Thực nghiệm thành phần hóa học lá cây cốc đồng

Struchium sparganophorum

Nguyeãn Thò Thu Traâm








CHÖÔNG 4

Struchium sparganophorum Thực nghiệm

Nguyễn Thò Thu Trâm

Trang 57
4.1 HÓA CHẤT – THIẾT BỊ
4.1.1 Hóa chất
¾ Dung môi dùng trong sắc ký cột và sắc ký điều chế, sắc ký lớp mỏng gồm: eter
dầu hỏa (60
o
C - 90
o
C); benzen; cloroform; acetat etyl; aceton; metanol và etanol
đều là hóa chất Trung Quốc và được làm khan bằng Na
2
SO
4
nếu sử dụng lại.
¾ Silica gel Merck 60 H (15 – 40 μm) loại dùng cho sắc ký lớp mỏng, trích pha
rắn.
¾ Silica gel 60 (0,040 – 0,063 mm), Merck dùng cho sắc ký cột cổ điển.
¾ Thuốc thử: để hiện hình các vết hữu cơ bằng sắc ký lớp mỏng, phun xòt bằng
dung dòch acid sulfuric 50%, thuốc thử hiện hình flavon : dung dòch FeCl
3
.
4.1.2 Thiết bò
¾ Các thiết bò dùng để ly trích (lọ thủy tinh, becher).

¾ Máy cô quay chân không Buchi –111 kèm bếp cách thủy Buchi 461 Water Bath.
¾ Cột sắc ký: cột khô, cột cổ điển.
¾ Thiết bò đo nhiệt độ nóng chảy khối Maquenne.
¾ Máy đo góc quay phân cực KRUSS-Germany, Phòng thực tập Hóa Lý, Khoa Sư
Phạm, Trường Đại Học Cần Thơ.
¾ Các thiết bò ghi phổ:
- Phổ MS : Ghi trên máy quang phổ LC-MSD-Trap-SL.
- Phổ
1
H–NMR,
13
C–NMR, phổ DEPT- NMR 135 và 90, phổ COSY, phổ HSQC
và phổ HMBC : ghi trên máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker ở tần số 500 MHz cho
phổ
1
H-NMR và 125 MHz cho phổ
13
C-NMR.
Tất cả phổ được ghi tại Phòng Phân Tích Cấu Trúc, Viện Hóa Học và Khoa Học
Công Nghệ, Số 18 Hoàng Quốc Việt, Quận Cầu Giấy, Hà Nội.

Struchium sparganophorum Thực nghiệm

Nguyễn Thò Thu Trâm

Trang 58
4.2 QUÁ TRÌNH SẮC KÝ VÀ CÔ LẬP MỘT SỐ HP CHẤT HỮU CƠ
4.2.1 Điều chế cao etanol
Bột lá khô (1kg) được ngâm dầm trong etanol ở nhiệt độ phòng trong lọ thủy
tinh (loại 10 lít), lọc, cô cạn dung môi ở 50

0
C, thu được cao etanol. Lập lại quá trình
trên nhiều lần đến khi trích kiệt.
4.2.2 Điều chế các cao eter dầu hỏa, cao benzen, cao cloroform, cao acetat etyl, cao
metanol
Cao etanol được trích pha rắn trên silica gel, giải ly lần lượt bằng các đơn
dung môi từ không phân cực đến phân cực, theo dõi quá trình bằng sắc ký lớp mỏng
rồi cô quay thu hồi dung môi sẽ thu được các loại cao tương ứng.
4.2.3 Cô lập các hợp chất có trong các loại cao
Tiến hành sắc ký cột (cổ điển) các loại cao trên, sau đó sắc ký cột và sắc ký
điều chế nhiều lần trên những phân đoạn được chọn để cô lập các hợp chất. Toàn
bộ quá trình trên được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng với thuốc thử hiện hình là
dung dòch acid sulfuric 50%, dung dòch FeCl
3
hoặc soi đèn UV.
4.3 THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC
4.3.1 Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn
[2]
Thực hiện tại Bộ môn Vi sinh, Khoa Dược, Trường Đại Học Y Dược TP. Hồ
Chí Minh.
Các loại hợp chất dùng trong thử nghiệm: 3β-henicosanoyloxy-5α-lup-20(29)-
en; hỗn hợp của β-amyrin và lupeol (1:1); (3R,4R,5S)-12(13)a-homo-5,10-seco-8-
oxa-4,5-epoxy-3,4,11-trihydroxy-5-metyl-14-etoxycarabra-1(10),6-dien-9-on và
3,7-dimetylquercetin.

