Tiểu luận lên men SINH KHỐI LACTIC

I. N

G U

Y Ê N

L I

Ệ

U

L

À M

M

Ô I

T R

Ư

Ờ N

G

V I

S

I N

H
V Ậ

T :

1. V

i

kh u ẩn

l

a

c

t

i





c
1.1.

Đ ặc

đi ể m

c h u n g

c ủ a

v

i





kh u

ẩn

l
a c t i

c

Vi khuẩn lactic thuộc họ Lactobacilliaceae.
Vi khuẩn lactic có dạng hình cầu hoặc hình gậy, đứng riêng lẻ hoặc tạo chuỗi, thuộc
vi khuẩn gram dƣơng (+).
Vi khuẩn lactic không di động.

Vi khuẩn lactic không tạo bào tử (tuy nhiên hiện nay ngƣời ta tìm thấy một số
giống trong họ vi khuẩn lactic có khả năng tạo bào tử).
Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn kị khí chịu dƣ ỡng.
Vi khuẩn lactic không chứa cytochrom và enzyme ca talase.
Vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp enzyme peroxydase rất mạnh.
Chúng phân giải H
2
O
2
để tạo ra nƣớc và O
2
để phát triển.
1.2.


S

ự

ph

ân bố:
Ít gặp trong đất và nƣớc,thƣờng phát triển trong những môi trƣờng có chứa
nhiều chất hữ u cơ phức tạp nhƣ :
- Trong sữa và các sản phẩm từ sữa thƣờng gặp Lactobacillus lactic,
Lactobacillus bulgarius, Lactobacillus helviticus, Lactobacillus casei, Lactobacillus
ferment,Lactobacillus brevis, Streptococcus diacetyllactis. Để tồn tại trong môi trƣờng sữa vi
khuẩn lactic tổng hợp ATP từ cơ chất lactose.
- Trên bề mặt thực vật và xác thực vật đang bị phân giải hay có Lactobcillus
plantanium, Lactobcillus delnikii, Lactobcillus ferment, Lactobacillus brevis, Streptococcus

lactis Chúng còn đƣợc tìm thấy trên các loại rau quả, trái cây.
- Trong ruột và các niêm dịch ở ngƣời và động vật có Lactobacillus acidophilus,
Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus salivanius, Streptococcus
pyogenes, Bifidobacterrium, Pneumococcus.
1.3.

P h ân

l o ạ i

v

i





kh u ẩn l
a

c

t

i


c
Dựa vào quá

t
r
ì
nh

lên men đƣờng: có
2 loại
- Vi khuẩn lactic đồng hình: Streptococus lactic, Streptococcus cremoris,… Vi
khuẩn lên men lactic đồng hình sản sinh 85-95% acid lactic. Do thiếu porphyrin và
cytochrom, không có chuỗi vận chuyển electron nên chúng thu năng lƣợng bằng con
đƣờng lên men bắt buộc. Trong tế bào vi khuẩn có chứa enzymealdolase và
triosophotphatizomerase.
- Vi khuẩn lactic dị hình: Vi khuẩn lên men lactic dị hình sản sinh 50% ac id lactic,
25% cồn và 25% acid acetic. Nhóm vi khuẩn này gồm có các vi khuẩn sinh hƣơng
Streptococcus votrovorus, Streptococcus paracotrovorus, Streptococcus diactylactis, và
Lactobacillus brevis,Lactobacillus fermenti,
Bảng
1
: Các chi vi khuẩn lactic, kiểu lên men và sản phẩm chính
Chi và dƣới chi Kiểu lên men Sản phẩm chính
(Tỷ lệ phân tử)
Cấu hình của
acid lactic
Streptococcus Đồng hình lactat
L
(+)
Pediococcus Đồng hình lactat
DL và L
(+)
Lactobacillus Đồng hình lactat

Thermobacterium Đồng hình lactat
D
(-)
,L
(+),
DL
Streptobacterium Dị hình
(tùy tiện)
Lactat : axetat
1 : 1
D
(-)
,L
(+),
DL
Betabacterium Dị hình
Lactat : axetat : CO
2
1 : 1 : 1
DL
Leuconostoc Dị hình
Lactat : axetat : CO
2
1 : 1 : 1
D
(-)
bifidobacterium Dị hình Lactat : a xetat
2 : 3
L
(+)

Dựa vào hình
t
h
á
i
:

có
2 loại
- Cầu khuẩn lactic: Streptococcus
- Trực khuẩn lactic: Lactobacillus
Dựa vào tính mẫn cảm với
oxi
:

có
3
nh
óm
- Vi khuẩn lactic kỵ khí nghiêm ngặt
- Vi khuẩn lactic yếm khí tùy tiện: Pediococcus cerevisiae
- Vi khuẩn lactic vi hiếu khí (hiếu khí tùy tiện):
Dựa vào nhiệt độ phát triển tối
ƣ
u
:

có
2 nhóm
- Vi khuẩn lactic ƣa ấm: 25-35 C

Ví dụ: Streptococus lactic, Lactobacillus casei, L. plantarum,…
- Vi khuẩn lactic ƣa nhiệt: 37-45 C
Ví dụ: Streptococus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus, L. helvetcus,…
2. S

I N

H K H

Ố I V

I K H

U

Ẩ N

L A

C

T I C
2.1.

