Kỹ thuật ELISA trong chẩn đoán nhanh bệnh virus hại cây có múi

I- GIỚI THIỆU BỆNH VÀNG LÁ GREENING (VLG) VÀ MỘT SỐ BỆNH
VIRUS HẠI CÂY CÓ MÚI
1- Bệnh vàng lá greening (VLG)
Triệu chứng bệnh:
Khi bị nhiễm bệnh lá bắt đầu chuyển sang màu vàng ở gân lá và vùng lân cận
rồi cả phiến lá có màu vàng hoặc khảm vàng, đôi khi gân lá bị biến hoá, lá bệnh trở
nên ròn, mép lá uốn cong ra ngoài và thường bị rụng sớm. Các lá non ra sau nhỏ và
biến vàng tương tự như hiện tượng thiếu kẽm. Các cành nhánh bị khô, rễ tơ và rễ
nhánh bị huỷ hoại khiến cây bị suy thoái và chết. Cây bệnh thường ra hoa trái vụ và
có thể vẫn cho quả. Quả sinh ra từ cây bệnh thường bị biến dạng, tâm quả bị vẹo và có
nhiều hạt lép, phẩm chất kém. Bị bệnh sớm cây thường bị tàn lụi ngay trong 1 - 2 năm
sau khi trồng.
Nguồn gây bệnh:
Là vi khuẩn Liberobacter asiaticum. Vi khuẩn hình gậy, kích thước 350 - 550 x 600 -
1.500 nm với vỏ hai lớp, dày 20 - 25 nm. Tuy nhiên vi khuẩn mang tính đa hình nên
có thể gặp dưới dạng que dài hoặc tròn với đường kính 700 - 800 nm. Vi khuẩn sống
trong mạch libe của cây.
Bệnh VLG lây lan qua cành chiết, mắt ghép và côn trùng môi giới - rầy chổng cánh
Diaphorina citri.
2- Bệnh Tristeza (tàn lụi):
Triệu chứng:
Thể hiện chung của bệnh là bộ lá biến vàng nhanh, cây suy thoái và tàn lụi. Ở Việt
Nam hiện nay mới chỉ phát hiện các biểu hiện nhẹ như lá biến vàng và gân nhỏ bị
trong từng đoạn ngắn (ở lá chanh Eureca), đôi khi gặp dạng lõm thân (cam ngọt miền
Nam).
Nguồn bệnh:
Là vi khuẩn Closterovirus dạng sợi thẳng hoặc cong, kích thước 12 x 2000 nm.
Bệnh lây lan qua mắt ghép và cành chiết và côn trùng môi giới là rệp cam, rệp bông
(Toxoptera citricida, Aphis gossypii, Aphis aurantii).
Ngoài hai bệnh trên, trên cây có múi ở nước ta còn gặp ở mức độ chưa phổ biến một
số bệnh virus và tương tự virus Exocortis, Cristacortis

Biện pháp chính phòng bệnh vàng lá greening, tristeza các bệnh virus khác:
1- Vệ sinh môi trường: trước khi trồng mới, những cây cam quýt trong vùng phải
được kiểm tra và chặt bỏ hết các cây bị bệnh.
2- Chỉ sử dụng cây giống sạch bệnh để trồng.
3- Phòng trừ môi giới truyền bệnh và thâm canh tăng sức chống chịu bệnh cho cây.
4- Kiểm tra bệnh thường xuyên để loại trừ cây bệnh kịp thời.

II- KỸ THUẬT TUYỂN CHỌN GIỐNG CÂY CÓ MÚI NHÂN GIỐNG CÂY
CÓ MÚI SẠCH BỆNH

Chương trình nhân giống cây có múi sạch bệnh tập trung vào một số giống cam quýt
đặc sản. Những giống này được bình tuyển qua các Hội thi và tuyển chọn cây cho quả
ngon của các địa phương và Cục Khuyến nông Khuyến lâm. Các tiêu chuẩn cơ bản
tuyển chọn bao gồm:
- Đặc điểm nông học: Phải là cây đại diện
cho giống
+ Về hình thái:
* Chiều cao cây, chiều rộng tán lá, kiểu
phân cành
* Dạng lá, màu sắc lá, chiều dài, chiều
rộng của lá
+ Về năng suất, phẩm chất:
* Dạng quả, màu sắc vỏ, màu sắc ruột, khối lượng quả, số hạt, độ chua, độ đường
- Khả năng chống chịu sâu bệnh:
* Kháng được những sâu bệnh gì ?
* Chống chịu được những sâu bệnh gì ?
* Dễ nhiễm những sâu bệnh gì ?
* Chịu được úng ngập, khô hạn, mặn, chua phèn ?
Những cây có đầy đủ các đặc điểm của giống và được Hội đồng tuyển chọn cho điểm
cao sẽ được chọn là cây đầu dòng ưu tú. Những cây này được cấp chứng chỉ và được

cơ quan chuyên môn hướng dẫn kỹ thuật chăm sóc để lưu giữ nguồn gen. Từ những
cây này, các cành chiết hoặc cành ghép sẽ được đưa về Viện nghiên cứu để lấy đỉnh
sinh trưởng sử dụng kỹ thuật vi ghép tạo cây đầu dòng sạch bệnh (ký hiệu S
o
) phục vụ
cho công tác nhân giống sạch bệnh sau này.
Một số giống cây có múi đặc sản ở miền Bắc Việt Nam:
1- Cam Sành: là giống quýt (King mandarin), dân ta quen gọi là cam, tuỳ vùng trồng
lâu đời mà có các tên gọi sau:
- Cam Sành Bố Hạ: trồng ở Bố Hạ, huyện Yên Thế, tỉnh Bắc Giang. Cam Sành Bố
Hạ ưa đất phù sa cổ, khí hậu mát ẩm. Hiện nay vùng cam này đã bị xoá sổ do bệnh
vàng lá greening.
- Cam Sành Hà Giang - Tuyên Quang - Yên Bái: là vùng cam chủ yếu của các tỉnh
phía Bắc. Cây cao trung bình, thích nghi rộng, năng suất cao. Cam Sành thu quả vào
dịp Tết, khối lượng quả trung bình 150 - 250 g, ngon thơm ngọt đậm.
2- Cam Xã Đoài: nguồn gốc từ vùng Xã Đoài, huyện Nghi Lộc, Nghệ An. Đưa lên
vùng núi cao, mã quả đẹp hơn. Cây cao trung bình, tán lá hơi xoè, thích nghi rộng.
Năng suất cao, khối lượng quả trung bình 200 - 250 g/quả, có 18 - 22 hạt/quả, ngon
thơm, thu hoạch vào tháng 12-1.
3- Cam Valencia: nhập vào Việt Nam từ năm 1971. Quả to hơn cam Hamlin, trung
bình 250 g/quả. Khi chín vỏ quả có màu vàng, ruột màu vàng da cam. Hạt 0 - 3
hạt/quả. Chín muộn vào dịp Tết âm lịch.
4- Cam Ham Lin: là giống của Mỹ, (Hamlin là tên ông chủ vườn ở Mỹ), được đưa vào
Việt Nam từ năm 1971 thông qua Cu Ba. Hamlin là giống chín sớm vào tháng 9 - 10,
vỏ quả mỏng, khối lượng quả trung bình 200 g/quả, ngọt đậm, 0 - 5 hạt/quả.
5- Cam Sông Con: nguồn gốc chọn từ cây gieo hạt ở Nông trường Sông Con, Nghệ
An. Cây cao trung bình, tán gọn, không có gai trên cành, thích nghi rộng. Năng suất
trung bình, khối lượng quả trung bình 200 - 250 g/quả, có 3 - 5 hạt/quả, ngon thơm,
thu hoạch vào tháng 10 - 11.
6- Cam Vân Du: được chọn lọc từ những cây gieo hạt của giống cam Sunkist ở Trại

