THỰC HÀNH PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM - BÀI 5 docx

Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 24
Homepage:


- Thử nghiệm VP (xem bài 3)

Bài 5. Định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí và tổng nấm men-nấm mốc
5.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản
Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong
điều kiện có oxi phân tử. Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ
vệ sinh của thực phẩm. Chỉ số này được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc
trên môi trường thạch dinh dưỡng từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem 1 khuẩn lạc
là sinh khối phát triển từ 1 tế bào hiện diện trong mẫu và được biểu diễn dưới dạng số
đơn vị hình thành khuẩn lạc (colony forming unit, CFU) trong một đơn vị khối lượng
thực phẩm.
Nấm mốc là vi nấm dạng sợi, sinh sản bằng bào tử hoặc khuẩn ty. Nấm men là
những tế bào đơn tính phát triển theo kiểu nảy chồi, thỉnh thoảng có thể tồn tại ở dạng
khuẩn ty giả trong đó các tế bào kết nhau thành chuỗi. Đơn vị hình thành khuẩn lạc của
nấm mốc và nấm men là mầm để tạo nên một khuẩn lạc khi nuôi cấy trong môi trường.
Mầm có thể là một bào tử, một tế bào hay một đoạn của khuẩn ty. Trong thực phẩm, nấm
mốc và nấm men hiện diện có thể tăng trưởng làm thay đổi màu của thực phẩm, làm phát
sinh mùi hay vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cơ cấu của thực phẩm.

Hình 20: thử nghiệm lên men glucose. Ống
a: đối chứng. Ống b: không lên men
glucose. Ống c: lên men yếu. Ống d: lên
men m
ạ
nh.

Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 25
Homepage:

5.2 Quy trình phân tích

5.3 Cách tiến hành thí nghiệm
Mẫu phân tích: nước mía nguyên chất (dùng 10ml cho một tổ)
1.3.1 Pha môi trường và khử trùng dụng cụ
Bước 1: pha môi trường
Tên môi trường Thành phần Tổng thể tích Ghi chú
SPW
(Saline Pepton
Water)
NaCl : 42.5g
Pepton: 5g
500 ml nước cất Phân phối cho mỗi tổ 27ml
SPW (9ml/ống nghiệm)
trước khi khử trùng. (buổi
5)
Đồng nhất và pha loãng mẫu để có độ pha
loãng 10
-1
, 10
-2
, 10

-3
, 10
-4
…
Chọn 2 nồng độ pha loãng
thích hợp, chuyển 1ml mẫu
vào đĩa petri vô trùng (mỗi
nồng độ cấy 2 đĩa)
Trải 0.1ml mẫu lên đĩa
DRBC, ủ ngửa đĩa ở
25
0
C, 5-7 ngày (mỗi
nồng độ cấy 2 đĩa)
Rót vào mỗi đĩa petri 10-
15ml môi trường PCA đã
được làm nguội đến 45
0
C,
lắc cho mẫu phân tán đều
vào môi trường, ủ ở 30
0
C
trong 72 gi
ờ


Đếm khuẩn lạc nấm
mốc, nấm men
Chọn các đĩa có số khuẩn

lạc trong khoảng 25-250
khuẩn lạc/đĩa để đếm
Tính kết quả: tổng số vi
sinh vật hiếu khí và tổng số
nấm men nấm mốc trong
mẫu (CFU/g hoặc CFU/ml)
Xác định tổng số VK hiếu
khí bằng kỷ thuật hộp đổ
Xác định tổng số nấm men nấm
mốc bằng kỷ thuật hộp trải
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 26
Homepage:

PCA
(Plate Count
Agar)
Casein enzymic
hydrolysate: 5g
Yeast extract: 2.5 g
Dextrose: 1g
Agar: 15g
1000 ml nước
cất
pH 7.0 ± 0.2
Phân phối 100ml PCA cho
mỗi tổ (15ml/petri). (buổi
5)
DRBC

(Dichloran Rose
Bengal
Chloramphenicol
Agar)
Glucose: 10g
Peptone: 5g
KH
2
PO
4
: 1g
MgSO
4
: 0.5g
Rose bengal (dung dịch
5%, w/v): 0.5ml
Dichloran (0.2%(w/v)
trong ethanol): 1ml
Chloramphenicol: 0.1g
Agar: 15g
1000 ml nước
cất
pH 5.6 ± 0.2.
Lưu ý: trộn lẫn
các thành phần
trừ
chloramphenicol,
đun nóng để hòa
tan hết agar, hấp
khử trùng. Để

nguội đến 50
0
C,
bổ sung 1ml
dung dịch kháng
sinh 100X vào
100ml môi
trường.
Phân phối 100ml DRBC
cho mỗi tổ (15ml/petri).
(buổi 5)

Bước 2: khử trùng dụng cụ và môi trường đã pha.
Bao gói dụng cụ và phân phối môi trường vào dụng cụ, gắn nút và bao gói. Hấp
tiệt trùng ở 121
0
C trong 15 phút.
Bước 3: pha loãng mẫu (xem bài 1, mục 1.3.2)
Bước 4: thực hiện như qui trình



Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 27
Homepage:

Cách tính kết quả
Đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ. Chọn số đĩa có số đếm
trong khoảng 25-250 để tính kết quả. Mật độ tổng vi khuẩn hiếu khí hay tổng số nấm men

nấm mốc được tính như sau:
!"#$%&'!()*!#$%&+,
/
01!2!3!2!4156507!2!3!2!87

Trong đó:
A: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn (hay nấm mốc nấm
men) trong 1g hay 1ml mẫu.
N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn
ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i
V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa
fi: độ pha loãng tương ứng.
Nếu ở độ pha loãng cao nhất, số khuẩn lạc đếm được trên một đĩa >250, ví dụ ở
nồng độ 10
-5
số đếm lớn hơn 250, kết quả được ghi: >2.5 x 10
7
CFU/g.
Nếu ở độ pha loãng thấp nhất, số khuẩn lạc đếm được trên một đĩa <25, ví dụ ở
nồng độ 10
-1
số đếm nhỏ hơn 25, kết quả được ghi: <2.5 x 10
2
CFU/g.