M ụ c

đí c h

t

h u

n h ận

s i n h

kh ối

v

i


kh




u



ẩn

l



a

c

t

i





c

Trong thời gian trƣớc đây mỗi cơ sở sản xuất có phƣơng pháp và qui trình
riêng để nhân giống và bảo quản giống dùng cho sản xuất. Khi cần sử dụng ngƣời ta
sẽ tiến hành nhân giống qua nhiều giai đoạn theo nguyên tắc thu nhận một canh
trƣờng vi sinh vật thuần khiết. Hiện nay một số nhà máy chế biến thực phẩm và nhữ
ng nhà máy sản xuất các sản phẩm trao đổi chất từ vi sinh vật vẫn đang sử dụng phƣ
ơng pháp này nên giống vi sinh vật đƣợc xem là độc quyền sở hữu của mỗi nhà máy.
Từ nhữ ng năm 1980, trên thế giới phát triển mạnh một ngành công nghiệp
mới, công nghiệp sản xuất và cung cấp giống vi sinh vật. Các chế phẩm giố ng thƣ ơng
mại bao gồm đủ loại: vi khuẩn, nấm men, nấm sợi… Vi khuẩn lactic cũng không
ngoại lệ, sinh khối vi khuẩn lactic đƣợc thu nhận, bảo quản và cung ứ ng cho ngành

công nghiệp sản xuất các sản phẩm từ sữa.
Chế phẩm giống thƣơng mại có thể cấy trực tiếp vào môi trƣờng lên men
hoặc hoạt hoá chúng trên một môi trƣờng dinh dƣỡng trong một khoảng thời gian
nhất định trƣớc khi cấy.
2.2.

C

ác

l oài

v

i





kh u ẩn

l
a

c

t

i c

dù





n g

t





r

on





g

c

ôn





g

n
gh





i ệ p

s ản

xu
ất



s i

n

h

kh


ối


v

i


kh


u


ẩ

n

l

a c t i

c
Quan trọng là sinh khối của vi khuẩn lactic lên men đồng hình.
Streptococcus thermophilus

Lactobacillus bulgaricus
Streptococus lactic
Streptococcus cremoris
Lactobacillus acidophilus
Nhóm vi khuẩn sinh
hƣơng
a/ Lactobacillus acidophilus
Hình 1: Lactobacillus acidophilus
 Thuộc trực khuẩn, có kích thƣớc : rộng 0.6-0.9 µm, dài 1.5-6 µm.
 Trong thiên nhiên chúng tồn tại riêng lẻ, đôi khi chúng tạo thành nhữ ng
chuỗi ngắn, thuộc nhóm vi khuẩn gram dƣơng (+) và có khả năng chuyển động.
 Chúng có khả năng lên men một loạt đƣờng nhƣ : glucose, fructose,
galactose,
mannose, maltose, lactose, saccharose để tạo acid lactic.
 Chúng hoàn toàn không có khả năng lên men xylose, arabinose,
rhamnose, glycerol, mannitol, sorbitol, dulcitol, inocitol.
 Trong quá trình lên men chúng tạo ra cả hai dạng đồng phân quang học của
acid
lactic.
 Nhiệt độ phát triển tối ƣ u là 45 C, pH 4-5.
b/ Lactobacillus bulgaricus
Hình 2: Lactobacillus bulgaricus
 Thuộc trực khuẩn có kích thƣớc rất dài, liên kết với nhau tạo thành chuỗi,
gram
(+).
 Chúng không có khả năng di chuyển.
 Có khả năng lên men đƣợc các loại đƣờng glucose, lactose, galactose.
 Không lên men đƣợc xylose, arabinose, sorbose, dulcitol, ma nnitol,
dextrin, inulin.
 Chúng không có khả năng tạo initrit từ nitrate.

 Nhiệt độ phát triển 40-50 C, pH thích hợp 5.5-6.0.
c/ Streptococcus thermophilus
Hình 3: Streptococcus thermophilus
 Tế bào hình cầu hoặc hình trứ ng, đƣờng kính 0.7-0.9 µm, không chuyển
động, thƣ ờng kết thành chuỗi ngắn, gram (+).
 Phát triển tốt ở 40-45 C, pH 5.8-6.0. Không phát triển đƣợc ở 53 C và dƣ ới 20
C, sống đƣợc ở 65 C trong 30 phút.
 Không phát triển đƣ ợc trong môi trƣờng sữa chứa 0.01% methylen blue,
môi trƣờng máu chứa 10% mật.
 Có khả năng lên men glucose, fructose,lactose, saccharose.
 Nhạy cảm với các chất kháng sinh 0.01 µg/ml tetracycline hay 0.1
µg/ml chloremphen.
d/ Streptococcus cremoris
Hình 4: Streptococcus cremoris
 Cầu khuẩn, trong thiên nhiên chúng tạo thành từ ng chuỗi rất dài, gram
(+).
 Nhiệt độ thích hợp cho chúng phát triển là 30
C.
 Chúng không phát triển đƣợc ở nồng độ NaC l
4%.
 Khi lên me n đƣờng tạo ra acid acetic, CO
2
,
diacetyl.
 Chúng có khả năng tạo ra nhữ ng chất kháng
khuẩn
e/ Streptococcus lactic
Hình 5: Streptococcus lactic
 Thuộc chuỗi cầu khuẩn, gram
(+).