nghiên cứu cam Vân Du (Thanh Hoá), trồng nhiều ở các nông trường vùng Thanh -
Nghệ - Tĩnh trong những năm 70 - 80. Cây cao trung bình, tán gọn có gai trên cành,
thích nghi rộng. Năng suất cao, khối lượng quả trung bình 180 - 200 g/quả, có 10 - 15
hạt/quả, ngon thơm, thu hoạch vào tháng 10 - 11.
7- Cam Bù Hà Tĩnh: là giống quýt được trồng nhiều ở Nghệ An - Hà Tĩnh. Cây cao
trung bình, khối lượng quả 180 - 220 g, có 3 - 12 hạt/quả, ngọt đậm. Quả chín vào
tháng 12 - 1.
8- Quýt chum: được trồng nhiều ở Bắc Quang - Hà Giang. Cây cao trung bình, quả
chín màu vàng đỏ, nặng 100 - 150 g/quả, có 3 - 5 hạt/quả, chín muộn vào tháng 12 - 1,
ngọt mát, năng suất cao.
9- Cam Canh: là giống quýt đường (Citrus Reticulata Blanco), được trồng nhiều ở
vùng Từ Liêm - Hà Nội và Hoài Đức - Hà Tây. Hiện nay đã được trồng ở nhiều nơi
như Châu Giang - Hưng Yên, vẫn cho phẩm chất tốt.
Cây cao trung bình 3 - 3,5 m; đường kính tán 3 - 4 m; phân cành thấp, lá không có eo,
màu xanh đậm, tán cây có hình dù rộng. Ra hoa tháng 2 - 3. Thu hoạch vào tháng 11 -
12. Quả có hình cầu dẹt, khối lượng trung bình 100 - 140 g/quả. Quả khi chín có màu
đỏ, vỏ mỏng, ruột vàng, ngọt đậm.
10- Bưởi Đoan Hùng: là giống bưởi ngọt được trồng lâu đời ở Đoan Hùng - Phú Thọ.
Cây sinh trưởng khoẻ, cao trung bình 4 - 5 m; đường kính tán trung bình 4 - 6m; lá
xanh vàng. Ra hoa tháng 2 - 3, quả chín vào tháng 10 - 11. Quả tròn, khối lượng trung
bình 0,8 - 1,2 kg/quả. Vỏ quả mỏng khi chín có màu vàng; tép quả màu hung vàng, ăn
có vị ngọt, thơm mát.
11- Bưởi Diễn: có nguồn gốc từ giống bưởi ngọt Đoan Hùng, được trồng lâu đời ở xã
Phú Diễn - Từ Liêm - Hà Nội song chín muộn hơn, mã quả đẹp hơn và trở thành
giống đặc sản của địa phương.
Cây sinh trưởng khoẻ, cao trung bình 3 - 5m; đường kính tán trung bình 4 - 6 m; lá
xanh vàng, eo lá hình tim bầu, đỉnh lá chia thuỳ rõ. Ra hoa tháng 2 - 3, quả chín vào
tháng 11 - 12. Quả tròn hơi dẹt, khối lượng trung bình 0,8 - 1,2 kg/quả. Vỏ quả mỏng
khi chín có màu vàng, tép quả màu hung vàng, khô, ăn có vị ngọt, thơm mát.
12- Bưởi Phúc Trạch: trồng lâu đời ở huyện Hương Khê - Hà Tĩnh. Cây sinh trường

khoẻ, cao trung bình 3 - 5 m; đường kính tán trung bình 4 - 6 m. Ra hoa tháng 2 - 3,
quả chín vào tháng 9 - 10. Quả tròn, khối lượng trung bình 1,0 - 1,5 kg/quả. Vỏ quả
mỏng khi chín có màu vàng, tép quả màu hung vàng, khô, ăn có vị ngọt, thơm mát.

Cây có múi là một trong những cây ăn quả có giá trị kinh tế cao. Hiện nay,
nhiều diện tích trồng cây có múi đạt giá trị trên 50 triệu đồng /năm. Cá biệt có nơi đạt
doanh thu trên 200 triệu đồng /ha như ở nông trường Cao Phong - Hoà Bình, Nông
trường 19 - 5 tại Nghệ An Tuy nhiên ở một số địa phương do nhân giống bằng cành
chiết hoặc mắt ghép trồng và quản lý vườn cây chưa khoa học nên năng suất, chất
lượng tuổi thọ vườn cây thấp, thậm chí trồng sau một vài năm lại phải chặt bỏ.
Từ năm 1997, Viện Bảo vệ thực vật đã ứng dụng kỹ thuật vi ghép đỉnh sinh
trưởng, kỹ thuật PCR, ELISA để chẩn đoán bệnh Greening và Tristeza đã làm sạch
bệnh và lưu giữ trong nhà lưới chống côn trùng nhiều giống cây có múi phổ biến ở
các tỉnh phía Bắc như: Bưởi Phúc Trạch, Bưởi Diễn, Bưởi Đoan Hùng, Cam Xã Đoài,
Cam Sông Con, Cam Vân Du, Cam Valencia, Cam Bù, Cam Canh, Cam Sành, Quýt
Bắc Sơn Đồng thời đã đề xuất và triển khai hệ thống nhà lưới 3 cấp sản xuất giống
cây có múi sạch bệnh. Hệ thống này đang phát huy hiệu quả tại Hà Giang, Tuyên
Quang và Nghệ An với công suất 135.000 cây /năm.
Các kết quả nghiên cứu sản xuất giống sạch bệnh và phát triển các giống cây
có múi đặc sản ở các địa phương của Viện bảo vệ thực vật trong những năm vừa qua
dựa trên 5 tiến bộ kỹ thuật, bao gồm:
1. Qui trình kỹ thuật vi ghép đỉnh sinh trưởng để làm sạch bệnh Greening và
các bệnh vi rút khác
2. Qui trình ứng dụng kỹ thuật PCR để chẩn đoán bệnh Greeng và ELISA để
chuẩn đoán bệnh Tristeza trên cây có múi
2.2 Quy trình chẩn đoán nhanh bệnh Tristeza bằng phương pháp ELISA
Quy trình này gồm 6 bước:
Bước 1: Chuẩn bị đĩa phản ứng.
Bước 2: Chuẩn bị dịch chiết.
Bước 3: Cho kháng thể.

Bước 4: Cho chất tổng hợp.
Bước 5: Pha viên phản ứng.
Bước 6: Đọc kết quả bằng máy đọc ELISA.
(Giữa các bước đều phải rửa đĩa bằng dung dịch PBS)
Kỹ thuật Elisa (Enzyme-linked Immunosorbent assay)
(Còn gọi là kỹ thuật hấp phụ miễn dịch gắn enzym)
ĐN: Elisa là một kỹ thuật sinh hóa để xác định KN VSV hoặc KT đặc hiệu
chống VSV trong mẫu xét nghiệm
Ứng dụng: Là kỹ thuật có độ chính xác cao, nhanh, nhạy, dễ thực hiện nên
được sủ dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu ứng dụng CNSH trong: y học,
nông nghiệp, đặc biệt là trong các qui trình kiểm tra an toàn chất lượng các sản phẩm
sinh học
Nguyên tắc: Dựa vào tính đặc hiệu của phản ứng KN-KT. Để phát hiện, KT
thường được gắn với 1 enzyme nhất định (phosphataza kiềm, peroxidaza…)
Nếu muốn định tính và định lƣợng KT đặc hiệu chống VSV trong các mẫu
nghiên cứu
1. Nhỏ KN VSV đã biết cho gắn lên thành giếng, rửa nhẹ để loại bỏ
KN không bám
2. Nhỏ tiếp huyết thanh bệnh nhân chứa KT cần xét nghiệm rồi. Ủ 5
phút. Nếu huyết thanh chứa KT đặc hiệu sẽ tạo phức KN-KT. Rửa
nhẹ để loại bỏ những KT không đặc hiệu nên không bám
3. Nhỏ tiếp huyết thanh bệnh nhân chứa KT cần xét nghiệm rồi. Ủ 5
phút. Nếu huyết thanh chứa KT đặc hiệu sẽ tạo phức KN-KT. Rửa
nhẹ để loại bỏ những KT không đặc hiệu nên không bám
4. Thêm cơ chất thích hợp với enzym. Enzym gắn với antiglobulin sẽ
phân hủy cơ chất từ không có màu biến thành sản phẩm có màu. Đo
cường độ màu ở bước sóng hấp thụ thích hợp (cường độ màu sẽ tỉ lệ
thuận với lượng KT trong huyết thanh)
1

TIỂU LUẬN

CÁC KỸ THUẬT ELISA

2



1. Đặt vấn đề:
Trong các nghiên cứu thí nghiệm, thực nghiệm cũng như thực tế phát hiện và
điều trị các bệnh lý
trên người, động vật và thực vật, lĩnh vực chẩn đoán luôn đóng một vai trò
thiết yếu. Trong số những
kỹ thuật quan trọng trong chẩn đoán, không thể không kể đến ELISA. ELISA
là kỹ thuật được sử
dụng rất rộng rãi trong y dược, thú y và bệnh lý thực vật, và cho đến nay vẫn
là một trong những
phương pháp chẩn đoán quan trọng nhất trong miễn dịch học cũng như một số
lĩnh vực khác. Qua
quá trình phát triển, nghiên cứu và ứng dụng thực nghiệm, ELISA đã có nhiều
cải tiến và biến đổi,
phân thành nhiều kỹ thuật nhỏ nhằm phù hợp cho từng trường hợp, từng điều
kiện, từng đối tượng
cụ thể. Sự đa dạng của ELISA dẫn đến sự cần thiết phải có một cái nhìn tổng
thể, bao quát và so
sánh cụ thể từng biến thể của ELISA nhằm lựa chọn và sử dụng các kỹ thuật
trên một cách phù hợp
nhất cho từng hoàn cảnh. Đó chính là mục đích của bài viết này.

