Tổng quan về thành phần dịch trích bã bột cây thông

PHAN TONG QUAN
- — Chương I. ĐẠI CƯƠNG VỀ CÁC CÂY CĨ TÍNH LỢI SỮA

— Chương II. CÁC PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ĐỂ TÌM HIỂU
THÀNH PHẦN HĨA HỌC

CỦA

DỊCH

BÃ HỘT BƠNG BỞI NƯỚC,

TRÍCH


Phần tổng quan - Chương |

Nhiều nghiên cứu đã thực hiện trên hột bông, nhưng chỉ tập trung trên phần

sợi .Với phần hột, các nghiên cứu trên dịch trích bởi eter etil cho chat gossypol,

một sắc tố rất độc, có tính ngừa thai cho đàn ơng ở Trung Quốc [68].Gossypol cịn
có tính ngừa thai cho phụ nữ vì nó cần ƯĨ sự sản xuất sieroid buồng trứng 123|.

Gossypol có khả năng trị ung thư gan, phổi 129 và kháng H.I.V. 142]

BANG

1:

Một số cây thuốc VN có tính lợi sữa theo tài liệu và kinh nghiệm

Đông Y,

srr
i
2
3

LIÊN VIỆT NĂM

TÊN KHOA HỌC

| Bong bong
{Rong gao
| Béng vải

HO

Lygodium Mexuosum
Gossampinus malabarica
Gossypium herbaceum

TÀI LIỆU THAM

Schizaeaceae
Bombacese
Malvaceae

4°
{Cho dé

3 | Cổ sữa

PhyUanthus urinaria
Euphorbia hirta

Euphorbiaceae
Euphorbiaceas

7
8

]Ïï lớn (hoắc hướng)
[1a thd 6 tdng

Hyplis suaveolens
Streptocaulon juventas

Lamiaceae

9

|llat mo

Sesanum

10
1]
12
¡3

[Lá cách
[La mit
|Mướp hương
|Mùi

Premna integrifolia
Artocarpus integrifoba
Luffa cylindrica
Coriandram sativum

6 | Đính lăng

Polyscias fructicosa

Centela

1S | Rau day

Corchorus

16

|Sệp sộp

Ficus

i

Sung

Ficus

i8

|Sữa

Alstonia

scholans

19 | thâu đầu

Ricinus

communis

3 | Thong thao

Teuapanax

31 | Thuốc đồi
22 | Vong nom

Một
38,2 - 51,1

lượng

số

tác

gid

TRUNG

Đỗ Tất lợi |2
Petelot [76]
Petelot

{Petelot
| Petelat

Đỗ Tất Lợi

Petelot

Asclepiadaceae | Đã Tất lợi
Hỗ Tất Lợi

indicum

fd | lau má

FUCHANG,

Araliaceae

Poda Haccao

Verbenaceae
Moraceae
Cucurbitaceae
Umbelliferae

asiaLica

1mbelhferae

oljlorius

Đỗ Ta Lai
Petelot
| Peiclot
Đỗ Tất lợi
Petelot

Pilaceae

Petelot

pumila

Moraceae

Đã Tất Lợi

glomerata

Moraceae

Đỗ

Apocynaceae

Petelot

Euphorbiaceae

|Petelot

Araliaceae

Petelot

Pouzolzia zeylanica

Unticaceae

Đỗ Tất Lợi

Urythrina

Papilionaceae

|Pctelot

da

% protein g6m

papyrifera
indica

nghiên

QUỐC,

năm

cứu

1983

KHẢO

trên

dich

[22]

cho

trích

biét

hệt

Tất Lợi

bởi

là bã

nước

hột

như

bơng

GŨ

chứa

16 loai amino acid, vdi acid glutamic và arginin có hàm

21,3 % va 12,1 % trên tổng số các amino acid,
Năm 1988 .YUNUSKHANOV [71], x4c dinh các anuno acid trong hội bông
của 3 cây Gossypium arboreum, G. barbadense va G, hirsutum. Ca 3 cay déu chita


Phần tổng quan - Chương Ì

amino

acid

—§—

nhu acid aspartic, acid glutamic, glicin va alanin. Céc amino

tính acid chiếm > 25,3%; amino acid có tính ba¿ chiếm
CUONG

[I

có

< 13,6 % trên tổng số

các amino acid.