 Nhiệt độ phát triển 10-45 C, tối thich ở 30-35
C.
 Có khả năng chịu đƣ ợc nồ ng độ NaC l
4%.
 Khi lên men đƣờng glucose, maltose, lactose, xylose, arabinose,
saccharose, trehalose, mannitol, salicin tạo ra acid lactic, CO
2
, acid acetic,
diacetyl.
Chúng không có khả năng lên men đƣợc raffinose, insulin, glycerol, sorbitol
2.3.

G

i
ốn





g

v

i

s i n h

v

ật





d

ù





n g

c h
o s ản

xu
ất

Giống vi sinh vật là một trong bốn yếu tố quyết định năng suất sản xuất sản
xuất
công nghiệp vi sinh vật. C ùng với chất lƣợng môi trƣờng, điều kiện lên men,

các phƣơng pháp thu nhận và tinh chế sản phẩm,giống vi sinh vật là khâu đầu
tiên can phải quan tâm đặc biệt.
Giống vi khuẩn lactic dùng cho sản xuất phải đáp ứ ng các yêu cầu
sau:
 Giống có khả năng thích ứ ng nhanh, phát triển mạnh
 Giống có khả năng sinh sản cao.
 Giống có khả năng chống lại đƣ ợc đối với các điều kiện bất lợi.
 Giống dễ dàng tách khỏi môi trƣờng nuôi cấy
 Khả năng dễ bảo quản và bảo tồn đƣợc đặc tính di truyền trong suốt
thời gian bảo quản và sử dụng.
 Thời gian lên men ngắn, hiệu suất cao
3. M

Ậ T

R

Ỉ :
Mật rỉ là thứ liệu trong công nghệ sản xuất đƣờng từ cây mía hay củ cải
đƣờng. Trƣớc đây mật rỉ ít đƣợc sử dụng trong công nghệ vi sinh. Sau này ngƣời ta
thấy mậy rỉ
có rất nhiều ƣu điểm để tạo môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật. N hững đặc tính quan
trọng phù hợp với qua trình lên men của mật rỉ bao gồm :
- Chứa hàm lƣ ợng đƣờng
cao.
- Ngoài đƣờng saccharose còn chứa rất nhiều chất hƣu cơ, vô cơ, các
chất thuộc vitamin và các chất kích thích sinh trƣởng
- Tuy nhiên rỉ đƣờng cũng có những đặc điểm không phù hợp với quá
trình lên men. Muốn sử dụng chúng cho quá trình lên men đòi hỏi phải có
các quá trình sử lý thích hợp. Các đặc diểm cần lƣ u ý ở mật rỉ bao gồm:

Rỉ đƣờng có màu nâu sẫm. Màu này khó bị phá hủy trong quá trình lên men.
Sau lên men chúng bám vào sinh khối vi sinh vật và bám vào sản phẩm. Việc tách
màu ra khỏi sinh khối và sản phẩm thƣờng rất tốn kém và rất khó khăn.
Hàm lƣ ợng đƣờng khá cao (thƣờng nằm trong khoảng 40-50%). Lƣ ợng này
chủ yếu là saccharose nên khi tiến hành lên men phải pha loãng với nồng độ
thích hợp.
Đặc điểm gây khó khăn lớn nhất cho quá trình lên men là hệ keo trong mật rỉ.
Keo càng nhiều, khả năng hòa tan oxy càng kém và khả năng trao đổi chất của vi
sinh vật càng kém. Do đó công việc quan trọng của nhất khi sử dụng mật rỉ là phải
phá hệ keo này.
Vì rỉ đƣờng là chất dinh dƣỡng khá lý tƣởng nên chúng rất dễ bị vi sinh vật
xâm nhập và phát triển. N hƣ vậy chất lƣ ợng mật rỉ cũng dễ thay đổi theo thời
gian bảo quản
T

h àn

h

p

h ầ

n

h óa

h ọ c :
Thành phần rỉ đƣờng dao động nhƣ sau:
- Nƣớc chiếm 15-20%, chất khô chiếm 80-85%.