2. Tổng quan:
Enzyme-linked immunosorbent assay, hay còn gọi là ELISA, enzyme

immunoassay hay EIA là
kỹ thuật chẩn đoán dựa trên miễn dịch học rất phổ biến trong rất nhiều lĩnh
vực, từ y học, y dược,
thú y, sinh học, kiểm định thực phẩm, môi trường v.v… ELISA phổ biến rộng
rãi nhờ vào những đặc
tính có lợi cho thực nghiệm của nó: dễ thực hiện, tốc độ nhanh, chi phí thấp,
dễ sản xuất, an toàn với
độ nhạy và độ đặc hiệu chấp nhận được.
Tiền thân của ELISA là kỹ thuật miễn dịch học phóng xạ (radioimmunoassay
– RIA), được phát
triển bởi Rosalyn Sussman Yalow và Solomon Aaron Berson (xuất bản lần
đầu tiên năm 1960;
Nobel y học cho Rosalyn S. Yalow năm 1977). Mặc dù phương pháp này có
độ nhạy và độ đặc hiệu
rất cao, tuy nhiên việc đánh đấu bằng phóng xạ yêu cầu kỹ thuật cao, phức tạp,
tốn kém, cũng như
việc sử dụng phải vô cùng cẩn thận vì khả năng gây nguy hiểm của phóng xạ
đã đưa đến nhu cầu tìm
kiếm các phương pháp cải tiến thay thế.
Để thay cho việc sử dụng chất đánh dấu phóng xạ, người ta đã sử dụng kỹ
thuật liên kết kháng
nguyên hoặc kháng thể với một enzyme (enzyme-linked) có khả năng thực
hiện một phản ứng nhận
biết (ví dụ như gây đổi màu một chất). Quy trình liên kết enzyme được phát
triển độc lập bởi Stratis
Avrameas và G.B. Pierce. Bên cạnh đó, việc cần phải loại bỏ các kháng
nguyên/kháng thể thứ cấp
không gắn dẫn tới kỹ thuật cố định các kháng nguyên/kháng thể sơ cấp
(immunosorbent) được công
bố bởi Wide và Jerker Porath năm 1966. Năm 1971, hai nhóm nghiên cứu

Peter Perlmann và Eva
Engvall cùng với Anton Schuurs và Bauke van Weemen đã độc lập công bố
các bài báo tổng hợp
các kỹ thuật trên thành ELISA.

3. ELISA – nguyên lý cơ bản và các biến thể:
3.1. Nguyên lý cơ bản:
Theo nguyên lý cơ bản của miễn dịch học, mỗi một kháng nguyên (antigen)
có nhiều yếu tố
kháng nguyên (epitope), mỗi một epitope có khả năng kết hợp với một kháng
thể (antibody) tương
ứng với nó. Hầu hết các kháng nguyên đều có một hoặc vài epitope đặc trưng
cho nó, dựa trên đó mà
người ta có thể xác định được kháng nguyên. Bên cạnh đó, sự xuất hiện của
kháng nguyên trong cơ
thể trong một số trường hợp có khả năng kích thích cơ thể tạo ra kháng thể
đơn dòng đặc hiệu để
chống lại kháng nguyên đó. Thông qua việc xác định kháng thể này người ta
cũng có thể gián tiếp
xác định kháng nguyên trong cơ thể. 3
Dựa trên cơ sở đó, kỹ thuật ELISA được thiết lập nhằm chẩn đoán sự hiện
diện của một kháng
nguyên hay kháng thể. Để xác định một yếu tố cần chẩn đoán (kháng
nguyên/kháng thể) người ta sử
dụng một hoặc nhiều yếu tố phát hiện (kháng thể/kháng nguyên/bổ thể) có
phản ứng miễn dịch đặc
hiệu với yếu tố cần chẩn đoán. Các yếu tố phát hiện này được đánh dấu bằng
enzyme sao cho phản
ứng miễn dịch với yếu tố cần chẩn đoán sẽ tạo nên sự thay đổi có thể nhận biết
được bằng mắt

thường hay thậm chí định lượng được bằng các công cụ so màu khác khi cho
cơ chất của enzyme
đánh dấu vào.

3.2. Các biến thể của ELISA:
Mặc dù nguyên tắc của ELISA khá đơn giản, nhưng qua quá trình thực
nghiệm sử dụng đã vấp
phải khá nhiều vấn đề, từ các vấn đề về hiệu quả của phương pháp như độ
nhạy, độ đặc hiệu, giới
hạn phát hiện cho đến những vấn đề về thực nghiệm như thời gian thực hiện,
độ phức tạp, chi phí
cũng như khả năng hệ thống hóa thành bộ dụng cụ (KIT) để sản xuất công
nghiệp. Chính vì vậy,
người ta đã không ngừng cải tiến phương pháp này, đưa ra nhiều phương pháp
mới phù hợp với từng
điều kiện, từng đối tượng khác nhau. Cho đến nay, đã có rất nhiều biến thể đa
dạng của ELISA. Tuy
nhiên nhìn chung, tất cả các biến thể này có thể được phân loại như sau:
• ELISA dị pha (heterogeneous), hay còn gọi là ELISA pha rắn (solid phase),
gồm các phương
pháp:
- ELISA trực tiếp (direct ELISA)
- ELISA gián tiếp (indirect ELISA)
- ELISA sandwich
- ELISA cạnh tranh (competitive ELISA)
• ELISA đồng pha (homogeneous), gồm các phương pháp ELISA đồng pha
cạnh tranh
(competitive) và không cạnh tranh (non-competitive).
Trong giới hạn bài viết này, chỉ có thể khái quát về phương pháp chung cho
từng loại biến thể

trên. Trong thực nghiệm chẩn đoán, cần có những điều chỉnh thích hợp đối với
từng quy trình cụ thể
cho từng đối tượng khác nhau.
Các ký hiệu quy ước trong các phần sau:
] Bề mặt rắn
Ag Kháng nguyên mẫu. Ở đây quy ước là những yếu tố cần xác định trong
mẫu
có mang các yếu tố kháng nguyên (epitope) và có thể là một loại kháng thể.
Agc Kháng nguyên cạnh tranh
Ab Kháng thể
E Enzyme
AAb Kháng kháng thể
. Liên kết giữa chất cần đánh dấu và chất đánh dấu
= Liên kết với bề mặt rắn
– Liên kết miễn dịch

3.2.1. ELISA dị pha:
Trong ELISA dị pha, các yếu tố cần chẩn đoán được tách ra khỏi hỗn hợp
dung dịch mẫu bằng
cách cố định lên một bề mặt rắn (có thể là nhựa, thủy tinh, giấy, màng
nitrocellulose, agarose,
polyacrylamide gel hay thậm chí vi khuẩn được cố định) tạo thành hai pha cố
định và tự do, theo sau
là môt bước loại bỏ pha tự do. Yếu tố phát hiện được thêm vào sau đó để phát
hiện sự hiện diện của
yếu tố cần chẩn đoán còn lại trên pha cố định thông qua hoạt tính của enzyme.
Các phương pháp cố
định các yếu tố lên bề mặt rắn và loại bỏ pha tự do sẽ được đề cập đến trong
phần 4.1. 4