LE XUAN

acid

cho biết việc thử nghiệm trên con trâu sữa Ấn Độ

với khấu phần gôm rơm và thức ăn tình 7,75 Kg/con/ngày, Nếu giảm khẩu phần cơ

sở nầy xuống 4,6 Kự và bổ sung thêm bánh MUH (rÏ mat va uré), cộng thêm bã hột
bông (0,45 Kg) vẫn duy trì được năng suất sữa của trâu 7 livngay những tăng lợi
tức cho người chăn nuôi lên 2 rupi/ngay.
Nam

1989,

theo GUYOMARCH

[25]

, dich

trích hội bơng

bởi nước

nóng

chứa polisacarid gồm ramnoz, arabinoz, xiloz, manoz va ghicoz, NGu ding chat
trích thơ này để ni chuột cái 3 tháng tuổi, cho ăn 400 mg/ngày
mg/ngày, lượng mỡ sữa trong tuyến vú tăng lên 3 hoặc 4 lần.
Nam

[990 , PAVLOVSKAYA

(Tashkent)

[55], xac dinh ham

hoặc

500

ludng protein

trong hội bông Gossypium hirsuium la 31-40 % , wong G, burbudense 1a 46-48 %
va tong G. herbuceum là 28-30 %.
Năm

Gossypium

1992,

KENT

hirsutum

và

cộng

sự

, 14 chifa enzym

[37],

nghién

cfu

14

mam

của

cây

con

loai glioxisom để chuyển cdc lipid du uit

thành hidrat carbon cần thiết cho sự tăng trưởng của cây con.

Tóm tất, sự nghiên cứu trên hột bông phần đông tập trung trên các phương

pháp ly trích gossypol từ hội bởi các dung mơi hữu cơ ; phần trích ly bã hội bởi
nước chưa được nghiên cứu.

Mục đích của chúng tơi là tim hiểu phần dịch trích của bã hội bơng bởi nước

nóng , làm Lăng tính lợi sữa thco kính nghiệm dân gian,
Cũng như các loại hột nói chung, hội bơng chứa những cấu tử chính như
celuloz, homiceluloz, pelisacarid, protcin, lignin và các chất ở tỷ lệ rất thấp như
protein du ui, glicoproicin ,cnzym, lipid, cdc chất có mầu và các chất vơ cơ.

Mặc dù người ta có thể phân tích các thành phần của thành tế bào, nhưng
chưa có một hình ánh nào về cấu trúc phân tử của thành tế bào của cây được trình
bày về polimer, về các nối liên kết giữa polimer. Thí dụ thành tế bào nhất cấp gồm
các sợi cơ bản là celuloz giống như một lõi kết ứnh có kết cấu trật tự cao, được bao
quanh bởi những vùng vơ định hình gồm những phân tử ccluloz gắn với polisacarid
và glicoprotein một cách lỏng lẻo. Polisacarid pectic va hemiceluloz là chất kết
dính gắn chặt các sợi co luloz.
Hiện nay, chưa có phương pháp nào có thể tách rời một loại chất ra khỏi các

chất nêu trôn, nhất là khi trích ly cây với nước, Vì vậy, nếu thời gian trích ly với
nước kéo đài, các polisacarid khơng tan,
lúc,

acid hữu cơ,

anuno acid sẽ bị trích cùng

Tùy thuộc ngưồn gốc, polisacarid trích ly bởi nước có thể là gơm, chất nhầy,

tình bột, fructan, pecúc, galacturonan. Chúng có thể có trọng lượng phân tử rất lớn


Phan tong quan - Chuong |

SOO

I : Phương pháp tổng quát trích các chất trong thành tế bào thực

vat theo TREVOR

ROBINSON [67].

