Tiểu luận điện di trên gel agarose

Sinh viên thực hiện:
Nguyễn Ngọc Phải
Võ Thị Bích Chi
Trần Thị Hiền
Trần Thị Liên
Chế Thị Nga
1. Điện di là gì?
- Điện di là hiện tượng dịch chuyển của các
vật thể mang điện tích dưới tác động của
điện trường. Sự dịch chuyển này do thành phần
lực điện trong lực Lorentz.
- Điện di hay điện di trên gel (electrophoresis hay
gel electrophoresis) áp dụng trong sinh học phân
tử là một kĩ thuật để phân tích các phân tử DNA,
RNA hay protein dựa trên các đặc điểm vật lý của
chúng như kích thước, hình dạng hay
điểm đẳng điện tích (isoelectric point).
2.Cách tiến hành điện di trên gel-agarose:
a.Chuẩn bị dung dịch đệm và bản gel:
-Dung dịch đệm thường sử dụng trong
điện di agarose và polyacrymid là TBE(Tris-
Boric acid-EDTA) và TAE(Tris-Acetic acid-
EDTA).
-Bản gel được chuẩn bị bằng dung dịch
đệm 1x TBE hòa tan với hàm lượng agarose
cần thiết đặt trong lò vi sóng hoặc đun nóng
đến khi tan hoàn toàn,đổ vào khuôn có các
lượt cài sẵn để tạo bản gel với số giếng nạp
mẫu cần thiết.
-Khi bản gel đã đông cứng,đặt bản gel vào buồng điện di,đổ

dung dịch đệm ngập bản gel khoảng 1-2mm.
b. Nạp mẫu:
-Mẫu ADN được tách chiết enzym giới hạn cắt thành các đoạn
có kích thước nhỏ, được trộn đều vào đệm nạp mẫu có thêm chất
màu tạo thành hỗn hợp có màu xanh để kiểm tra kích thước các
đoạn AND thường chạy đồng thời cùng với mẫu AND chuẩn.
c.Chạy điện li:
-Trong điện li thường sử dụng nguồn điện thế 100V, cường độ
100mmA, thời gian chạy điện ly trong khoảng 40 phút đến 1-2
giờ.Tùy theo chiều dài bản gel và mật độ yêu cầu tachf các phân
tử(có thể dựa vào vị trí các vạch màu, khi các vạch màu chạy
được khoảng ¾ chiều dài bản gen có thể kết thúc điện di).
d.Nhuộm bản gen và soi gen:
-Kết thúc điện di, bản gen được lấy ra nhuộm
Ethyldium-bromid hoặc các phương pháp nhuộm
khác.
-Bản gen sau khi nhuộm ETBR được đặt vào
máy có tia soi UV, để quan sát kết quả điện di, vị
trí các đoạn điện di theo kích thước khác nhau,
quan sát được những vệt sáng màu đỏ cam trên bản
gel hoặc đặt bản gel vào các thiết bị chụp ảnh
chuyên dùng để chụp ảnh.Trường hợp nhuộm bạc
hoặc nhuộm SYBR-GREEN có thể xác định kết
quả bằng mắt thường.
3.Cách đổ gel-agarose:
3.1. Chế tác gel agarose:
3.1. Chế tác gel agarose:



Dưới đây giới thiệu phương pháp chế gel agarose điện di DNA.
3.1.1 Cho đủ lượng agarose (Seakem Agarose, Nusieve Agarose ) cần pha
vào dung dịch TAE 1× trong một bình tam giác theo bảng dưới đây để có
độ phân li nucleic acid thích hợp. Để có dung dịch TAE 1× cần cho thêm
19 lần nước khử ion vào dung dịch gốc TAE 20×.
Nồng độ agarose (%) Độ lớn DNA phân li (kb)
0,3 60 - 5
0,6 20 - 1
0,7 10 - 0,8
0,9 7 - 0,5
1,2 6 - 0,4
1,5 4 - 0,2
2,0 3 - 0,1
3.1.2 Gia nhiệt bằng cách hấp 5 phút
trong nồi hấp cao áp ở 115 °C hoặc bằng vi
sóng.
Chú ý khi dùng lò vi sóng cần quan sát
để tránh trào gel ra ngoài, nên chờ đến khi gel
sôi thì cắt điện, lấy ra (coi chừng bỏng) lắc đều
rồi cho vào làm sôi lần nữa. Lặp lại ba lần cho
agarose tan hoàn toàn.
3.1.3 Cho vào chậu bảo ôn ~50 °C cho đến khi
dịch gel đạt đến khoảng 50 -60 °C (tay chạm
vào được) thì cho vào gel một lượng dung
dịch ethidium bromide để có hàm lượng cuối
cùng của chất màu này là 50 μg/ml. (Nếu
không cho ethidium bromide vào gel lỏng
trước khi rót gel vào khuôn thì ngâm bản gel
vào dung dịch này sau khi đã điện di).
3.1.4 Rót gel vào khuôn đã được chắn hai đầu