3.2.1.1. ELISA trực tiếp:
Phương pháp này ít được sử dụng trong ELISA định lượng mà thường được
sử dụng cho ELISA
định tính. Yếu tố cần chẩn đoán (ví dụ như kháng nguyên) được cố định trực
tiếp lên một bề mặt rắn
và sau đó được xác định sự hiện diện bằng yếu tố phát hiện. Phương pháp có
thể được mô tả tổng
quát qua sơ đồ sau:

] = Ag + Ab . E → ] = Ag – Ab . E

Phương pháp này có ưu điểm là chỉ cần một lần ủ do đó tiết kiệm thời gian và
tối thiểu được việc
kiểm soát các điều kiện trong quá trình thực hiện (thay đổi nhiệt độ và buffer
cho mỗi lần ủ, tính thời
gian…). Tuy nhiên, nhược điểm của nó là nhuộm màu nền (background
staining) cao do sự liên kết
không đặc hiệu của kháng thể với bề mặt rắn và các protein cố định trên bề
mặt rắn. Việc đánh dấu
từng loại kháng thể sử dụng cho mỗi kháng nguyên cũng khá tốn kém, nhất là
khi phải chẩn đoán
một số lượng lớn các loại kháng nguyên khác nhau. Ngoài ra, phương pháp
này cũng có giới hạn
phát hiện cao, và cần một lượng lớn các yếu tố cần chẩn đoán do sự liên kết
kém hiệu quả của yếu tố
này lên bề mặt rắn cũng như sự cạnh tranh của các protein khác trong quá
trình phản ứng miễn dịch.

3.2.1.2. ELISA gián tiếp:
Phương pháp ELISA gián tiếp tương tự như ELISA trực tiếp, nhưng ở đây

người ta sử dụng tới
hai lớp yếu tố phát hiện, và chỉ có lớp yếu tố phát hiện cuối cùng mới mang
enzyme. Sơ đồ phương
pháp gồm những bước như sau:

] = Ag + Ab + AAb . E → ] = Ag – Ab – AAb . E

Ưu điểm của phương pháp này là chỉ cần tạo một loại kháng kháng thể mang
enzyme để nhận
biết cho nhiều kháng nguyên khác nhau. Kháng thể sơ cấp cũng là những
protein, và cũng mang
những epitope của riêng nó. Nếu nhiều loại kháng thể khác nhau được sản
xuất từ cùng một loài sinh
vật, tất cả các loại kháng thể này đều mang những epitope chung đặc trưng
cho loài đó. Việc sản
xuất một kháng kháng thể có khả năng liên kết với epitope đó là hoàn toàn có
thể, thông qua việc
tiêm các kháng thể trên vào một loài sinh vật khác. Phương pháp này cũng cho
giới hạn phát hiện
thấp hơn khoảng 10 lần so với ELISA trực tiếp, do khả năng liên kết nhiều
kháng kháng thể lên một
phân tử kháng thể sơ cấp, làm tăng số lượng enzyme được cố định. Tuy nhiên
nhược điểm của nó là
tăng số bước thực hiện do đó làm tăng việc kiểm soát các điều kiện quá trình
và kéo dài thời gian
chẩn đoán.
Nhằm tăng khả năng phát hiện, người ta có thể sử dụng kỹ thuật nối cầu
(brigde) bổ trợ cho
ELISA gián tiếp. Về nguyên tắc, kỹ thuật brigde cũng tương tự như ELISA
gián tiếp, nhưng ở đây

sử dụng nhiều lớp yếu tố phát hiện hơn (trên hai lớp). Qua mỗi lớp yếu tố phát
hiện, tín hiệu lại được
khuếch đại lên vài lần. Tuy nhiên cần lưu ý là càng nhiều lớp yếu tố phát hiện,
số bước thực hiện
càng nhiều và sẽ kéo dài thời gian, tăng thêm việc kiểm soát điều kiện cho
từng quá trình, cũng như
tăng khả năng liên kết chéo giữa các yếu tố phát hiện với nhau. Các kỹ thuật
brigde sẽ được liệt kê
trong phần 4.2.
3.2.1.3. ELISA sandwich:
Tương tự như ELISA trực tiếp và gián tiếp, trong phương pháp này yếu tố cần
chẩn đoán cũng
được cố định lên bề mặt rắn. Tuy nhiên việc cố định này không được thực hiện
trực tiếp mà thông 5
qua liên kết miễn dịch với một yếu tố phát hiện (thường là kháng thể) đã được
gắn cố định sẵn trên
bề mặt rắn. Sơ đồ tổng quát như sau:

] = Ab1 + Ag + Ab2 . E → ] = Ab1 – Ag – Ab2 . E

Sau khi bắt giữ yếu tố cần chẩn đoán, lúc này phương pháp quay lại tương tự
như ELISA trực
tiếp và gián tiếp sau khi đã cố định yếu tố cần chẩn đoán. Người ta có thể sử
dụng một kháng thể liên
kết enzyme để xác định trực tiếp yếu tố trên (như ELISA trực tiếp), hoặc cũng
có thể dùng một trong
số các phương pháp brigde của ELISA gián tiếp. Bên cạnh kháng thể người ta
cũng có thể cố định
một số yếu tố khác lên mặt rắn như Clq, receptor, lectin…
Phương pháp này có khá nhiều ưu điểm vượt trội, thứ nhất là giảm được

nhuộm màu nền và
các phản ứng không đặc hiệu do đã loại bỏ được hầu hết các thành phần tạp,
phản ứng được thực
hiện dễ dàng hơn, Ab1 có thể được gắn sẵn trên bề mặt rắn tạo thành các bộ
KIT và có thể thực hiện
các chẩn đoán mà trong đó kháng nguyên không thể gắn được lên mặt rắn.
Bên cạnh đó nó cũng có
những nhược điểm riêng, quan trọng nhất là làm tăng phản ứng chéo do liên
kết không đặc hiệu giữa
các lớp yếu tố phát hiện thứ cấp với Ab1. Nhược điểm này đã được nghiên
cứu khắc phục bằng cách
chỉ cố định phần đoạn nhánh (Fab) của kháng thể. Tuy nhiên việc làm này có
thể làm giảm độ đặc
hiệu của kháng thể trong xét nghiệm kháng thể đối với các loại virus có quan
hệ về huyết thanh học
(Koenig, 1981; Rybycki và von Wechmar, 1981; Koenig và Paul, 1982).

3.2.1.4. ELISA cạnh tranh:
ELISA cạnh tranh là phương pháp ELISA rất hiệu quả cho định lượng các
yếu tố hiện diện trong
mẫu với lượng nhỏ. ELISA cạnh tranh sử dụng một lượng kháng nguyên cùng
loại với kháng
nguyên mà ta muốn định lượng trong mẫu (kháng nguyên cạnh tranh) cho
phản ứng miễn dịch với
cùng một loại kháng thể đặc hiệu cố định trên mặt rắn, sau đó đo lượng kháng
nguyên cạnh tranh
này thông qua hoạt tính enzyme được liên kết với nó. Kháng nguyên cạnh
tranh càng hiện diện nhiều
cho biết loại kháng nguyên đó trong mẫu càng ít và ngược lại. Có ba biến thể
chính của phương pháp

này:
- Phương pháp bão hòa cân bằng tương đối (quasi-equilibrium saturarion):






Trong phương pháp này kháng nguyên mẫu (Ag) và kháng nguyên cạnh tranh
(Agc) được cho
phản ứng cùng lúc với một kháng thể được cố định. Hai loại kháng nguyên sẽ
phản ứng miễn dịch
với Ab theo một tỉ lệ tương ứng với tỉ lệ nồng độ giữa hai loại kháng nguyên,
từ đó có thể xác định
được nồng độ Ag khi đo tỉ lệ Agc còn lại sau phản ứng với lượng Agc sử dụng
ban đầu. Cần lưu ý là
lượng kháng nguyên cạnh tranh phải được biết trước và phải dư để có thể bão
hòa hết lượng kháng
thể.