Ngun liệu thơ

- Trích bằng nước nóng
i

j

Phần khơng lan

Phan tan

- Trích bởi NaOH

17,5 %

- Elanol S0 %

E——___—_—

Phần khơng tan

Ĩ

Phần tan

Phần không tan

j

Phần tan

œ-Ccluloz

- Chal pectic

- Phosphat

- Tỉnh bột

- Monosacarid

- Gơm

- Oligosacarid

- Chất nhầy
Acid hóa

trọng lượng

- Arabinogalacian
- ĐRamnogalacluronan

phân tử thấp
- Chất có mầu

]

Phần trầm hiện

Phần lan

Hemuoe luloz
có trọng hượng

Hemuce luloz

vai trăm ngàn dalon. Thơng
khơng

- Fructan

F

phần tử cao

- Hidrat carbon

có trọng lượng

phân tử thấp

thường ,

polisacarid

lan trong nước, nhưng polisacarid

là

chất

đây

thẳng

ít tan hoặc

thực vật có chức năng dự trữ như hột ,sẽ

phan nhánh và dễ phân tần trong nước để tạo dạng keo.
Các đại phân tử có thể có dạng hình cầu hoặc dạng chuỗi. Đại phân tử hình

cầu phân nhánh mạnh, và chuỗi dây được cuộn lại chặt chế nên bền và để tỉnh chế
như giicogen, albumin, hemoglobin. Đại phân tứ hình chuỗi kéo dài theo một chiều

nên dài, mỏng như sợi tóc, sợi lở và gồm ccluloz trong cây, Nó rất uốn dóo và có

thể cuộn lại thành lối. Các đại phân tử hình chuỗi sẽ nằm cạnh nhau thành bó và


—

=

Phan téng quan - Chuong |

như thế chúng có nhiều điểm tiếp xúc nhau và các đại phân tử sẽ liên kết với nhau
bởi nhiều loại nối, thường nhất là nội hidrogen. Thí dụ như ngun tử hidrogen của
nhóm -NH- của một prolcin và oxigon của nhóm carbonil ở chuỗi đạt phân tử nằm

kế bên. Mặc dù nổi hidrogcn rất yếu (4-8 Kcal/mol) so với một nối hóa trị nhất cấp
-(80- 150 Kecal/mol), nhưng với số lượng lớn của các cầu nối dọc thco chuỗi sẽ làm
các đại phân tử gắn với nhau chặt chẽ,
Các đại phần tử hình cầu,do chỉ có vài điểm tiếp xúc nhau, nên có thể dễ
dàng tách rời nhau,Vì thế, các polimcr hình chuối ít tan hơn các polimer hình

cầu 1471, 1671.

TREVOR

ROBINSON

{67| nêu ra một phương

pháp

tổng quát để trích các

chải trong thành tế bào thực vật được trình bày trong sơ đồ 1,
1.2.2. Mơ tả thực vật cây hơng

Cây bơng là lồi cây nhỏ, sống lâu, lá có 4 đến § thùy, ít nhiều có khía, Hoa
don kom thoo 3 lá bắc lớn có răng cưa; tràng hoa mẫu vàng và trỞ nên đỏ sau khi
nở hoa, Hoa

mọc

ở nách

hoặc

trên nhánh

con

ngắn. Trái có dạng

nang hình khối

bầu dục (4-8 x 3-4) cm, có 3 đến 5 ngăn hình nỗn. Trong mỗi ngăn, có 6 đến 12

hội mang những sợi tợ dài, Những sợi tơ mọc lên từ bề mặt của hột.
Có
arboreum,

4

lồi

bơng

:foai

2 diploid

Gossypium herbaceum),

(Gossypium

A

Chau

vdi

sui

day

va

loat 2 tetraploid Chau

My

vi soi dai rung binh

hirsutum L.) va vdi soi dat (Gossypium

ngan

(Gossypium

barbadense L.) [T2].

Theo PETELOT A. {76|, tất cả các bộ phận của cây bơng đều có tác dụng trị
liệu; cây hạ sốt ; lá, hoa bổ phối. Nước ngâm đậm đặc của lá, hoa có tính chống
viêm. Ở Mỹ.

người da đcn dùng

vỏ rễ làm thuốc phá

thai, Dịch trích hội với nước

nóng có tính lợi sữa, dùng cho phụ nữ đang cho con bú để làm tang lượng bo trong
sữa,
Hột bông nghiên cứu là hội của cây Gossypium

herbaceum ,ho Malvaceae


Phan iéng quan - Chuong I

—8—

Chương 11 CÁC PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ĐỂ TÌM HIỂU THÀNH PHẦN
HOA HOC CUA DICH TRICH LY BA HOT BONG BOI NUGC,

Mười

một (11) phương

pháp khác nhau đã được áp dụng để tìm hiểu thành

phần hóa học cũng như hoạt tính lợi sữa của dịch trích ly bã hột bóng bởi nước Ở
dạng đơng cơ chân không.