bằng băng dán hoặc bằng kẹp, đã cài sẵn lược
(comb) và đặt trên mặt phẳng (xác định bằng
thủy bình kế,tức ligô).
3.1.5 Chờ cho đến khi gel rắn hoàn toàn thì cẩn
thận tháo lược ra khỏi gel.
3.2. Điện di agarose
3.2.1 Tháo bản gel ra khỏi kẹp hoặc băng
chắn, đặt khuôn gel trong chậu điện di ngang,
rót dung dịch đệm vào cho ngập gel.
 chú ý đầu có lỗ lược nằm ở phía
cathode.
3.2.2 Pha nucleic acid cần điện di với dung
dịch màu tải mẫu (điện di) 6× hoặc bằng hợp
chất màu tương tự.
Dịch màu có tỷ trọng cao này giúp nucleic
acid không bị xáo động bởi dòng đối lưu của
dung dịch nên khi tải vào lỗ răng lược thì nằm
gọn trong đó và có màu rõ ràng.
Dung dịch màu tải mẫu 6× (dịch nạp mẫu)
chứa 30% glycerol, 0,25% bromophenol blue
(BPB) và 0,25% xylencyanol (XC).
3.2.3 Bằng micropipet hút mẫu DNA nhỏ vào lỗ răng
lược.
3.2.4 Bật điện một chiều để thực hiện điện di. Cường
độ dòng điện khoảng 50-150 V tùy loại thiết bị điện di.
Thời gian điện di thay đổi phụ thuộc vào độ
lớn của DNA, nồng độ agarose của gel và cường độ
dòng điện.




Chú ý:
Chú ý: lượng DNA có thể điện di trong mỗi lỗ
răng lược nhiều ít tùy kích thước răng lược, nếu quá
nhiều sẽ xuất hiện hiện tượng "tailing" (kéo đuôi)
khó phân li.
3.3.1 Nếu điện di DNA trong gel có pha sẵn
ethidium bromide thì chiếu tia tử ngoại.
3.3.2 Nếu không cho trước ethidium bromide
thì sau khi điện di cần ngâm gel.
30 - 60 phút trong dung dịch thuốc nhuộm này
ở nồng độ 0,5 μg/ml.
3.3 Kiểm tra băng DNA:
3.3.3 Nếu cần chụp ảnh lưu tư liệu thì có thể dùng
máy ảnh pollaroid với ống kính có phin lọc ánh sáng
thích hợp với film pollaroid 667, hoặc dùng thiết bị
phân tích gel số hóa (gel documentation system).
Chú ý: Đèn tử ngoại (UV) có hai loại bức xạ
với bước sóng 254 nm (UV sóng ngắn) và 366 nm
(UV sóng dài). UV sóng ngắn giúp quan sát rõ DNA
nhưng làm tổn hại cấu trúc chất này, cho nên nếu
cần thu hồi DNA từ gel thì không nên áp dụng.

4.Ứng dụng:
- Phát hiện các ADN trên gel.
- Để phát hiện và xác định ADN trong tế bào VSV,
TV-ĐV.
- Điện li thuốc trị liệu: là phương pháp dùng dòng
điện một chiều để di chuyển một số ion thuốc có
tác dụng chữa bệnh cho cơ thể.

- Ngoài ra còn được dùng trong việc nghiên cứu để
phát hiện ra một số loại virut gây bệnh: VR viên
gan B, VK lao, phát hiện ra Samolnela trong sản
phẩm thủy sản…
CÁM ƠN CÁC
BẠN ĐÃ LẮNG
NGHE!