- Phương pháp bão hòa thứ tự (sequential saturation):

] = Ab – Ag ] = Ab – Ag
] = Ab + Ag → + Agc . E →
] = Ab ] = Ab – Agc . E

] = Ab – Ag
] = Ab + Ag + Agc . E → ] = Ab – Agc . E 6

Phương pháp này thường được sử dụng hơn bão hòa cân bằng tương đối.
Khác với phương pháp
trên, với bão hòa thứ tự kháng nguyên mẫu được cho phản ứng trước. Sau đó,
một lượng dư kháng
nguyên cạnh tranh được thêm vào để bão hòa lượng kháng thể còn trống. Hoạt
tính enzyme đo được
sẽ cho biết lượng Agc phản ứng với kháng thể còn trống, từ đó tính được
lượng Ag đã chiếm chỗ
kháng thể. Trong phương pháp này, lượng Agc ban đầu không cần phải biết
trước, tuy nhiên vẫn cần
phải dư để bão hòa lượng kháng thể còn lại.
Một biến thể của phương pháp này đó là kháng thể Ab không được cố định
trước, mà sau khi
phản ứng lần lượt với kháng nguyên mẫu Ag và kháng nguyên cạnh tranh Agc
sẽ được cố định lại
bằng cách phản ứng với kháng kháng nguyên AAb được cố định trên mặt rắn.










- Phương pháp ức chế kháng thể (antibodies inhibition):

Thay vì cố định kháng thể lên mặt rắn, người ta cũng có thể cố định kháng
nguyên cạnh tranh.
Đầu tiên, người ta sẽ cho kháng nguyên mẫu phản ứng với một lượng kháng
thể biết trước. Sau đó,
lượng kháng thể còn lại chưa phản ứng sẽ được phản ứng với kháng nguyên
cạnh tranh, và được cố
định lại. Sau bước rửa ta có thể đo lượng kháng thể còn cố định lại và suy ra
lượng kháng thể đã
phản ứng với kháng nguyên mẫu.






Bên cạnh việc định lượng kháng nguyên, phương pháp này còn có thể sử
dụng để so sánh các
kháng nguyên với nhau, như Altschuh và van Regenmortel (1982) đã dùng để
nghiên cứu các
epitope khác nhau trên protein vỏ virus khảm thuốc lá.

3.2.2. ELISA đồng pha:
Phương pháp này thường được sử dụng để định lượng các phân tử nhỏ. Khác
với RIA và ELISA
dị pha, phương pháp này không cần bước tách biệt các yếu tố gắn kết và tự do,
vì nó dựa trên sự thay
đổi hoạt tính của enzyme thông qua phản ứng liên kết miễn dịch.
Ưu điểm lớn của phương pháp này là giảm được mức độ phức tạp của phản
ứng trong việc cố
định các yếu tố lên bề mặt rắn, thời gian thực hiện rất nhanh cũng như giảm

được lượng kháng thể
cần dùng vì không phải tráng một bề mặt rắn lớn. Tuy nhiên nó có nhược điểm
là hầu hết các
Ab – Ag Ab – Ag
Ab + Ag → + Agc . E → + ] = AAb
Ab Ab – Agc . E
] = AAb – Ab – Ag
→
] = AAb – Ab – Agc.E
Ag – Ab . E Ag – Ab . E
Ag + Ab . E → + ] = Agc → Ab . E ] = Agc – Ag . E 7
phương pháp làm thay đổi hoạt tính enzyme cho đến nay đều dựa trên sự thay
đổi về cấu trúc không
gian của các yếu tố gắn kết với enzyme (phần 4.3). Hướng đi này cần có
những thiết kế chính xác về
cấu trúc không gian của các thành phần, một yêu cầu khá phức tạp, tốn kém,
hầu hết chỉ có thể áp
dụng được với các kháng nguyên nhỏ và gây rất nhiều hạn chế trong việc sản
xuất các thành phần
của một phản ứng ELISA. Đây cũng là yếu tố chính đã giới hạn rất lớn kỹ
thuật ELISA đồng pha.
Ngoài ra, kết quả có thể bị ảnh hưởng bởi một số yếu tố khác trong mẫu có
khả năng làm biến đổi
hoạt tính enzyme.

3.2.2.1. ELISA đồng pha không cạnh tranh:
Phương pháp này đơn giản sử dụng enzyme liên kết với kháng thể sao cho
phản ứng miễn dịch
giữa kháng nguyên và kháng thể sẽ thay đổi hoạt tính của enzyme (phương
pháp của Ngo và

Lenhoff, 1981 hay phương pháp của Wei và Reibe, 1977).

3.2.2.2. ELISA đồng pha cạnh tranh:
Đây là phương pháp ELISA đồng pha được sử dụng nhiều nhất. Về mặt miễn
dịch phương pháp
tương tự như ELISA dị pha cạnh tranh, với sự cạnh tranh giữa kháng nguyên
mẫu và kháng nguyên
cạnh tranh. Ở đây kháng nguyên cạnh tranh có thể được đánh dấu với enzyme,
cơ chất của enzyme,
cofactor, inhibitor, v.v… Còn về mặt biến đổi hoạt tính enzyme có nhiều
phương pháp khác nhau
được sử dụng, sẽ được điểm qua trong phần 4.3.


4. Các biến thể trong các kỹ thuật bổ trợ khác cho ELISA:
Trong phần này sẽ đề cập đến một số kỹ thuật bổ trợ khác trong các phương
pháp kể trên của
ELISA. Các kỹ thuật này không nhất thiết cố định cho từng loại ELISA mà có
thể kết hợp tự do tùy
theo nhu cầu và thiết kế của thí nghiệm chẩn đoán.
4.1. Các kỹ thuật cố định các yếu tố miễn dịch lên bề mặt rắn trong ELISA dị
pha:
Chọn lựa bề mặt rắn thích hợp là nhân tố quan trọng trong việc cố định các
yếu tố miễn dịch.
Một bề mặt rắn cần thõa mãn các yêu cầu sau: Khả năng gắn kết số lượng lớn
các yếu tố miễn dịch
(tỉ lệ bề mặt/thể tích cao), khả năng cố định được nhiều loại yếu tố khác nhau,
tối thiểu sự phân tách
ngược lại các yếu tố đã cố định, mức độ phân hủy các phân tử cố định không
đáng kể, định hướng

kháng thể cố định với hai đầu gắn kết quay lên trên và phần thân gắn xuống
mặt rắn.
Có nhiều bề mặt rắn đã được thử nghiệm sử dụng trong ELISA dị pha: nhựa,
thủy tinh, màng
nitrocellulose và giấy, agarose, cellulose, vi khuẩn cố định… Trong phần này
sẽ sơ lược qua từng
loại bề mặt rắn và các phương pháp chung để cố định các yếu tố lên các bề
mặt rắn này.

4.1.1. Nhựa:
Cho đến nay nhựa là bề mặt rắn được sử dụng phổ biến nhất, nhờ vào quy
trình cố định rất đơn
giản. Tuy nhiên, nhựa có một số nhược điểm quan trọng: tốn lượng lớn các
yếu tố cố định, làm giảm
ái lực của kháng thể cố định với các kháng nguyên lớn, tốc độ phản ứng miễn
dịch chậm (hàng giờ
thay vì vài phút so với các yếu tố trong dung dịch), lượng yếu tố gắn kết trên
một đơn vị diện tích
thấp. Có nhiều dạng bề mặt rắn làm từ nhựa: dạng hạt, đĩa, ống, que, dạng đầu
diêm… Trong số đó,
dạng phổ biến nhất là dạng tấm chứa 12 x 8 giếng 0,3 ml làm từ polystyrene
hoặc polyvinylchloride
(PVC). 8
Hình 1: Tấm nhựa chứa 12 x 8 giếng dùng trong ELISA

4.1.1.1. Cố định bằng liên kết không cộng hóa trị:
Phương pháp này cố định bằng cách ủ bề mặt rắn với yếu tố cần cố định được
hòa tan trong dung
môi với điều kiện nhiệt độ và nồng độ nhất định. Bản chất của liên kết chưa
được hiểu rõ, tuy nhiên

liên kết này kém bền và trong quá trình thực hiện ELISA, nếu không có những
biện pháp thích hợp,
yếu tố được cố định có thể sẽ phân tách ngược trở lại.
Có nhiều buffer được sử dụng: 50 mM carbonate, pH 9,6; 10 mM Tris-HCl,
pH 8,5 bổ sung 100
mM NaCl; PBS, chứa 10 mM sodium phosphat buffer, pH 7,2, bổ sung 100
mM NaCl hay cũng có
thể dùng dung dịch saline hay nước khử ion. Nên tránh các chất không phân
cực như Triton X-100
hay Tween 20 vì chúng có thể cạnh tranh rất mạnh với các protein trong liên
kết với mặt rắn. Điều
kiện thường được sử dụng là ủ qua đêm ở 4o
C trong tủ giữ ẩm. Tuy nhiên có thể giảm thời gian ủ
bằng cách tăng nhiệt độ, tăng nồng độ yếu tố cần cố định hoặc thay đổi pH.

