CHƯƠNG II CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ & TẾ BÀO THỰC ppsx

2/28/2011
1
CHƢƠNG II
CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ
& TẾ BÀO THỰC VẬT
Nguồn gốc sự sống?
• Các nhà khoa học theo thuyết tự sinh:
đất ẩm  cỏ dại, bùn  lươn,…  Sự
sống tự sinh (ngẫu nhiên)
• Pasteur: sữa để lâu  chua  sinh vật
có nguồn gốc từ sinh vật
Nguồn gốc sự sống?

Tính toàn thế
Sinh vật duy trì nòi giống
như thế nào?
Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật
= Thuật ngữ mô tả các phương pháp
nuôi cấy các bộ phận thực vật trong
ống nghiệm có chứa môi trường dinh
dưỡng thích hợp trong điều kiện vô
trùng.
Lịch sử phát triển
• Năm 1902, Haberlandt lần đầu tiên đưa ra ý
tưởng cấy mô của sinh vật ra ngoài cơ thể.
• Năm 1934, White đã thành công trong việc
phát hiện ra sự sống vô hạn của việc nuôi cấy tế
bào rễ cà chua.
• Năm 1962, Murashige và Skoog đã cải tiến môi
trường nuôi cấy đánh dấu một bước tiến trong
kỹ thuật nuôi cấy mô.

• Năm 1960 – 1964, Morel nhân giống vô tính lan
bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng  thương mại
hóa.
2/28/2011
2
Tầm quan trọng của kỹ thuật nuôi
cấy mô và tế bào thực vật
• Về mặt lý luận sinh học cơ bản
• Về mặt thực tiễn sản xuất
Các bƣớc nhân giống
in vitro

B 1
B 4
B 5
1. Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy
2. Tạo thể nhân giống
3. Nhân giống in vitro
4. Tái sinh cây hoàn chỉnh
5. Chuyển cây con ra vườn ươm
B 2
B 3
1. Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy
• Khi lựa chọn mô cấy cần lưu ý đến tuổi sinh lý
của cơ quan được dùng làm mẫu cấy, vụ mùa lấy
mẫu, chất lượng của cây lấy mẫu, kích thước và
vị trí lấy mẫu đó.
• Mẫu cấy sau khi chọn lựa được rửa sạch bằng xà
phòng và khử trùng bề mặt bằng các chất khử
trùng hóa học như calcium hypochloride,

chlorur thủy ngân,
2. Tạo thể nhân giống
in vitro

• Mẫu được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng
thích hợp để tạo thể nhân giống
in vitro
.
• Có 2 thể nhân giống
in vitro
là thể chồi và thể
cắt đốt. Tạo thể nhân giống
in vitro
phụ thuộc
vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây
trồng.
• Đối với những loài không có khả năng nhân
giống, người ta thường nhân giống bằng cách
tạo cụm chồi từ mô sẹo.
3. Nhân giống
in vitro

• Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, môi trường
nuôi cấy thường giống môi trường tạo thể chồi,
đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho
phù hợp với quá trình nhân giống kéo dài.
• Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình
tăng sinh diễn ra nhanh. Cây nhân giống
in vitro

ở trạng thái trẻ hóa và được duy trì trong thời
gian dài.
4. Tái sinh cây
in vitro
hoàn chỉnh
• Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy
đủ thân, lá và rễ để chuẩn bị chuyển ra vườn
ươm. Cây con phải khỏe mạnh để nâng cao sức
sống khi ra môi trường bình thường.
• Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ,
thay vào đó là các chất kích thích quá trình
tạo rễ. Điều kiện nuôi cấy gần với điều kiện tự
nhiên bên ngoài.
2/28/2011
3
5. Chuyển cây con ra vƣờn ƣơm
• Cây con đã ra rễ được lấy khỏi ống nghiệm, rửa
sạch agar và được đặt trong chậu nơi có bóng
râm, độ ẩm cao, cường độ chiếu sáng thấp,
• Đây là giai đoạn rất quan trọng trong quy trình
nhân giống vô tính vì cây con thường bị chết do
sự khác biệt về điều kiện sống giữa
in vitro
và
ex vitro
.
Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình
nuôi cấy mô thực vật
Mẫu cấy
Môi trường nuôi cấy