- Trong đó, có 60% là đƣờng ( 40% là đƣờng saccharose, 20% là fructose
và
glucose và 40% chất còn lại là chất phi đƣờng )
- Trong thành phần phi đƣờng có khoảng 30-32% hợp chát hữ u cơ và 6-
105
hợp chất vô cơ. Trong hợp chất vô cơ có :
K
2
O: 3,5% Fe
2
O
3
: 0,2% MgO : 0,1% S ulfat: 1,6%
CaO: 1,5% S iO
2
: 0,5% P
2
O
5
: 0,2% C lorit: 0,4%
- Trong nhữ ng hợp chất hữ u cơ gồm có các hợp chất chứ nitơ và không chứ
nitơ ở dạng amin nhƣ : acid aspactic, acid glutamic, leuin, izoleuxin. N ito
tổng số chiếm khoảng 0,3-0,5% ( ít hơn so với so với lƣ ợng nitơ có trong rỉ
đƣờng củ cải)
Bảng
2: Thành phần các chất trong rỉ đường
Các chất thành phần Hàm lượ ng % trong rỉ đườ ng
Saccharose 32
Chất hữ u cơ phi đƣờng 10
Chất tro 8

Trong đó: K
2
O
3.5
CaO 1.5
MgO 0.1
SiO
2
0.5
SO
3
1.6
Cl
2
0.4
Na
2
O + Fe
2
O
3
+ Al
2
O
3
0.2
P
2
O
5

0.2
N tổng 5-2.2
N-amin 0.2-0.5
Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn
Trang
Bảng 3:
Thành phần vitamin trong rỉ đường mía
Vitamin Hàm lượ ng (mg% )
Thiamin 0.5
Riboflavin 0.12
Pyridoxin 0.9
Nicotinamit 1.5
Acid pantotenic 7.0
Acid foleic 0.02
Biotin 0.15
Inozit 500.0
C ác c h ất

m à u c ủ a

r ỉ

đư

ờ

n g

m í a

b ao g

ồ

m :
- Caramel: xuất hiện nhờ quá trình nhiệt phân saccharose kèm theo loại
trừ nƣớc và không chứa một chút nitơ nào. K hi pH không đổi, tốc độ tạo chất
caramen tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng.
-
Phức chất polyphenol-Fe
2+:
có màu vàng xanh, không b ị loại hết trong giai
đoạn làm sạch và tồn tại trong mật rỉ
- Melanodin: đây là sản phẩm ngƣ ng tụ của đƣờng khử và acid amin mà
chủ yếu là acid aspartic. Sản phẩm ngƣng tụ quen biết nhất là acid fuscazinic đóng
vai trò quan trọng làm tăng độ màu của rỉ đƣờng.
- Melanin: đƣợc hình thành nhờ phản ứng oxy hóa khử các acidamin thơm
nhờ xúc tác c ủa enzym polyphenol oxydaza khi có mặt của oxy và C u
+2
.
- Các acid amin thơm thƣ ờng b ị oxy hóa là tiroxin và brenzcatechin. Các
melanin thƣờng b ị loại hết ở giai đoạn làm sạch nƣớc đƣ ờng nên chỉ tìm thấy một
lƣ ợng rất nhỏ trong rỉ đƣ ờng.
- Chất keo: đƣợc hình thành b ởi potein và pectin. Các chất này ảnh hƣởng
rất
nhiều đến sự phát triển của vi sinh vật tạo thành màng bao bọc quanh tế bào, ngăn cản
quá trình hấp thụ các chất dinh dƣ ỡng và thải các sản phẩm trao đổi chất của tế bào ra
ngoài. Ngoài ra keo là nguyên nhân chính tạo ra mộ t lƣợng bọt lớn trong môi trƣờng
nuôi cấy vi sinh vật, giảm hiệu suất sử dụng thiết bị.
V i

s

i

n

h

vật

t

r o

n g

r ỉ

đ ư

ờ

n g

m í a .
Có rất nhiều vi sinh vật trong rỉ đƣ ờng mía . Đa số chúng có từ nguyên liệu,
một số nhỏ từ không khí, nƣớc, đất vào dịch đƣờng. Loại nào chịu đƣợc tác dụng
nhiệt hay
tác dụng của hoá chất thì tồn tại. N gƣời ta chia rỉ đƣờng thành 3 loại tuỳ theo số lƣ

ợng vi sinh vật tạp nhiễm.
Bảng 4:
Phân loại rỉ đường theo số lượng vi sinh vật tạp nhiễm .
Loại rỉ đƣờng Số lƣợng VS V trong 1g đƣờng Đánh giá và xử lý
I 100000 Rất tốt, không cần xử lý
II 100000- 1000000 Trung binh, cần thanh
trùng
III 1000000- 5000000 Nhiễm nặng cần xử lý
nghiêm ngặt
II. QU

I TR

ÌN

H

TH

U N

HẬN

S

IN

H

KH

ỐI V

I KH

U

ẨN

LA

C

TIC
Mật rỉ
Xử lý
Chuẩn bị
Môi trƣ
ờng
Giống
VSV
Thanh trùng
Nhân giống
Nuôi cấy
S
ấ
y th
ă
ng hoa
Ly tâm Đóng gói

Sản phẩm
III.
G


I

Ả


I

T


H

Í

C


H

Q


U

Y
T


R


Ì


N


H

C


Ô

N


G

N

G

H

Ệ


:


1. X ử

l ý

m ật

r ỉ :
1.1 P

h a l oã

n g s

ơ

b ộ:
a. M ụ c đ

í c

h: chuẩn bị cho quá trình acid hóa.
b. B

i ế

n đ ổ

i :
Hóa học: giảm nồng độ chất
khô. Vật lý: giảm độ nhớt.
Hoá lý: tăng độ hoà tan các chất.
c. T

h ự

c h i ệ

n:
Pha loãng với nƣớc theo tỉ lệ V
mật rỉ
: V
nƣớc
= 1 : 3
1.2 X ử

l ý

d ị c

h

p

h a l oã

n g

:
Truớc tiên, ta phải tẩy màu và tách các keo có trong mật rỉ
1.2.1. A c i

d

h oá:
a. M ụ c đ

í c

h

: chuẩn bị cho quá trình lên men và tiêu diệt vi sinh vật
b. B

i ế

n đ ổ

i :
Hóa học: đƣờng saccharose chuyển thành glucose và fructose dƣới sự xúc
tác của acid; pH giảm về 2.8-3.0
Hóa lý: hệ keo bị phá vỡ
Vi sinh: vi sinh vật bị tiêu diệt do nhiệt độ cao và pH thấp.

c. T

h ự

c h i ệ

n:
Lƣợng acid sunfuric đậm đặc thêm vào là 5% khối lƣ ợng dung dịch. Trong giai
đoạn này, ta đun dung dịch đến 90-95
o
C trong 6 giờ. Sau đó ta tiến hành ly tâm thu
dịch trong.
d. T

h i ế

t b

ị v à t

h ô

ng s ố c ô

ng ng h ệ

:
- Nồi phản ứ ng
.
1- Ống nối để nạp chất tải nhiệt;

2- Ống chảy tràn sản phẩm;
3- Ống quá áp;
4- Đầu nối ống nạp nguyên liệu;
5- Cửa quan sát;
6- Cửa thoát chất tải nhiệt;
7- Cửa vào của chất tải nhiệt;
8- Cửa ra của sản phẩm;
9- Cửa thoát chất tải nhiệt
Hình 6:Nồi phản ứng dạng đứng
Nồi phản ứ ng bằng thép hay bằng gang tráng men dùng để tiến hành các quá
trình
hoá - lý khác nhau.
Nồi phản ứ ng - máy trộn là một thiết bị dạng xilanh đứ ng có thể tích từ 0,1 ÷
100
3
m hoặc hơn, có áo hơi.Bên trong thiết bị có cơ cấu đảo trộn dạng tuabin hở.
Khi sử dụng các thiết bị có áo hơi dạng bán ống thì áp suất làm việc cho phép đến
1,6 MPa, còn trong áo hàn phẳng không nhỏ hơn 0,4 MPa. Nƣớc máy hay nƣớc tuần
hoàn, nƣớc muối, hơi nƣớc bảo hoà hay chất tải nhiệt hữ u cơ có nhiệt độ cao có thể
cho vào áo hay vào ruột xoắn.
Nồi phản ứ ng - máy trộn có thể tháo rời hay hàn cố định với các bộ phận đáy
elip và nắp. Trên thiết bị có các khớp nối để nạp các chất tải nhiệt, chảy tràn sản phẩm,
để nối ống quá áp, nối khớp đầu ống nguyên liệu, khảo sát chất liệu, các khớp nối để
nạp và thải chất tải nhiệt và sản phẩm, van an toàn, nhiệt kế. Sau khi nạp vào thiết bị
một lƣ ợng nƣớc nhất định.Tiến hành đun nóng môi trƣờng đến một nhiệt độ đã cho
bằng phƣơng tiện điều chỉnh tự động.
Tần số trộn của máy khuấy 0,2 ÷ 0,33 vòng/s, phụ thuộc vào dạng cơ cấu trộn
và các tính chất của các cấu tử đem trộn.
Khi thiết kế máy trộn dạng tuabin, số vòng quay 3 ÷ 3,3 vòng/s, dạng khung 0,33
÷ 1 vòng /s.

Dẫn động máy trộn đƣợc thực hiện nhờ động cơ điện qua hộp giảm tốc.
1.2.2. L y t â

m t

h

u d

ị c

h t

r o

n g

:
a. M ụ c đ

í c

h: chuẩn bị cho quá trình lên
men b. B

i ế

n đ ổ

i :

Hóa học: tạp chất bị loại bỏ, giữ lại chất hòa tan
Hóa lý: tách pha rắn khỏi pha lỏng
Vật lý: tăng độ trong, giảm khối lƣợng riêng dung dịch
c. T

hiế

t b

ị và t

hô

ng số cô

ng nghệ

:
Hình 7:Thiết bị ly tâm lọc
Thiết bị ly tâm lọc hoạt động theo nguyên tắc: khi hệ thống quay với tốc độ
cao tạo ra lực ly tâm mạnh và đẩy các thành phần pha lỏng và rắn ra sát thành thiết
bị nhƣ hình vẽ, thành thiết bị có gắn vải lọc để các cấu tử chất hoà tan đi qua và giữ lại
c ác thành phần pha rắn.
2. C h