4.1.1.2. Cố định bằng liên kết cộng hóa trị:
Phương pháp này rất thuận tiện cho việc sản xuất một lượng lớn bề mặt rắn
tráng các yếu tố miễn
dịch, cũng như cần thiết để cố định các yếu tố miễn dịch hấp thụ kém lên bề
mặt rắn. Một quy trình
đơn giản dùng được cho hầu hết các yếu tố chứa nhóm amino tự do như
oligopeptide hay hapten là
xử lý nhựa polystyrene với glutaraldehyde (Barrett, 1977), giảm pH xuống
khoảng 5 để hoạt hóa
polystyrene kết dính với GA. Sau khi cho yếu tố miễn dịch vào, tăng pH lên 8
hoặc 9,5 để hoạt hóa
GA tạo liên kết với yếu tố miễn dịch.

4.1.1.3. Cố định bằng kỹ thuật bridge:
Người ta có thể sử dụng một số phân tử vừa có ái lực mạnh với nhựa vừa có

khả năng liên kết
các yếu tố miễn dịch làm trung gian để liên kết các yếu tố này với bề mặt
nhựa. Skurrie và Gilbert
(1983) đã tráng bề mặt nhựa với albumin huyết thanh bò, và sử dụng lớp tráng
này để cố định kháng
nguyên rubella. Một số phân tử tích điện dương có thể được sử dụng làm cầu
để cố định DNA mạch
đôi. Khác với DNA mạch đơn, DNA mạch đôi hấp thụ rất kém lên
polystyrene. Klotz (1982) đã
dùng dung dịch protamine sulfate 1% xử lý bề mặt polystyrene. Một số hợp
chất tích điện dương
khác cũng được sử dụng như MBSA (Ferrua và cộng sự, 1983) hay poly-L-
lysiyne (Leipoid và cộng
sự, 1983) 9
4.1.2. Màng nitrocellulose và giấy:
Dạng màng nitrocellulose rất phổ biến trong nghiên cứu về acid nucleic, tuy
nhiên cũng đang trở
nên thông dụng trong protein blotting. Ưu điểm lớn nhất của loại màng này là
cần rất ít các yếu tố
miễn dịch để cố định, ít hơn 1 μl dung dịch có thể được sử dụng và làm khô
trên bề mặt màng, giới
hạn khu vực bám của các yếu tố trong vòng đường kính nhỏ hơn 1 mm.
Những khu vực khác có thể
được khóa bằng protein trơ hay các hóa chất che phủ khác. Một ưu điểm khác
là kháng nguyên có
thể bám được trên loại màng này dù kém hơn khi có mặt các hóa chất không
phân cực như Tripton
X-100 hay Tween.
Hình 2: Màng nitrocellulose dùng trong ELISA

4.1.2.1. Dot protein lên màng:
Phương pháp vô cùng đơn giản là sử dụng micropipete nhỏ dung dịch thành
giọt trên màng, đợi
cho khô rồi tiếp tục nhỏ liên tiếp nhiều lần, sau đó là một bước hấp nóng giúp
ổn định liên kết
protein lên màng. Thay vì sử dụng các chất che phủ các vị trí trống như BSA
hay gelatin, người ta
cũng có thể thêm Tween 20 0,5% trong dung dịch chứa các yếu tố miễn dịch
để ngăn cản các liên
kết không đặc hiệu.

4.1.2.2. Gắn các kháng nguyên tan trong chất tẩy rửa lên đĩa nitrocellulose:
Những đĩa nhỏ đường kính khoảng 4 mm được dập trên màng nitrocellulose
được thả nổi trên
nước cất để làm ướt. Màng ướt được đặt trên giấy thấm và cho 10 – 20 μl mẫu.
Đĩa sau đó được làm
khô và ủ với các chất che phủ để khóa các vị trí trống. Nếu sử dụng Triton X-
100, cần cố định đĩa
với GA nhằm tránh sự phân tách ngược lại của protein.

4.1.2.3. Liên kết cộng hóa trị trên giấy:
Quy trình của Ceska và Lundkvist (1972) để liên kết kháng thể lên giấy sử
dụng các đĩa đường
kính 6 mm dập trên giấy cellulose. Quy trình gồm hai bước: kích hoạt giấy với
cyanogen bromide
(CNBr) và liên kết các yếu tố lên giấy.
Để kích hoạt giấy, ngâm đĩa giấy vào nước cất trong 3 phút, sau đo thêm 600
ml dung dịch
cyanogen bromide (CNBr), tăng pH ngay lập tức lên 10,5 và giữ ổn định pH
này trong 30 phút. Cuối

cùng rửa và sấy khô ở nhiệt độ phòng và trữ ở 4o
C.
Bước liên kết được thực hiện với việc hòa tan 4 ml yếu tố miễn dịch tinh sạch
trong 40 ml
NaHCO3 100 mM ở 4o
C. Thêm 1 g đĩa giấy đã kích hoạt vào và khuấy nhẹ trong 3 giờ ở 4o
C. Rửa
sạch ở nhiệt độ phòng. 10
Phương pháp này cho mức độ hấp thụ các yếu tố miễn dịch gấp 5 – 10 lần so
với phương pháp
liên kết không cộng hóa trị lên nhựa, và mức độ phân tách ngược lại chỉ
khoảng 13%

4.1.3. Thủy tinh:
Yếu tố miễn dịch có thể được gắn lên phiến thủy tinh bằng cách gia nhiệt, cố
định với
formaldehyde hay liên kết bằng glutaraldehyde với que thủy tinh
aminoalkylsilyn.
Theo Conway de Macario và cộng sự (1983) để cố định kháng nguyên thành
giọt, trước tiên rửa
phiến kính với cồn 95o
. Nhỏ một lượng kháng nguyên lên bề mặt phiến kính và cố định theo các
phương pháp sau:
- Với virus: làm khô bằng bốc hơi
- Vi khuẩn và Archaebacteria: hơ nhanh mặt dưới phiến kính bằng đèn cồn ba
lần
- Tế bào động vật có vú: Sấy khô rồi nhỏ một giọt acetone lạnh
- Kháng nguyên không cụ thể: để khô bằng bốc hơi rồi ủ 30 phút với phosphat
buffer saline.
Để liên kết yếu tố miễn dịch với que thủy tinh aminoalkylsilyn, có thể sử

dụng quy trình của
Robinson và cộng sự (1971), Hamaguchi và cộng sự (1976). Đun nóng que
thủy tinh đường kính 3
mm, dài 5 mm ở 500o
C trong 5 giờ. Sau đó ngâm 24 giờ trong dung dịch 3-
aminopropyltriethoxysilan 2% ở 45o
C. Rửa lại với acetone và làm khô. Ngâm 1 giờ trong
glutaraldehyde 1%, rửa lại với 250 mM sodium phosphat buffer, pH 7,5. Sau
cùng ngâm trong dung
dịch yếu tố miễn dịch cần cố định trong 30 phút rồi rửa lại với dung môi dùng
cho ELISA.