Ánh sáng
Độ thoáng khí
1. Ảnh hƣởng của mẫu cấy
 Kiểu di truyền:
• Những cây hai lá mầm thông thường có khả
năng tái sinh mạnh hơn cây một lá mầm và cây
hạt trần rất khó tái sinh.
• Nếu một loài dễ tái sinh cơ quan trong môi
trường tự nhiên thì chúng hầu như dễ tái sinh
in vitro
.
• Trong một số cây hai lá mầm thì Solanaceae,
Begoniaceae, Crassulaceae, Gesneriaceae và
Cruciferae là những họ thực vật dễ tái sinh
nhất.
1. Ảnh hƣởng của mẫu cấy
 Tuổi sinh lý của cây:
• Các mô phôi thường có khả năng tái sinh cao.
• Các bộ phận của cây non dễ tái sinh hơn, khi
cây già đi, khả năng tái sinh của chúng cũng
giảm theo.
• Đôi khi qua nhiều lần cấy chuyền, mẫu cấy già
từng bước được trẻ hóa do tăng khả năng tái
sinh và phân chia tế bào.

1. Ảnh hƣởng của mẫu cấy
 Tuổi của mô và cơ quan:
• Những mô còn non và mềm thường dễ nuôi cấy
hơn những mô cứng nhưng cũng có nhiều trường
hợp ngoại lệ.

• Các mẫu cấy từ cuống lá còn non tái sinh tốt
hơn những mẫu cấy từ cuống lá già do cơ quan
của chúng già hơn nên khả năng tái sinh và phân
chia tế bào giảm.
1. Ảnh hƣởng của mẫu cấy
 Tình trạng sinh lý:
• Thông thường các bộ phận của cây trong giai
đoạn sinh dưỡng dễ tái sinh hơn trong giai đoạn
sinh sản.
• Các chồi của cây trong giai đoạn ngủ đông khó
nuôi cấy
in vitro
hơn chồi của những cây đã
vượt qua được giai đoạn này.
2/28/2011
4
1. Ảnh hƣởng của mẫu cấy
 Vị trí của mẫu cấy trên cây:
• Những chồi ban đầu được tách từ vị trí thấp
trên cây phát triển trong môi trường
in vitro

tốt hơn, và chồi gốc tăng trưởng nhanh hơn
chồi nách.
• Điều đáng lưu ý là những mô sẹo phát sinh từ
những mẫu cấy có nguồn gốc từ những phần
khác nhau của cây như rễ, chồi, cuống lá đều có
phản ứng
in vitro
giống nhau.

1. Ảnh hƣởng của mẫu cấy
 Kích thước mẫu cấy:
• Các cấu trúc nhỏ như tế bào, cụm tế bào và mô
phân sinh khó cảm ứng để tăng trưởng hơn
những cấu trúc lớn như thân, lá, củ.
• Các bộ phận của cây có chứa nhiều chất dinh
dưỡng dự trữ như củ, thân hành thường dễ tái
sinh trên môi trường
in vitro
hơn những cơ
quan ít chất dự trữ.
1. Ảnh hƣởng của mẫu cấy
 Vết thương:
• Sự tổn thương trên bề mặt mẫu cấy đóng vai
trò quan trọng trong sự tái sinh mẫu cấy.
• Bề mặt tổn thương tăng lên làm gia tăng sự hấp
thu chất dinh dưỡng và các chất điều hòa đồng
thời ethylene được tạo ra nhiều hơn.
 Phương pháp cấy:
• Các mẫu cấy có thể được đặt trên môi trường
theo nhiều cách khác nhau: có cực hoặc không
có cực.
• Chồi và rễ thường tái sinh dễ và nhanh khi mẫu
được cấy không cực.
1. Ảnh hƣởng của mẫu cấy
1. Ảnh hƣởng của mẫu cấy
 Kiểu di truyền
 Tuổi sinh lý của cây
 Tuổi của mô và cơ quan
 Tình trạng sinh lý

 Vị trí của mẫu cấy trên cây
 Kích thước mẫu cấy
 Vết thương
 Phương pháp cấy
 Khoáng đa lượng:
• Nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật tách
rời không khác nhiều so với cây trồng trong
điều kiện tự nhiên.
• Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp là N,
P, K, Ca, Mg
2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng
2/28/2011
5
 Khoáng vi lượng:
• Trước đây, khi kỹ thuật nuôi cấy mô mới ra đời,
người ta không nghĩ đến việc bổ sung khoáng vi
lượng vào môi trường nuôi cấy.
• Các nguyên tố vi lượng cần cung cấp cho tế bào
là: Fe, Mn, Zn, Cu, B, Co, I, Mo…
2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng
 Carbon và nguồn năng lượng:
• Hai dạng đường thường gặp nhất là glucose và
sucrose.
• Các nguồn carbonhydrate khác cũng được tiến
hành thử nghiệm như lactose, galactose,
maltose và tinh bột nhưng các carbonhydrate
này có hiệu quả kém hơn so với glucose và
sucrose.
2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng
 Vitamin:

• Thông thường thực vật tổng hợp các vitamin
cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của
chúng.
• Các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất
trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1), acid
nicotinic, pyridoxine (B6) và myo-inositol.
2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng
 Chất điều hòa tăng trưởng thực vật:
• Có 5 nhóm chất điều hoà quan trọng trong nuôi
cấy mô thực vật: auxin, cytokinin, gibberellin,
acid abscisic và ethylen.
• Tỉ lệ auxin/cytokinin (A/C) xác định dạng phân
hoá cơ quan của tế bào thực vật nuôi cấy: A/C
cao giúp sự tạo rễ, A/C thấp giúp tạo chồi.
2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng
Auxin
• Auxin phối hợp với cytokinin giúp sự tăng
trưởng chồi non và khởi phát sự tạo mới mô
phân sinh ngọn chồi từ nhu mô.
• Auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ
khởi rễ, nhưng cũng cản trở sự tăng trưởng
của các sơ khởi này.
• IAA, IBA, NAA, 2,4-D, 2,4,5-T,
phenoxyacetic acid
Cytokinin
• Kích thích tế bào phân chia (với điều kiện có
auxin).
• Cytokinin tác động trên cả hai bước của sự
phân chia tế bào: phân nhân và phân bào.
• Kinetin, zeatin, BA, TDZ

2/28/2011
6
 Các chất hữu cơ không xác định:
• Bổ sung nhiều chất trích hữu cơ khác nhau vào
môi trường nuôi cấy thường mang lại kết quả
thuận lợi cho sự tăng trưởng của mô.
• Các chất bổ sung này là: protein hydrolysate,
nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết lúa
mạch, chuối, nước cam, nước cà chua
2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng
 Nguồn cung cấp nitrogen:
• Mặc dù tế bào có khả năng tổng hợp tất cả các
amino acid cần thiết nhưng sự bổ sung các
amino acid vào môi trường nuôi cấy là để kích
thích sự tăng trưởng của tế bào.
• Các nguồn nitơ hữu cơ thường sử dụng là hỗn
hợp amino acid như casein hydrolysate, L-
glutamine, L-asparine và adenine.
2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng
 Than hoạt tính:
• Việc bổ sung than hoạt tính vào môi trường
nuôi cấy có tác dụng khử độc.
• Ảnh hưởng của than hoạt tính: kích thích sự
tăng trưởng của mô thực vật là do than hoạt
tính kết hợp với các hợp chất phenol độc do mô
tiết ra trong suốt thời gian nuôi cấy.
2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng
 Yếu tố làm đặc môi trường:
• Agar là chất thường sử dụng để tạo môi trường
đặc hay môi trường bán rắn trong nuôi cấy mô

thực vật.
• Agar không phản ứng với các chất trong môi
trường. Độ cứng của agar quyết định bởi nồng
độ agar sử dụng và pH của môi trường.
2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng
 Khoáng đa lượng
 Khoáng vi lượng
 Carbon và nguồn năng lượng
 Vitamin
 Chất điều hòa tăng trưởng thực vật
 Các chất hữu cơ không xác định, nguồn cung
cấp nitrogen, than hoạt tính, yếu tố làm đặc
môi trường
2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng
Một số công thức môi trường thường được sử
dụng chủ yếu để nuôi cấy mô và tế bào thực vật
như môi trường MS (Murashige và Skoog), B5
(Gamborg và cộng sự), SH (Schenk và
Hilderbrandt) có hàm lượng khoáng đa lượng cao
và một số môi trường khác được mô tả bởi White,
Gautheret, Nitsch, Loyd và Mc Cown có hàm lượng
khoáng đa lượng thấp hơn.
2/28/2011
7
Khoáng đa lƣợng mg l
-1

NH
4
NO

3
1650
KNO
3
1900
KH
2
PO
4
170
MgSO
4
.7H
2
O 370
CaCl
2
.2H
2
O 440
Khoáng vi lƣợng mg l
-1

KI 0.83
H
3
BO
3
6.2
MnSO

4
.4H
2
O 22.3
ZnSO
4
.7H
2
O 8.6
Na
2
MoO
4
.2H
2
O 0.25
CuSO
4
.5H
2
O 0.025
CoCl
2
.6H
2
O 0.025
Na
2
.EDTA 37.3
FeSO