H.1. Phương pháp siêu lọc để tách chiết sơ bộ một số cấu tử hóa học của dịch
trích ly bã hột bông hởi nước

:

Trong thập niên 60, nhiều tác giả đã cô lập protcin từ bã hột bông bằng cách

cho kết tủa chất trích ly với dụng dịch muối NaCl 10 %

cộng phosphat

0,1M

ở

pH 7.4 1531, với dụng địch nhosphalt 3 % {15}, với dụng dịch NaC] 2 M {35] hoặc
vdi dung dich NaOH

0,015 N [8]

Cuối thập niên 70, vài tác giả đã cô lập proein trong bã hội bông bằng
phương pháp siêu lọc [41], 1621. Đến cuối thập niên 80, phương pháp siêu lọc được
phát triển thêm , dùng màng lọc với lỗ có đường kính khác nhau để lọc các phân tứ
có trọng lượng phân tử khác nhau, Các tác giả đã dùng phương pháp này để khảo
- sái các polisacarid có trọng lượng phần tử > F0 KD và > 30 KD của 8 loại cây
vùng Trung Á, trong đó có hột cây bơng 139]
HI.2. Phương

pháp định lượng miễn

dịch

phóng xạ (R.LA = RADIO

IMMUNO

ASSAY) để thử nghiệm tính lợi sữa của các phân đoạn siêu lọc :

H.2.1. Các yếu tố có ảnh hưởng đến sự phái triển tuyến sữa :

Với phụ nữ, tế bào của mô tiết chỉ xuất hiện trong lúc mang thai, dưới sự tác
động của steroid buồng trứng (oestrogen, progesteron, corlicoid);, hormon tuyến
yên ( hormon tăng trưởng và nhất là prolacUn).
Ở các lồi động vật có vú, Lyon L. và cộng sự [46] chứng mình rằng steroid

buồng trứng (E2 L7 progostcron) không thể làm phát triển tuyến vú.

thỏ cái, dê cái Nếu

các steroid budng trứng không hiện diện, nhưng

của chuột,

khi cho tác

dụng một lượng cao hormon tuyến yên hoặc cấy tuyến yên vào chuột , có thé
tăng trưởng luyến sữa]491 Khi cho tác dụng chất CB 154 ,mội chất ức chế sự
prolacun ở giai đoạn đầu của việc tiết sữa , sữa sẽ không tiết ra được |33].
Chính prolacun ,chớ khơng phải các steroid buồng trứng ,giữ vai trị chủ
trong việc tiết sữa. Progesteron khơng phải là hormon tuyến sữa chính yếu mà
kết hợp trong quá trình ban đầu với oestrogen làm tăng trưởng tuyến sữa, làm

lam
lạo

yếu
chỉ
các

hormon tuyến sữa khác như prolacun, glucocorticoid, insulin, hormon tăng trưởng
nhạy cảm hơn. Trong sO nay prolactin déng vai ro quan trọng ,cịn khác hormon
kia chỉ góp phần làm tăng khả năng hoạt động của prolacun.


Go

Phần tổng quan - Chương II

Nơi lồi động vật có vú sau khi sinh ,song song với hiện lượng tiết sữa, hàm

. lượng prolacun cũng tăng theo một cách đáng kể trong máu,

Đo đó, nếu dịch trích ly của cây thuốc có ảnh hưởng đến việc kích thích sự

tiết ra sữa, nó cũng kích thích sự tiết ra prolacún. Vì thế ,việc định phan prolactin

trong huyết tương của động vật được thứ nghiệm với chất trích của cây sẽ cho biết

tính lợi sữa của dịch trích cây trên,
Chúng

tơi chọn phương pháp của tác giả MESSINGER

H. G |50]. để đo hàm

lượng prolacun trong huyết tương của trờu và chuột cái bằng phương pháp định
lượng miễn dịch phóng xa , nhằm m hiểu hoạt tính tăng sữa trên trừu và chuột của
các phân đoạn siêu lọc của dịch trích bã hội hơng bởi nước.