4.1.4. Các bề mặt rắn khác:
4.1.4.1. Các cấu trúc ma trận:
Các cấu trúc ma trận có đồng phân không gian như agarose, dextran, allyl
dextrose hay cellulose
có thể được kích hoạt bởi các chất oxy hóa như CNBr hay NaIO4, tạo gốc
aldehyde có thể tạo liên
kết Schiff base với nhóm animo tự do của protein.
Agarose dưới dạng hạt (Sepharose) có những ưu điểm là yếu tố miễn dịch có
thể được giữ dưới
dạng treo, cấu trúc xốp giúp hấp thu kháng nguyên nhiều hơn (10 μl sepharose
có thể hấp thu lượng
kháng nguyên gấp 5 – 40 lần so với một đĩa giấy đường kính 6 mm và gấp 100
lần so với một giếng
nhựa), mức độ hấp thu không đặc hiệu cũng ít hơn.
Các loại bề mặt rắn khác như dextran, allyl dextrose hay cellulose còn có mức
độ hấp thu yếu tố
miễn dịch cao hơn cả agarose. Tuy nhiên dextran dễ bị phân hủy dưới tác dụng
của các chất oxy hóa

mạnh như NaIO4

4.1.4.2. Vi khuẩn chứa protein A (SpA):
Protein A phân lập từ vách của Staphylococcus aureus có ái lực với phần thân
(Fc) của nhiều
kháng thể. S.aureus có thể được cố định bằng trichloroacetic acid (TCA) hoặc
formalin để dùng cho
ELISA. Quy trình của Lindmark (1982) cố định Staphylococci bằng cách đun
trong nước sôi 2 phút,
sau đó cho một lượng tương đương TCA 10% nóng và khuấy. Đun tiếp 90o
C trong 6 phút rồi làm
lạnh nhanh, sau đó ly tâm với potassium phosphat buffer, pH 7,4 để thu vi
khuẩn cố định.

4.1.5. Phân tách pha cố định và pha tự do:
Với các bề mặt rắn lớn (nhựa, thủy tinh, màng nitrocellulose và giấy), phương
pháp phân tách
đơn giản là hút hoặc rửa với một dung môi rửa thích hợp giúp phân tách các
liên kết không đặc hiệu
và giữ ổn định các liên kết đặc hiệu. Bước phân tách đơn giản này là một trong
những nguyên nhân
chính khiến các bề mặt rắn này phổ biến rộng rãi, dù mức độ hấp thụ các yếu
tố miễn dịch của chúng
thấp. 11
Các loại bề mặt rắn khác (hạt agarose, sephacryl, cellulose và vi khuẩn) có bề
mặt hấp phụ lớn,
cho phản ứng miễn dịch nhanh hơn, tuy nhiên cần phải sử dụng một số
phương pháp phức tạp hơn
để phân tách hai pha: ly tâm, lọc, dùng từ trường…

4.2. Các kỹ thuật brigde trong ELISA gián tiếp:
Kỹ thuật brigde có thể hiểu đơn giản là kỹ thuật liên kết giữa yếu tố cần chẩn
đoán và yếu tố phát
hiện mang enzyme thông qua nhiều lớp yếu tố phát hiện trung gian. Các kỹ
thuật brigde không chỉ
giới hạn trong ELISA gián tiếp mà có thể dùng cho các phương pháp khác như
ELISA sandwich hay
ELISA cạnh tranh. Có ba phương pháp brigde chính thường sử dụng trong
ELISA:

4.2.1. Brigde enzyme liên kết miễn dịch (immunologically linked enzyme),
hay còn gọi là ELISA
khuếch đại (amplified ELISA):

] = Ag + Ab1 + AAb + Ab2 . E → ] = Ag – Ab1 – AAb – Ab2 . E

Phương pháp này có ưu điểm là đơn giản và dễ sản xuất các thành phần, thậm
chí có thể sử dụng
enzyme thô. Độ nhạy được tăng cao, tuy nhiên có nhược điểm là AAb cần
phải dư nếu không cả hai
tâm phản ứng của nó sẽ gắn kết với Ab1 và không thể phản ứng với Ab2.

4.2.2. Brigde phức hợp biotin – avidin:
Avidin là một protein bốn nhân có trong lòng trắng trứng các loài chim, bò sát
và lưỡng cư. Mỗi
nhân của avidin có khả năng liên kết khá đặc hiệu với biotin (vitamin
H/vitamin B7). Người ta có thể
sử dụng đặc điểm này để thực hiện phương pháp brigde:

] = Ag + Ab + AAb . biotin + avidin + biotin . E

→ ] = Ag – Ab – AAb . biotin – avidin – biotin . E

Phương pháp này được sử dụng nhiều hơn phương pháp enzyme liên kết miễn
dịch, do ưu điểm
vượt trội là không bị giới hạn bởi loài, nhạy hơn và AAb liên kết biotin không
cần phải ở lượng dư
cũng như việc liên kết với biotin ít ảnh hưởng tới hoạt tính và khả năng hòa
tan của AAb và enzyme.
Tuy nhiên phương pháp này có một vài giới hạn, đó là avidin là một
glycoprotein, và có khả
năng phản ứng với các oligosaccharide, nhiễm sắc thể cô đặc hay protein chứa
biotin khác có trong
mẫu được cố định trên mặt rắn cùng với kháng nguyên, và gây sai lệch kết
quả.

4.2.3. Brigde lectin:
Tương tự như avidin và biotin, lectin cũng có thể được sử dụng trong phương
pháp brigde.
Concanavalin A được biết là có ái lực mạnh với POase (hydrogen-peroxide
oxidoreductase). Sử
dụng Con A làm cầu nối theo sơ đồ sau:

] = Ag + Ab . Con A + POase → ] = Ag – Ab . Con A – POase

Tuy nhiên cần lưu ý là lectin cũng có ái lực với một số đường do đó cần ủ
phức hợp Ab đánh dấu
bằng lectin với một lượng dư đường đặc hiệu với lectin để tránh việc liên kết
không đặc hiệu với các
đường trên mặt rắn. Sau khi phản ứng miễn dịch với kháng nguyên, các đường
này nên được rửa 12

khỏi lectin trước khi thêm enzyme. Phương pháp này cũng có độ nhạy kém
hơn và không có ưu
điểm gì vượt trội so với các phương pháp brigde khác.

4.3. Kỹ thuật biến đổi hoạt tính enzyme trong ELISA đồng pha:
Nguyên tắc cơ bản của ELISA đồng pha là dựa trên sự thay đổi hoạt tính của
enzyme đánh dấu
sau khi có liên kết miễn dịch giữa kháng nguyên và kháng thể. Để tạo ra sự
biến đổi này, có một số
phương pháp đã được nghiên cứu bởi nhiều tác giả khác nhau.
Ngo và Lenhoff (1981) sử dụng hai kháng thể đặc hiệu với hai epitope khác
nhau trên cùng một
kháng nguyên, mỗi kháng thể được đánh dấu bằng một loại enzyme sao cho
sản phẩm do enzyme
này tạo ra sẽ là cơ chất của enzyme kia (ví dụ glucose oxidase như GOase và
peroxidase như
POase). Phản ứng liên kết miễn dịch sẽ mang hai enzyme lại gần nhau, từ đó
tăng hoạt tính tương
đối của enzyme. Phương pháp này được sử dụng cho ELISA đồng pha không
cạnh tranh, tuy nhiên
vẫn còn cần nhiều cải tiến để tín hiệu thể hiện rõ hơn.

Hình 3: Phương pháp của Ngo và Lenhoff (1981)

Một phương pháp khác của Wei và Reibe (1977) gắn trực tiếp enzyme với
kháng thể. Khi kháng
nguyên liên kết miễn dịch với kháng thể sẽ che lấp tâm hoạt động của enzyme,
khiến enzyme không
thể tiếp xúc cơ chất và làm giảm hoạt tính enzyme. Về mặt lý thuyết, phương
pháp này có lợi điểm
là có thể sử dụng cho các kháng nguyên có kích thước lớn, tuy nhiên cần thiết
phải có một thiết kế
chính xác về mặt cấu trúc không gian của kháng nguyên, kháng thể, enzyme
và cơ chất. Thiết kế
không thích hợp có thể làm cho kháng nguyên không che lấp hết tâm hoạt
động của enzyme, hoạt
tính của enzyme sẽ không giảm rõ rệt, trong khi đó nếu enzyme quá lớn có thể
che lấp ngược lại
kháng thể và ngăn cản kháng nguyên liên kết với kháng thể.








Hình 4: Phương pháp của Wei và Reibe

Đối với ELISA đồng pha cạnh tranh, phổ biến nhất là phương pháp của
Rubenstein và cộng sự

(1972), đã được thương mại hóa dưới tên EMIT (công ty Syva). Kháng
nguyên cạnh tranh được gắn
với enzyme sao cho liên kết miễn dịch với kháng thể sẽ làm che lấp tâm hoạt
động của enzyme, và
Ag
Ag
+ Ag
+ Ag X 13
làm giảm hoạt tính. Khi có kháng nguyên mẫu, kháng thể sẽ phản ứng với
kháng nguyên mẫu và tâm
hoạt động enzyme sẽ được giải phóng tự do, tăng hoạt tính.