4
.7H
2
O 27.8
Vitamin và các chất hữu cơ khác mg l
-1

Myo-Inositol 100
Nicotinic acid 0.5
Pyridoxine HCl 0.5
Thiamine HCl 0.1
Glycine 2.0
Thành
phần
môi
trường
MS
Khoáng đa lƣợng
NH
4
NO
3
1650 mg/l
KNO
3
1900 mg/l
KH
2
PO
4

170 mg/l
CaCl
2
.2H
2
O 440 mg/l
MgSO
4
.7H
2
O 370 mg/l
NH
4
NO
3
82,5 g/l
KNO
3
95 g/l
KH
2
PO
4
8,5 g/l
MgSO
4
.7H
2
O 37 g/l
CaCl

2
.2H
2
O 44 g/l
Stock 1 x 50 (20ml/l)
Stock 2 x 100 (10ml/l)
Stock 3 x 100 (10ml/l)
Khoáng vi lƣợng
KI 0,83 mg/l
H
3
BO
3
6,2 mg/l
MnSO
4
.4H
2
O 22,3 mg/l
ZnSO
4
.7H
2
O 8,6 mg/l
Na
2
MoO
4
.2H
2

O 0,25 mg/l
CuSO
4
.5H
2
O 0,025 mg/l
CoCl
2
.6H
2
O 0,025 mg/l
Na
2
.EDTA 37,3 mg/l
FeSO
4
.7H
2
O 27,8 mg/l
KI 41,5 mg/l
H
3
BO
3
310 mg/l
MnSO
4
.4H
2
O 1115 mg/l

ZnSO
4
.7H
2
O 430 mg/l
Na
2
MoO
4
.2H
2
O 12,5 mg/l
CuSO
4
.5H
2
O 1,25 mg/l
CoCl
2
.6H
2
O 1,25 mg/l
Na
2
.EDTA 3,73 g/l
FeSO
4
.7H
2
O 2,78 g/l

Stock 4 x 50 (20ml/l)
Stock 5 x 100 (10ml/l)
Vitamin
Myo-Inositol 100 mg/l
Nicotinic acid 0,5 mg/l
Pyridoxine HCl 0,5 mg/l
Thiamine HCl 0,1 mg/l
Glycine 2,0 mg/l
Myo-Inositol 20 g/l
Nicotinic acid 100 mg/l
Pyridoxine HCl 100 mg/l
Thiamine HCl 20 mg/l
Glycine 400 mg/l
Stock 6 x 200 (5ml/l)
Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nuôi
cấy mô thực vật
Mẫu cấy
Môi trường nuôi cấy
Ánh sáng
Độ thoáng khí
 Một số mô hình và hệ thống
nuôi cấy mới
 Phương pháp nuôi cấy này sử dụng mẫu cấy là
chồi ngọn hoặc chồi bên có mang một đoạn thân
ngắn. Chồi này sẽ được kích thích cho tăng
trưởng, ra rễ để tạo thành cây nguyên vẹn.
Nuôi cấy nốt đơn thân
2/28/2011
8
 Virus thực vật là một trong những tác nhân gây

thiệt hại nặng nề cho nền nông nghiệp.
 Virus lây lan nhờ côn trùng, tuyến trung, ve rận
hoặc thông qua con đường cơ học.
 Virus lan truyền trong cơ thể thực vật qua các
bó mạch. Đa số các loài virus không truyền
nhiễm qua hạt.
 Xử lý nhiệt, hóa chất,…
Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng
 Năm 1949, Limasset và Cornuet nhận thấy
trong cây bị nhiễm, mật độ virus giảm dần khi
đến gần điểm phát triển sinh dưỡng.
 Năm 1952, Morel và Martin khẳng định có thể
tách mô phân sinh chồi đỉnh của cây trồng bị
nhiễm virus
in vitro
để thu được cây sạch bệnh.
Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng
 Mô phân sinh là một đỉnh tròn gồm các tế bào
phân chia tích cực, có đường kính khoảng 0,1
mm và dài khoảng 0,25 mm.
 Sử dụng khối mô bao gồm cả đỉnh sinh trưởng
và 1 hoặc 2 sơ khởi lá có kích thước 0,5-1 mm.
Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng
 Để có được nhiều đỉnh sinh trưởng sạch bệnh
virus làm nguồn mẫu cho nuôi cấy
in vitro
, trước
tiên phải tiến hành tạo chồi bất định, sau đó
thu đỉnh sinh trưởng từ các chồi bất định này.
Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng

Quy trình nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng
Nuôi cấy bao phấn
• Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn  các cây đơn
bội và đơn bội kép  biểu hiện tất cả các tính
trạng  ứng dụng trong việc chọn giống
• Được áp dụng thành công ở trên 250 loài thực
vật, gồm các cây thuộc họ Liliaceae.
2/28/2011
9
• Vật liệu
Nụ hoa 3,5 – 5 cm chứa hạt phấn ở giai đoạn
đơn nhân muộn.

