vật thường phát
triển qua bốn giai đoạn: thích nghi, tăng trưởng,
cân bằng và suy tàn.
Đặc điểm sinh lý của tế bào
đơn trong nuôi cấy
Tế bào đơn phát triển thành dòng tế bào có
các đặc tính sau:
• Tách riêng từng tế bào dễ dàng;
• Các tế bào có độ đồng nhất cao;
• Tế bào có nhân to, nguyên sinh chất đậm đặc
• Có chứa nhiều hạt tinh bột;

• Có khả năng phân chia trong khoảng 24-72h;
• Bị mất tính toàn thế;
• Bị tăng mức bội thể.
3/24/2011
4
Những yếu tố ảnh hưởng đến
nuôi cấy tế bào đơn
• Các chất điều hòa sinh trưởng: làm tăng quá
trình phân bào, kích thích quá trình biệt hóa,
tạo ra sản phẩm thứ cấp,…
• Các nguồn dinh dưỡng: đạm, nguồn carbon, vi
lượng, ánh sáng,…

Công nghệ nuôi cấy tế bào đơn
thu nhận sản phẩm thứ cấp
Điểm cần lưu ý
• Không nên nuôi cấy tế bào đơn một cách đại trà
mà không tính toán đến khả năng tạo ra những
sản phẩm đặc biệt của loài thực vật đó.
• Không phải tất cả các cơ quan đều có khả năng
tạo ra chất mà ta quan tâm.
• Trong quá trình nuôi cấy, luôn luôn phải tiến
hành tuyển chọn để nâng cao năng suất tạo ra
các sản phẩm bậc 2.
• Bổ sung cơ chất tương ứng.
• Tìm ra môi trường đặc hiệu cho từng loại tế bào


Phương pháp làm tăng sản
lượng

• Điều kiện môi trường thích hợp
• Chọn lựa chủng có năng suất cao
• Biến đổi tiền chất
• X lý với các chất cảm ứng
• Cố định tế bào
• Tiết sản phẩm ra môi trường
• Gây đột biến tế bào
• Phát sinh hình thái
Điều kiện môi trường thích
hợp
• Thành phần các chất trong môi trường
nuôi cấy, chất điều hòa sinh trưởng thực
vật, pH, nhiệt độ, độ thông khí, độ lay
chuyển, ánh sáng,…
• Auxin thường được bổ sung vào môi
trường để cảm ứng sự tạo mô sẹo, và nó sẽ
được giữ lại với một hàm lượng rất thấp
hoặc loại bỏ hẳn để tế bào sản xuất các
chất biến dưỡng.

Mô sẹo của
Oxalis reclinata
dưới ánh sáng có màu vàng,
nhưng khi được chuyển sang điều kiện tối thì có màu đỏ vì
chúng bắt đầu sản xuất sắc tố anthocyanin có màu đỏ.
3/24/2011
5
Lựa chọn chủng có khả năng
sản xuất cao
• Các đặc tính sinh lý của mỗi tế bào riêng

lẻ không luôn thống nhất với nhau.
• Việc chọn dòng tế bào là một kỹ thuật
hữu hiệu để tăng lượng sản phẩm thứ cấp
và nên áp dụng phương pháp này rộng rãi.
Biến đổi tiền chất và biến đổi
sinh học
• Việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy các
tiền chất thích hợp hoặc các hợp chất có
liên quan đôi khi kích thích sự sản xuất
các hợp chất thứ cấp.
• Thay vì bổ sung một hợp chất đặc biệt
như một tiền chất vào môi trường nuôi
cấy tế bào thực vật, người ta còn có thể
s dụng tế bào thực vật nuôi cấy để biến
đổi các cơ chất thích hợp thành sản phẩm
mong muốn.

Ví dụ về biến đổi sinh học trong nuôi cấy tế bào:
Coniferin được bổ sung vào huyền phù tế bào
Podophyllum
hexandrum
và podophyllotoxin được tạo ra.
Podophyllotoxin được s dụng để sản xuất thuốc trị ung thư.
X lý với các chất cảm ứng
(elicitor)
• Khi vi sinh vật xâm nhiễm vào một thực
vật nguyên vẹn thường cảm ứng sự tạo ra
các hợp chất thứ cấp.
• Tác động kích thích của chúng rất đáng
kể nếu như một chất cảm ứng thích hợp

được chọn lựa để kích thích sự tổng hợp
các hợp chất thứ cấp.
Elicitor > Elicitor recognition > Enzyme
synthesis > Phytoalexin synthesis


3/24/2011
6

Elicitor Loi TV Sn phm
Phytophthora megasperma
Glycine max
Soybean
Glycollin
Fungal homogenate Ruta gravolens Acridone exposides
Phytium aphanidermatum
Catharanthus roseus
Periwinkle
Strictosidine lactam
Ajmaciline
Tabersonine
Lochnericine
Catharanthine
Botrytis
Colletotrichum
Verticillium
Altenaria
Arachidonic acid
Chitosan
Nigram

Papaver somniferum
Opium poppy
Sanguinarine
Cố định tế bào
Một hệ thống cố định có thể duy trì sự
sống của tế bào qua một khoảng thời gian
dài và phóng thích phần lớn sản phẩm ra
môi trường ngoại bào ở dạng ổn định:
• Sự cố định thường bị hạn chế
• Sinh khối ban đầu phải được nuôi cấy
dạng huyền phù tế bào
• Sản phẩm bắt buộc tiết ra môi trường
• Sản phẩm bị thoái biến
• Ngăn cản sự khuếch tán của tế bào
Tiết sản phẩm ra môi trường
• Có thể làm tăng khả năng sản xuất những
hợp chất thứ cấp bằng cách kích thích
cho chúng được tiết ra ngoài môi trường.
• Để làm tăng sự tiết sản phẩm ra môi
trường, người ta cố gắng làm tăng tính
thấm của màng tế bào những kết quả đạt
được vẫn rất hạn chế.
Gây đột biến tế bào
• Các dạng đột biến điều hòa và đột biến
khuyết dưỡng được s dụng rộng rãi để
sản xuất ra rất nhiều loại sản phẩm như
amino acid, nucleotide, kháng sinh,…
• Sự gia tăng hoạt động biến dưỡng bằng
cách s dụng các đột biến điều hòa có thể
thực hiện được về mặt lý thuyết và việc

chọn lọc các kiểu tế bào đồng dạng cho
mục đích này là một yếu tố quan trọng để
sản xuất ra các loại sản phẩm khác nhau.
Phát sinh hình thái
• Có một mối quan hệ giữa sự phản phân hóa
của tế bào với khả năng sản xuất ra các
hợp chất thứ cấp nhưng vẫn chưa rõ rằng
sự sản xuất các hợp chất thứ cấp có phụ
thuộc vào sự phát triển của các cấu trúc
chuyên biệt hay không hay những quá
trình này có liên quan với nhau về đặc
tính di truyền và đặc tính sinh lý?
• Nuôi cấy lông rễ (chuyển plasmid Ri vào
vết thương trên mô)