Việc thí nghiệm trên các sinh vật sống khơng phải bao giờ cũng đạt được kết

quả khả quan vì mỗi động vậi có độ nhạy cảm hormon

nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự tiết prolacin nơi con trừu,
Hàm

khác nhau. Ngồi ra có

lượng prolactin cda itu thay d6i theo chu kỳ động dục, thời gian ngày

đêm, sự căng thẳng thần kinh khi bị lấy máu lần đầu, nhiệt độ (theo mùa có íL hay
nhiều ánh nắng mặt rời) |6].
Tất cả các phương pháp đo hormon đều sử dụng phương pháp định lượng
chất miễn dịch phóng xạ. Phương pháp này dựa vào sự cạnh tranh giữa một kháng

ngun khơng mang tính phóng xạ và một kháng thể có mang đơng vị phóng xa
với số lượng biết trước, cả 2 sẽ gắn vào một kháng thể đặc biệt, có số lượng biết
trước và số lượng này sẽ íLhơn hoặc bằng tổng số các kháng nguyên ,
Phản ứng chung là :

Ag

+

Ac

———~*

|Ag -Ac]

+

Phức kết tụ giữa
kháng nguyên và kháng thể

Ag

(1)

Với sự hiện diện của một kháng ngun khơng phóng xạ, phản ứng sẽ là :

Ax + Ag + Ac ==>

[| Ag - Ac|+IAg-Ac]+Ag
+ Ag@)

và (2) sẽ cân bằng theo định luật báo toàn khối lượng, Cân

bang nay sẽ đạt được

nhờ một huyết thanh miễn dich dic biét (immusérum spécifique)
giúp cho việc
kết tủa hai phức chất |Ag - Ác |và | Ag - Ac |. Việc định lượng được thực hiện
bằng máy do số phóng xạ.


Vẽ đường biểu diễn chuẩn

|

©

—]

Phan téng quan - Chuong I]

biểu thị số phần trăm của kháng nguyên có

phóng xa nối liền với kháng thể ,khi có sự hiện diện tăng dần của kháng ngun
khơng phóng

kháng

ngun

xXa.Song song, chuẩn

phóng

bị các ống nghiệm

trong đó phần

trăm của các

xa cũng được xác định như trên, những các kháng

khơng phóng xa được thay thế bằng mẫu cần định phan.

HÌNH

ngun

1 : Đường biểu điễn chuẩn

% hoạt tính chung của LAg -Acl
aN

_

Mẫu cần đo

Số đo được

KH,

„Nông độ kháng nguyên

~
0

160

320

Nẵng độ Ag (ngán)

Với Ag” > Ác, ta có đẳng thức :
Bchung

_

B`

_

Ác

Agchung

Ag

Ac
Ag chung

:_ Số lượng kháng thể.
_: Số lượng kháng nguyên chung (Ag + Ag` )

Ag
Ag.

:
:

Ag+Ag’

Số lượng kháng nguyên cần định phân
Số lượng kháng nguyên có gắn phóng xa

H chung:
Số lượng kháng nguyên gắn vào kháng thể,
B
:_ Số lượng kháng ngun phóng xạ bị gắn
Phương trình được biểu dién bằng mội hiperbon dạng

y

=

——

và trong phịng thí nghiệm, các đỡ kiện được xử lý bói chương trình mấy tinh.

11.3. Định phân hàm lượng đường tổng quát bằng phương pháp so màu [74].
Đường trung tính
D-galacioz,
D-glucoz ,
13>-xHoz hay deoxihexoz

thường hiện điện trong
D-mannoz hoặc
những
như

thâo mộc là aldohexoz như
aldopentoz
như D-arabinoz,

L-ramanoz, L-fucoz ( Hình 2).

¬

Phan téng quan - Chuong II
HÌNH 2:

Cấu trúc các đường trung tính trong thảo mộc.