Nuôi cấy bao phấn
• Phƣơng pháp
• Khử trùng với etanol 70 1 phút và
hypoclorid calcium 8% 15 phút
• Nuôi cấy trên MS có picloram 2mg/l, zeatin
2mg/l và sacaroz 6%
• Trong tối, ở 25°C  mô sẹo
• Sau 2 tháng, mô sẹo  MS có picloram
0,1mg/l, BA 0,01mg/l và sacaroz 3%  cụm
chồi
• Cây con  môi trường MS  tăng trưởng và
tạo rễ (ở 25
o
C, 1600  100 lux)

Nuôi cấy bao phấn

Quy trình nuôi cấy bao phấn
Hạt phấn
Sau 14 ngày GĐ 2 tế bào
GĐ 4 tế bào
GĐ 8 tế bào
Mô sẹo (sau 2 tháng) Cụm chồi
Cây con
Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nuôi
cấy mô thực vật
Mẫu cấy
Môi trường nuôi cấy
Ánh sáng
Độ thoáng khí
 Một số mô hình và hệ thống
nuôi cấy mới
Hệ thống nuôi cấy Bioreactor
Môi trƣờng rắn:
- Lãng phí
- Tích tụ phenol
gây độc cho mẫu cấy

Môi trƣờng lỏng:
- Trao đổi khí hạn chế
- Dễ xảy ra hiện tượng
thủy tinh thể

2/28/2011
10
Môi trƣờng lỏng lắc:
- Gây tổn thương

cho mẫu cấy

Môi trƣờng lỏng có sục khí:
(Bioreactor)


Bioreactor = bình phản ứng
có những tính chất:
• Điều kiện vô trùng
• Môi trường lỏng có sục khí
• Số lượng mẫu cấy nhiều
• Có khả năng tự động hóa

Hệ thống nuôi cấy Bioreactor tự tạo

Hệ thống nuôi cấy Bioreactor tự động

2/28/2011
11

Quy trình nhân sinh khối thực vật bằng hệ
thống Bioreactor:
• B1. Thiết lập môi trường nuôi cấy vô trùng
• B2. Nhân sinh khối
• B3. Tạo rễ cho cây con trước khi ra vườn ươm
Các thông số ảnh hƣởng đến hiệu quả của
hệ thống Bioreactor
• Sự vận chuyển khí oxy và khả năng hòa tan oxy
vào môi trường
• Môi trường dinh dưỡng

Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời
Hệ thống ngập chìm tạm thời

2/28/2011
12
Hệ thống ngập chìm tạm thời
Các thông số ảnh hƣởng đến hiệu quả của
hệ thống ngập chìm tạm thời
• Thời gian ngập chìm, tần số ngập chìm
• Thể tích môi trường dinh dưỡng, thể tích bình
nuôi cấy
• Sự thoáng khí tự nhiên và sự thoáng khí cưỡng
bức
Hệ thống nuôi cấy quang tự dƣỡng
Vai trò của
ánh sáng
đối với
thực vật

Ánh sáng khả kiến

Bƣớc sóng ánh sáng quang hợp
2/28/2011
13

Những nguồn sáng sử dụng trong nuôi
cấy mô thực vật

Nuôi cấy quang tự dƣỡng
• Chú trọng đến các tác nhân vật lý của môi trường

nuôi cấy như ion, cường độ ánh sáng, thời gian
chiếu sáng, thành phần không khí, ẩm độ,… thay
vì chỉ nghiên cứu thành phần hóa học của môi
trường nuôi cấy như nồng độ đường, vitamin hay
các chất điều hòa sinh trưởng thực vật.
Nuôi cấy quang tự dƣỡng
• Không sử dụng đường và các chất hữu cơ, tạo điều
kiện tối đa cho cây trong bình nuôi cấy sử dụng
khí CO
2
có sẵn trong không khí làm nguồn carbon
chính cho quá trình tăng trưởng và phát triển
của cây  Giảm chi phí, giảm tỉ lệ nhiễm
Nuôi cấy quang tự dƣỡng
• Hộp nuôi cấy quang tự dưỡng = nhà kính
thu nhỏ  tạo điều kiện cho cây
in vitro

thích nghi dần với điều kiện
ex vitro
trước
khi chuyển ra vườn ươm
2/28/2011
14