u ẩ

n

b

ị

m ôi

t

r u ờ

n g

:
Khi chuẩn bị môi trườ ng nuôi cấy, ta phải chú ý nhữ ng đặc điểm sau đây:
Các nguyên vật liệu làm môi trƣờng nhất thiết phải cung cấp đầy đủ các
thành phần dinh dƣỡng cho các quá trình trao đổi chất của tế bào vi sinh
vật, đồng thời duy trì đƣợc thế oxy hóa–khử, áp suất thẩm thấu và tạo
đƣợc sự ổn định của pH thích hợp của môi trƣờng.
Thành phần nguyên vật liệu phải đƣợc cân đo chính xác và pha chế theo
đúng trình tự hƣ ớng dẫn.
2.1. N h u

c ầu

di n h

d

ƣ

ỡ n g

c ủ a

m ôi
t





r
ƣ


ờ
n





g

n



u



ôi





c

ấy

Vi khuẩn lactic có nhu cầu dinh dƣỡng rất phức tạp, không một đại diện nào
thuộc nhóm này có thể phát triển trên môi trƣờng đơn giản chỉ chứa glucose và NH
4
+
mà chúng đòi hỏi hàng loạt các vitamin nhƣ lactoflamin, thiamin, acid pantothenic, a
cid nicotinic, acid folic, biotin và các acid amin. Vì thế ngƣời ta thƣờng nuôi cấy
chúng trên một môi trƣờng phức tạp chứa một lƣ ợng tƣơng đối cao nấm men, cao thịt
và nƣớc chiết cà chua.
2.1.1. N h u

c ầu

di n h

d

ƣ





ỡ n
g


c a c bon

:

Vi khuẩn lactic có thể sử dụng đƣợc r ất nhiều các loại carbonhydrate khác
nhau từ glucose, fructose, maltose đến saccharose Các nguồn cacbon này dùng để
cung cấp năng lƣợng tham gia vào hầu hết các cấu trúc của tế bào. Vì vậy đây là
nguồn thức ăn cacbon có ý nghĩa quan trọng nhất đối với sự sống của tế bào vi sinh vật.
Trong quá trình lên men các cơ chất chứa cacbon, vi khuẩn lactic có thể sử dụng cả
các acid amin nhƣ acid glutamic, arginine hay tyrozyne làm nguồn cung cấp năng lƣ
ợng. Khi đó diễn ra quá trình decacboxyl và tạo CO
2
.
Nguồn cacbon tốt nhất là các loại đƣờng có tính khử ở liều lƣ ợng nhỏ. Nếu
khi nhân giống ngƣời ta dùng một loại đƣ ờng thông thƣờng hiếm khi đƣợc dùng

làm nguồn cacbon thì khi đƣa vào sản xuất vi khuẩn có thể phát triển hiệu quả trên
chứa loại đƣờng này mà không là m ảnh hƣởng đến khả năng lên men đối với các
nguồn cacbon thông
thƣ ờng.
2.1.2. N h u

c ầu

di n h

d

ƣ





ỡ n g

n i
t

ơ

:
Nguồn nittơ dễ hấp thụ đối với vi sinh vật là NH
3
,NH
4
+
.Sau khi đồng hóa gốc
NH
4
+
trong môi trƣ ờng sẽ tích lũy các anion vô cơ (SO
4
2-
,HPO
2-
,Cl
-
…) làm hạ
thấp rất nhiều trị số pH của môi trƣờng,ta phải điều chỉnh pH của môi trƣờng
nuôi
cấy.
4
Đa số vi khuẩn không có khả năng sinh tổng hợp chất hữ u cơ phức tạp có
chứa nitơ từ nguồn dinh dƣ ỡng vô cơ. Vì vậy, để đảm bảo cho sự phát triển của mình,
vi khuẩn lactic phải dùng nguồn nitơ có sẵn trong môi trƣờng dƣới dạng các acid
amin. Tuy nhiên để vi khuẩn phát triển bình thƣờng thì ngoài nguồn nitơ của acid amin
thì vi khuẩn lactic còn cần nhữ ng chất hữ u cơ phức tạp có chứa nitơ nhƣ cao thịt,
cao nấm men, peptone, cazein
2.1.3.
N

h


u

c

ầu

v

ề

v

i


t


a

m

i

n


:


Vi khuẩn lactic rất cần vitamin cho sự phát triển của mình và các vitamin
này đóng vai trò là coenzyme trong quá trình trao đổi chất của chúng. Rất ít vi khuẩn
lactic có khả năng tổng hợp vitamin, phần lớn chúng cần nhiều loại vitamin nhƣ
riboflavin, thiamin, acid pantothenic, nicotinic, biotin N hu cầu vitamin chịu ảnh
hƣởng của nhiều yếu tố nhƣ nhiệt độ nuôi cấy, pH, nồng độ CO
2
ban đầu, thế oxy
hoá khử và thành phần của môi trƣờng.
Bảng
5: Vitamin và các chất sinh truởng cần thiết cho sự sinh
truởng
của các vi khuẩn lactic
Chất Vi sinh vật điển hình
Acid p-aminobenzoic
Lactobacillus plantarum
Acid folic
Lactobacillus arabinosus
Lactobacillus casei
Streptococcus faecalis
Acid 5- focmyl-5,6,7,8-tetrahidrofolic
Leuconostos citrovorum
Streptococcus faecalis
Locovorin Lactobacillus casei
Acid nicotinic