Struchium sparganophorum Thực nghiệm

Nguyễn Thò Thu Trâm

Trang 59

Chủng vi khuẩn: Staphylococcus aureus; Escherichia coli; Streptococcus
faecalis; Pseudomonas aeruginosa; Staphylococcus aureus ATCC 43300 methicillin
resisant (MRSA).
Cách tiến hành: sử dụng que cấy lấy một ít vi khuẩn từ ống nghiệm chứa
chủng, sau đó pha loãng vào trong nước cất vô trùng. Sử dụng Pipetteman hút 1 ml
dung dòch pha loãng có chứa vi khuẩn vào trong các đóa Petri có chứa môi trường
dinh dưỡng. Trải đều vi khuẩn rồi đặt khoanh giấy lọc (đường kính 6,0 mm) đã tẩm
hợp chất khảo sát (nồng độ 10 μg/μl) lên bề mặt thạch, ủ trong tủ ấm ở 36
0
C trong
24 giờ. Sau thời gian trên, đo đường kính vòng vô khuẩn (tính bằng mm) tạo ra xung
quanh khoanh giấy tẩm hợp chất. Dựa vào đường kính vòng vô khuẩn xung quanh
khoanh giấy lọc, xác đònh khả năng kháng khuẩn của các hợp chất.
4.3.2 Thử nghiệm Brine shrimp
[5],[12]
4.3.2.1 Dụng cụ
- Becher các loại : 500 ml, 1000 ml.
- Ống nghiệm, kính lúp, đèn pin, pipette pasteur.
- Pipettman 10-100 μl, 100-1000 μl.
- Lọ thủy tinh.
4.3.2.2 Hóa chất
- DMSO tinh khiết.
- Nước biển, nước cất.
- Acid ursolic (chất đối chứng dương).
4.3.2.3 Nguyên liệu
Trứng Artemia salina Leach

Struchium sparganophorum Thực nghiệm

Nguyễn Thò Thu Trâm

Trang 60
4.3.2.4 Cách tiến hành
* Ấp trứng thành ấu thể
- Cân 0,5 g trứng cho vào becher, ngâm với 300 ml nước cất trong 30 phút. Lọc
trứng, cho vào becher chứa sẵn 500 ml nước biển, giữ nhiệt độ trong khoảng 28-
34
0
C, để yên trong 48 giờ.
- Dùng đèn pin soi cho ấu thể tập trung ở vùng có ánh sáng, dùng ống hút hút chúng
ra một becher có chứa sẵn 250 ml nước biển. Chỉ sử dụng ấu thể nở trong khoảng
thời gian 48-72 giờ.
* Cách pha mẫu
- Pha mẫu cái : cân 20 mg chất khảo sát cho vào lọ, nhỏ vào một ít dung môi
DMSO hoặc dung môi hòa tan chất (tổng thể tích DMSO hoặc dung môi < 100 μl),
có thể đun cách thủy nhẹ để chất tan tốt, thêm 2ml nước biển, lắc đều.
- Pha mẫu chứng
+ Mẫu chứng dương : cân 5 mg acid ursolic, hòa tan bằng 50 μl DMSO rồi thêm 1
ml nước biển, lắc đều.
+ Mẫu chứng dung môi trích chất : cân 20 mg dung môi trích chất cho vào lọ, nhỏ
thêm vài giọt DMSO để giúp dung môi dễ phân tán trong nước, thêm 2 ml nước
biển, lắc đều.
+ Mẫu chứng DMSO : hòa tan 100 μl DMSO trong 2 ml nước biển.
4.3.2.5 Cách tính
* Tính nồng độ
- Mẫu cái : có nồng độ 20mg/2ml, hút lấy 500 μl, 250 μl, 50 μl sau khi thêm nước
biển cho tổng thể tích là 5 ml thì tương đương với các nồng độ 1000 μg/ml, 500
μg/ml, 100 μg/ml, tính tương tự cho các nồng độ khác.