CHO
—T-OH
—— H
—— H
-[†-OH
CH2OH

H
HO
HO
H

l)-galacto⁄

CHO
HO ——H
HO ——H
H ——OH
H -—OH
CH2OH

CHO
H —7—OH
HO ——H
H-—+- OH
H —- OH
CH2OH

l)-mrannioZ

I)-glucoz

CHO

CHO

H -+- OH

H

H —+-OH
HO ——H

HO
H
H
HO

L-fucoz

CHO

——

OH

H

~~

OH

HO —+—H —~

H
OH

HO
HO

————

H
H

HO —†~H

CHO
—TTH
-—7—-OH
—-OH

TH
CH3

CH;OH

CH;OH

CH;
L-ramnoz
Dưới

(ormaldchid,

tác dụng

của

acctaldchid,

D- xiloz
acid

vô

cơ, pcnloz

crotonaldchid

cùng

L- arabinoz
và

với

hexoz

dẫn

trở

xuất

thanh

của

aldehid

furfural

nhv

như

5-hidroximetilfurfural hoặc 5-mectilfurfural và các sản phẩm giảm cấp không chứa

hệ thống nối đôi liên hợp.
Tỉ lệ tương đối giữa dẫn xuất của furfura] với các chất hàm sắc thay đổi tùy
theo nồng độ của acid, nhiệt độ, thời gian phan ứng. Phương pháp này có sai số

trung bình khoảng 9 ‘%.

Định phân bằng phương pháp so màu, các tác chất orcinol, antron, phenol,
cistcin được sử dụng và antron được dùng nhiều nhất.
Cơ chế phản

ứng:

antron

hay 9,10-dihidro-9-oxoantraccn

trong

mơi

acid nóng , kết hợp với sản phẩm giảm cấp của đường, chất dẫn xuất của
để tạo thành chất có màu xanh dương lục |34| (hình 3).
Phan ứng nay hị ức chế bởi các chất oxid hóa và được hoạt hóa hởi
khử hay chất kháng- oxid hóa. Vài tác giả đề nghị dùng chất kháng- oxid
tiourê để ổn định dung dịch antron.
Độ hấp thu cực đại của các chất màu tạo thành từ chất đường ở

trường

furfural
các chất
hóa như
khoảng

620 nm, nhưng độ dài sóng được đo ở 585 nm để tránh hiện tượng giao thoa gây ra
bởi sự hiện diện của các protein cũng cho phẩn ứng với tác chất antron.


Phân tổng quan - Chương H

—12—

Acid uronic cling cho mau yu vdi antron, cé 46 hấp thu cực đại ở 560 nm;

ở 585 nm, độ hấp thu của acid uronic không đáng kể so với độ hấp thu của các chất
dường.

Osammn,

H.Á. Định

phân

acid sialic khơng tác dụng với antron,
các đường

đơn

trung

tính qua dẫn

xuất acetat alditol bằng

phương pháp sắc ký khí 191.
Polisacarid thủy gidi cho monosacarid, sau d6 monosacarid

acctil héa thanh

dan xuat acetat bay hoi , x4c dinh bdi phudng pháp sắc ký khí,
Điều kiện cần thiết để chuyển hóa các polisacarid thành monomer thay đổi
tùy theo câu trúc và thành phần cấu tao monomer cla cdc polisacarid. Với
_polisacarid đơn giản, sự thủy giải rất đễ đàng và khó khăn hơn nếu polisacarid chứa
đơn vị acid uronic hoặc osamin . Các nhóm amino Ở vị trí C-2 của monomer của

hầu hết các polglicosamin bị prolon hóa khi thủy giải, do đó ổn định cầu nối
gHcosic, Muốn bé gấy cầu nối này, cần điều kiện mạnh mẽ bơn với HCI 4 N,

100 °C , 2 giờ.


Phần Tổng Quan - Chương lÏ

—14—

CH,OH
OH
HO

OH

HO

HO

HO

OH

NHạ

.