Lactobacillus arabinosus
Leuconostoc menssenteroides
Streptococcus faecalis
Riboflavin
Lactobacillus casei
Streptococcus lactic
Acid pantothenic
Lactobacillus casei
Leuconostoc menssenteroides
Streptococcus faecalis
Panteterin.pantetin
Lactobacillus acidophyllus
Lactobacillus bulgaricus
Lactobacillus casei
Acid lipoic
Streptococcus lactic
Streptococcus faecalis
Lactobacillus fermenti
Thiamin Streptococcus lactic
Lactobacillus plantarum
Biotin
Leuconostoc menssenteroides
Streptococcus faecalis
Lactobacillus arabinosus
Bioxitin Lactobacillus casei
2.1.4.
N


h

u

c

ầu

v

ề

c

ác

m

u


ối


kh


oán

g:

Để đảm bảo cho sự sinh trƣởng phát triển, vi khuẩn lactic cần rất nhiều hợp
chất vô cơ nhƣ P, S, Mg, Ca, Zn, Mn, Fe, Na, Cl. Đối với lactobacillus thì Mn
2+
,
Mg
2+
, Fe
2+
có tác động tích cực lên sự phát triển và sinh ra acid lactic.
- Các nguyên tố đa lƣ ợng: là nhữ ng nguyên tố khoáng mà vi sinh vật đòi
hỏi phỉa cung cấp với liều lƣợng lớn
- Các nguyên tố vi lƣợng: là những nguyên tố khoáng mà vi sinh vật đòi
hỏi phải đƣợc cung cấp với liều lƣ ợng rất nhỏ.
- Các nguyên tố khoáng:
+ P : chiếm tỉ lệ cao nhất trong các nguyên tố khoáng của tế bào vi sinh vật,
có mặt trong cấu tạo của nhiều thành phần quan trọng của tế bào ( acid nucleic,
phophoprotein, photpholipid… )
+ S : là khoáng quan trọng trong tế bào vi sinh vật trong một số acid amin
(xixtrin,xixtein, metioin), một số vitamin (biotin, tiamin… )
+ Mg : nguyên tố vi sinh vật đòi hỏi với lƣ ợng khá cao, tham gia vào nhiều
phản ứng enzyme có liên quan đến quá trình photphoryl hóa.
+ Ca : có vai trò quan trọng đáng kể trong việc xây doing cấu trúc tinh vi của
tế bào,vai trò cầu nối trung gian giữa các thành phần quan trọng của tế bào sống.
+ Zn : tham gia vào nhiều quá trình enzyme, có tác dụng đáng kể trong
việc hoạt hóa các enzyme.
+ Mn : chứa trong một số enzyme hô hấp, có vai trò trong việc hoạt hóa một số
enzyme.
Bảng

6: Thành phần môi trường nuôi cấy
Casein peptone, tryptic digest 10.00 g/l
Cao thịt (Meat
e

xtract)
10.00 g/l
Cao nấm men
(Yeas
t
e

xtract)
5.00 g/l
Glucose 20.00 g/l
Tween 80 1.00 g/l
K
2
HPO
4
2.00 g/l
CH
3
CO
2
Na (Acetat Natrium)
5.00 g/l
(NH
4
)

2
citrate (C
itrat
ammonium)
2.00 g/l
MgSO
4
x 7 H
2
O
0.20 g/l
MnSO
4
x H
2
O
0.05 g/l
Điều chỉnh sao cho pH
khoảng 6.2 - 6.5.
 Ả n h

h
ƣ





ở n g

c ủ a

m ôi

t





r

ƣ

ờ





n g

đ ế n

s ự

s i n h

t

r

ƣ


ở

n





g
v
à







ph

át







t





r

i





ể

n

c

ủ





a






v

i





kh u ẩn

l
a

c

t





i c
Sự sinh trƣởng và phát triển của vi khuẩn lactic chịu tác động của các yếu tố
môi trƣờng nhƣ :

Nhiệt
độ
:
-Hoạt động trao đổi chất là kết quả của các phản ứng hóa học. Vì các phản ứng
này phụ thuộc chặt chẽ vào nhiệt độ nên yếu tố ảnh hƣởng sâu sắc đến các quá
trình sống của tế bào
-Các tế bào sinh dƣỡng của vi khuẩn lactic bị chết ở nhiệt độ cao, protein bị biến
tính
-Nhiệt độ thấp có thể làm bất hoạt quá trình vận chuyển các chất hòa tan qua
màng tế bào chất do thay đổi hình không gian của một số permeaza chứa trong
màng hoặc ảnh hƣởng đến việc hình thành và tiêu thụ ATP cần cho quá trình
vận chuyển chủ động các chất dinh dƣ ỡng.
- Mỗi loài vi sinh vật có khoảng nhiệt độ tối thích khác nhau. Vi khuẩn lactic có
thể
phát triển tốt trong khoảng nhiệt độ từ 15 - 50 C và đƣ ợc phân thành hai nhóm:

Nhóm ƣa ấm (mesophilic): phát triển ở nhiệt độ trung bình,nhiệt độ
phát triển tối ƣ u là :25-35 C
Nhóm ƣa nhiệt (thermophilic): thƣờng phát triển ở nhiệt độ tƣơng đối
cao
37-45 C
pH: có ảnh hƣởng rất lớn đến sự sinh trƣởng và phát triển của các vi
khuẩn lactic. pH tối ƣ u cho sự sinh phát triển của chúng nằm trong
khoảng 5.5 -6.5. Quá trình lên men bị ức chế mạnh tại pH dƣới 4.5.
Oxy: vi khuẩn lactic thuộc loại vi hiếu khí , hàm lƣợng oxy nhiều sẽ là
một chất độc đối với vi khuẩn lactic.