Hình 5: Phương pháp của Rubenstein và cộng sự (1972)

Phương pháp của Burd và cộng sự (1977) sử dụng kháng nguyên cạnh tranh
gắn với cơ chất của
enzyme. Việc liên kết miễn dịch với kháng thể sẽ ngăn cản không cho cơ chất
gắn vào enzyme.
Kháng nguyên mẫu sẽ cạnh tranh kháng thể và giải phóng các cơ chất này.


















Hình 6: Phương pháp của Burd và cộng sự (1977)
Agc
X
+ Ag
Agc

Ag
Agc
X
+ Ag
Ag
Agc 14
Carrico và cộng sự (1976) đề xuất phương pháp gắn kháng nguyên cạnh tranh
với cofactor hoặc
inhibitor của enzyme. Tương tự như trên, việc liên kết với kháng thể sẽ ngăn
cản cofactor hoặc
inhibitor gắn với enzyme. Sự ngăn cản này sẽ giảm đi khi kháng nguyên mẫu
giành lấy kháng thể, và
sẽ làm tăng hoặc giảm hoạt tính enzyme tùy theo chất liên kết là cofactor hay
inhibitor.

Hình 7: Phương pháp của Carrico và cộng sự (1976)

Một biến thể tương tự phương pháp của Carrico là phương pháp được đề xuất
bởi Bacquet và
Twumasi (1984), gắn kháng nguyên cạnh tranh với advidin. Lúc này advidin
sẽ đóng vai trò tương
tự như inhibitor trong phương pháp trên đối với các enzyme chứa biotin.


















Hình 8: Phương pháp của Bacquet và Twumasi (1984)
Agc
X

+ Ag
Agc
Ag
Agc
X
+ Ag
Agc
Ag
Biotin X
Avidin
Cofactor 15
5. Lựa chọn phương pháp ELISA thích hợp:
Việc lựa chọn ELISA trong số rất nhiều kỹ thuật chẩn đoán cũng như việc lựa
chọn phương pháp
thích hợp nhất của ELISA để dùng vào một xét nghiệm phụ thuộc vào nhiều
yếu tố, quan trọng nhất
là khả năng tìm được kháng thể đặc hiệu, thời gian thực hiện xét nghiệm, giới
hạn phát hiện và yêu
cầu về độ nhạy và độ đặc hiệu.
Nền tảng của kỹ thuật ELISA dựa trên liên kết miễn dịch đặc hiệu, do đó việc
có được kháng thể
đặc hiệu với một yếu tố là điều tiên quyết trong ELISA. Đây là nguyên nhân
chính yếu và quan trọng
nhất khiến ELISA hay một số phương pháp trong ELISA không thể sử dụng
được trong một số
trường hợp, ví dụ như phân biệt các subtype của một số vi khuẩn và virus.
Thời gian thực hiện xét nghiệm cũng là yếu tố rất quan trọng trong thực tiễn.
Mặc dù ELISA là
kỹ thuật có thời gian thực hiện khá nhanh, tùy theo xét nghiệm có thể từ
khoảng một tiếng cho đến

vài ngày nếu sử dụng các bộ KIT ELISA chuẩn bị sẵn, tuy nhiên do yêu cầu
thực tế, đôi khi thời
gian xét nghiệm này vẫn chưa thích hợp, buộc người ta phải lựa chọn các kỹ
thuật khác nhanh hơn
dù tốn kém hơn.
Giới hạn phát hiện của một phương pháp cho biết lượng yếu tố tối thiểu mà
phương pháp có thể
phát hiện được. Mặc dù đã có nhiều phương pháp giúp làm giảm giới hạn phát
hiện, tuy nhiên về
phương diện này ELISA vẫn còn kém khá xa so với các phương pháp dựa trên
phân tử như sắc ký
khối phổ, lai protein, lai nucleic acid, PCR…
Độ nhạy và độ đặc hiệu của một phương pháp cũng phải được tính đến. Độ
nhạy (sensitivity) cho
biết tỉ lệ các mẫu thực sự dương trong số các mẫu được chẩn đoán là dương và
ngược lại, độ đặc
hiệu (specificity) cho biết tỉ lệ các mẫu thực sự âm trong số các mẫu được
chẩn đoán là âm. Trên lý
thuyết thống kê xác suất, việc tăng độ nhạy sẽ làm giảm độ đặc hiệu và ngược
lại. Do đó tùy theo
yêu cầu thực tế của xét nghiệm, cần xác định độ nhạy và độ đặc hiệu thích hợp
nhất. Ví dụ như đối
với xét nghiệm những vi sinh vật nguy hiểm, cần thiết phải tăng độ nhạy để
không bỏ sót trường hợp
dương tính nào. Cũng nên tính đến tỉ lệ dương tính trong số các mẫu. Ví dụ
như đối với hai loại bệnh
có mức độ nguy hiểm như nhau, tuy nhiên một loại bệnh có tỉ lệ mắc trong
dân cư thấp, thì yêu cầu
phải tăng độ đặc hiệu nhằm giảm số lượng những ca chẩn đoán nhầm. Sau khi
xác định được độ

nhạy và độ đặc hiệu cần thiết, việc lựa chọn một kỹ thuật hay một phương
pháp có các thông số
tương thích cũng là một vấn đề không dễ dàng. Độ nhạy và độ đặc hiệu của
một kỹ thuật hay một
phương pháp biến thiên tùy theo bản thân kỹ thuật hay phương pháp đó (ví dụ
ELISA gián tiếp có độ
nhạy cao hơn nhưng độ đặc hiệu kém hơn so với ELISA trực tiếp), khả năng
đáp ứng của phương
pháp đối với từng loại mẫu (ví dụ các mẫu nhiều chất tạp như huyết thanh sẽ
làm giảm độ đặc hiệu
của các phương pháp ELISA trực tiếp và gián tiếp do nhuộm màu nền cao),
từng đặc tính của kháng
thể và enzyme, từng điều kiện thí nghiệm (nhiệt độ, pH, các thiết bị…). Người
thực hiện xét nghiệm
cần linh hoạt, lựa chọn và kết hợp các phương pháp khác nhau tùy theo điều
kiện thực tế của mình
để đạt được độ nhạy và độ đặc hiệu cần thiết.
Ngoài những yếu tố tiên quyết trên, cũng cần tính đến những yếu tố tùy chọn
khác như mức độ
phức tạp, độ an toàn, khả năng hệ thống hóa và chi phí cho một xét nghiệm.
Về phương diện này,
ELISA có ưu điểm là rất đa dạng về phương pháp, cho phép nhiều lựa chọn
trong thực tiễn.

6. Kết luận:
Mặc dù đã có sự xuất hiện của nhiều phương pháp mới, ELISA cho đến nay
vẫn là một trong
những kỹ thuật quan trọng nhất trong miễn dịch học và nhiều lĩnh vực khác,
nhờ vào tính đơn giản,
nhanh chóng, khá đặc hiệu và giá thành thấp. Chính vì vậy, ELISA đã không

ngừng được cải tiến và
nhiều phương pháp khác nhau tiếp tục ra đời nhằm hoàn thiện và tối ưu hóa kỹ
thuật này trong từng
trường hợp cụ thể. Qua những phương pháp và kỹ thuật tổng quát nhất được
thảo luận trên đây, 16
chúng ta có thể thấy được phần nào sự đa dạng của kỹ thuật ELISA. Sự đa
dạng này cho phép có
nhiều lựa chọn hơn trong sử dụng ELISA, tuy nhiên nó cũng yêu cầu người
thực hiện càng cần phải
nắm rõ tất cả các biến thể này nhằm lựa chọn được phương pháp tối ưu nhất,
đồng thời cũng cần có
sự linh động cần thiết để kết hợp và thay đổi một cách hiệu quả để tạo ra một
quy trình cụ thể cho
từng thí nghiệm, từng xét nghiệm chẩn đoán. Nếu thực hiện được điều này,
ELISA có thể trở thành
một công cụ rất mạnh cả trong nghiên cứu lẫn trong thực tiễn.



Tài liệu tham khảo:
R.H. Burdon, P.H. van Knippenberg, 1985, Laboratory Techniques In
Biochemistry And Biology,