Glucosamin
(2-amino-2-deoxi-B-D-glucoz)

NHCOCH,

N-acctil glucosamin
(2-acetamido-2-deoxi-B-D-glucoz)}

Với polisacarid chứa đơn vị acid uronic, nghĩa là chứa nhóm -COOH
ở C-6
của monosacarid, cầu nối glicosic sẽ ổn định. Sự thủy giải một cách định lượng
thành đơn vị acid uronie chỉ xảy ra với HE, - 23 ĐC [54] . Sau khi thủy giải và khử,
các dẫn xuất acid aldonic trở thành dẫn xuất trimeHlsẳHll (TMS) do tác dụng với
hexameuil disilazon ; dang acelat cla acid aldonic không bay hơi,
Thông thường sau giải đoạn thủy giải, monosacarid bị khử bởi borohidrur
natriurn NaBHa ,ở nhiệt độ phòng ; ngoại trừ glucoz, ramnoz bị khử chậm hơn,

Các dẫn xuất của bor sẽ tạo phức với alditol, làm ngăn cần sự acell hóa ở
giải đoạn kế tiếp, Các chất này bị loại bởi motanol dudi dang borat trimetil,
Thực

hiện

sự aceHl

hóa

bởi anhidrid

aceblic với

xúc

tác piridim,

Trích

các

acelat alditol vita tao thanh bdi acetal cul.

Chất dẫn xuất acetat alditol rất bên, có tính bay hơi, và thường dùng để phân

tích

đường trung tính bằng phương pháp sắc ký khí 169{, hoặc

gua dẫn xuất 2-aminopiridin [28].

sắc ký lỏng cao ấp

11.5. Phương pháp định phân acid uronie [7A].
Có

nhiều

loại

acid

uronic

như

acid

D-plicuronic,

acid

L-iduronic,

acid

I>galacturonic, acid I-manuronic nhưng cho đến nay, người ta chỉ tìm thấy acid
D-galacturonic va acid D-manuronic wong polosid thực vật

HO
HO

COOH

°

H

HO
H
Acid œ-D-galacturonic

HO
H

H

9

OH

Acid B-D-manuronic


Phần Tổng Quan - Chương H1

—l4—

OH

HO
Acid B-D-glicuronic

HO

Acid a-L-ideronic

Carhazol hay đibenzopirol, trong mơi trường acid, nóng , kết hợp với acid
uronic cho sản phẩm có màu tím đặc biệt |1 7|.

Ome
NH

HOOC

Carbazol

=.
o

CHO

Acid 5-formil furoic

Theo BOWNESS [16], sau khi so sánh phổ hấp thu tử ngoại của nhiều dẫn
xuất của acid [uranic và các sản phẩm giảm cấp của acid uronic bởi H2SÓa, với
sự hiện diện

hoặc

khiếm

diện của carbazol, chính acid 5-formill furoic là nguyên

nhân tạo ra màu.

Sự hấp thu của các mâu thay đối tùy theo loại acid uronic. Hexoz cũng cho

với tác chất carbazol-sulfuric một màu vàng nhạt, nhưng hấp thu cực đại ở 410 nm,

trong khi độ hấp thu cực đại của cdc acid uronic 12 530 nm.
Osamin, acid sialic khéng cho phan dng vdi carbazol-sulfuric.
Protcin không cho hiện tượng giao thoa, ngoại trừ ở nồng độ 200 pg/ml. Neu
nông độ cao hơn 200 Iig/ml, sự giẩm cường độ mầu Xây ra.
Các muối natriam, kaHum, amonium làm giảm cường độ của phần ứng.

Phương pháp sử dụng carbazol tiện lợi, tuy vậy mỗi lần định phân vẫn phải
đo lại các dung dịch acid uronic chuẩn để thiết lập đường biểu diễn chuẩn,
ïl.6, Phương pháp định lượng protein toàn phần

:

Protcin được định lượng thoo phương pháp so màu của LOWHRY

[45] . Cho

đến nay, phương pháp này vẫn còn hiệu quả ,với nhiều cái tiến bằng cách sử dụng
thudc thd Coomassic Brilliant Blue G.250 [65].
Khi phẩm màu Coomassie nối với protein trong môi trường
chuyển màu của dụng dịch từ nâu đỏ qua xanh đương, tương ứng

chuyển độ hấp thu từ 465 mm đến 595 mm,

acid, có sự

với sự dịch


Phần Téng Quan - Chuong II

—l5—

H;

Hạ

HsC,

C;H;

CH,-N&

=

N'

CH;

Na’ O;S

SO;

Na!