Độ ẩm:
nƣớc là môi trƣờng cho các phản ứ ng trong tế bào do đó độ ẩm là
một yếu tố quan trọng cho sự phát triển của vi khuẩn lactic.
Áp
suất thẩm thấu:
màng tế bào chất của vi khuẩn là màng bán thấm. K
hi nồng độ muối trong môi trƣờng nuôi cấy cao (trên 2%) sẽ ức chế sự phát
triển của vi khuẩn lactic.
3. T

h
an





h

t





r ù n g

m ôi
t





r

ƣ


ờ n g
Môi trƣ ờng sau khi đƣợc pha chế sẽ qua thanh trùng nhiệt để tiêu diệt, ức chế
vi sinh vật và hoạt tính enzyme trong môi trƣờng, tạo điều kiện cho giống phát triển.
Theo lý thuyết, nếu nhiệ t độ thanh trùng càng cao với thời gian càng dài thì mức
độ tiêu diệt và vô hoạt enzyme càng cao, tuy nhiên giá trị dinh dƣỡng của môi trƣờng
sẽ bị giảm:
o Vitamin bị phân huỷ.
o Một phần đƣờng khử và acid amin tham gia phản ứ ng Maillard
làm giảm hàm lƣợng cơ chất cacbon và nguồn nitơ của môi
trƣờng

Trong thực tế, tuỳ thuộc vào giống VS V, thành phần hoá học của môi trƣờng
và mức độ nhiễm VSV trong các nguyên liệu pha chế môi trƣờng mà các nhà sản xuất
sẽ đề xuất chế độ thanh trùng với giá trị nhiệt độ và thời gian thích hợp, thƣờng áp
dụng chế độ thanh trùng dao động trong khoảng 80 - 90 C trong 30 - 60 phút.
 Phƣơng pháp thực hiện: thiết bị ống lồng ống
 Thông số công nghệ
nhiệt độ 85-90
0
C
a. Cấu hình nhiều kênh ; b. Cấu hình nhiều ống
Hình 8 : Thiết bị trao đổi nhiệt dạng ống
4) N

h ân

gi
ốn





g
a. Y

ê

u

c

ầu

Số lƣợng tế bào trong môi trƣờng nuôi lên giá trị cao nhất, trong khoảng
thời gian ngắn nhất, với nhữ ng chi phí thấp nhất về nguyên liệu và năng lƣợng.
Sinh khối thu đƣợc phải có hoạt tính lên men cao, tỷ lệ tế bào chết càng thấp
càng tốt.
Trong quá trình nhân giống cần đảm bảo cho giống đƣ ợc thuần khiết, điều này
rất quan trọng vì nếu giống có lẫn các vi sinh vật lạ thì trong quá trình lên men sẽ
gây hƣ hỏng và làm sản phẩm không đạt yêu cầu và đôi khi còn có hại cho ngƣời tiêu
thụ.
b. C

ơ

s ở

kh oa

h ọc

c ủ a

qu





á

t





r ì n h

n h ân

g i
ốn





g
Chọn môi trƣ ờng với thành phần cơ chất thích hợp để nuôi vi sinh vật.
Chọn phƣơng pháp và các điều kiện nuôi tối ƣu (pH, nhiệt độ, sự
cung cấp oxi, ) cho quá trình tăng sinh khối của giống.
Mục đích: tăng số lƣ ợng VS V
c.

T

i ế n

h

àn





h

n h ân

g i
ốn





g
Để cấy giống, một lƣ ợng canh trƣờng vi khuẩn xác định đƣợc cho vào môi
trƣờng dinh dƣỡng đã đƣợc xử lý nhiệt sau khi điều chỉnh đến nhiệt độ thích hợp. Để
ngăn chặn nhữ ng bất thƣờng trong canh trƣờng, điều quan trọng nhất là lƣợng giống
cấy, nhiệt độ nuôi cấy và thời gian nuôi cấy phải đƣợc giữ không đổi trong suốt tất cả
các giai đoạn.
 Trong PTN:
Giống đƣợc nhân trong các bình cầu. khi nhiệt độ khỏang 37 – 40
o
C,
cho canh trƣờng lỏng vào, tỷ lệ 5% thể tích. Giữ ở 40 – 45
o
C, sau 8 -10h,

giống đạt yêu cầu. có thể dùng nhân giống tiếp tục ở các thể tích lớn hơn.
SƠ
ĐỒ
TỔNG
QUÁT
QUÁ TRÌNH
NHÂN
GIỐNG VI SINH VẬT CHO SẢN XUẤT