OG2H;

Phẩm màu

nhóm

xanh Coomassie Brilliant G-250,

Trudc day, theo DIAMANT

B. [16] , phdm mau gan với protein ngang qua

sulfonic, nhờ lực hấp thu tinh dién. Gan

day, theo COMPTON

S.J.[14]

Coomassie hiện diện ở 3 trạng thái cân bằng : cauon, trung tính và anion với các

mũi hấp thu quang phổ lần lượt là 595, 650 va 465 nm. Dang anion gắn với protein
- dựa trên sự dịch chuyển hấp thu từ 465 mm đến 595 mm. Số lượng coomassic gắn
vào mỗi phân tử protein tỉ lệ với điện tích dương của protein
phân tử chất màu cho | dién tich [64].

Thuốc thử coomassic của hãng PIERCE.
(thí dụ với bovine serum albumin

chất cần trở.

:khoảng từ I,5 đến 3

cực nhạy với nồng độ protcin thấp,

| ug/ml) ; khong bị ảnh hưởng bởi hầu hết các

Phức chất protein - phẩm màu ổn định trong thời gian 60 - 90 phút, ở nhiệt

độ phòng. Tác chất được sử dụng để đo protein và polipeptid có trọng lượng phân
tử >3 KD. Tuy nhiên, do nồng độ phẩm màu thay đổi theo nhiệt độ, nên cần thiết
phải thiết lập đường biểu diễn chuẩn cho mỗi lần đo |59|.
II.7. Định phân Amino Acid bằng máy sắc ký lồng cao áp.
Trong I0 năm gần đây, người ta thường định phân các amino acid bang
phương pháp sắc ký lỏng cao áp, qua dẫn xuất của amino acid với fluorenil
metilchloroformat
(PITC)

[13] va

(FMOC-CI),

orthophtaldialdehid

(OPA),

phenilisotiocianat

6-aminoquinolil-N-hidroxisucinimidil carbamal (AQC),


Phan Téng Quan - Chuong I

—16—

Với FMỌOC

Hy -O-C-nà" ne COO"
Dẫn xuất của FMOCC

Phần ứng xảy ra nhanh ở nhiệt độ phịng; chất dẫn xuất của nó bền trong
nhiều giờ. Dẫn xuất FMOC. bị ảnh hưởng bởi muối và các tạp chất Cần sử dụng
dung mơi hữu cơ để trích sản phẩm trước khi áp dụng sắc ký lỏng cao áp.
Với PILC

(O)-

=C=$ + NH;,-CH.COO
R

Phenilisotiocianat
(PITC)

acid,

pH 8-10

‘

——

Amino acid

NEL NEE-EH-COO
$

Anion phonildHocarbamil aminocarboxil
(PTC)

Ở nhiệt độ phòng, PITC phần ứng tương đối nhanh ( < 20 phút ) với amino
kể cả prolin. Phương pháp này có khuyết điểm là một số dẫn xuất

PTC - amino acid có hiệu suất thấp và thay đổi bất bình thường (như asparlat,

glutamaU,

nhất là khi có sự hiện điện của

muối,

kim

loại, các lon của dụng dịch

độn. Vì thế, sự chuẩn bị mẫu phân tích địi hỏi nhiều giải đoạn như đơng khơ chân
khơng mẫu phân tích, làm bay hơi các chất dẫn xuất của amino acid, tỉnh chế chúng

bằng sắc ký trao đổi ion, cần thời gian ít nhất 105 phút để phân tích một mẫu.

Véi OPA

(orto-phtaldialdchid} |24|

Phương pháp này hiện đang thơng dụng, vì OPA tao thành chất dẫn xuất
nhanh với amino acid, Việc tách các dẫn xuất có thể thực hiện tốt ở nhiệt độ phòng,
với độ nhạy cao,Phương pháp ít cho phần ứng phụ, để thao tác tự động trên may.

Tuy

nhiên,

hidroxiprolin,

OPA

khơng

phản

ứng

Do đó, cần oxid hóa vịng

trực

tiếp

với

amin

nhị

như

prolin,

imino (acid) của prolin bởi cloramim-T,


Phần Tổng Quan - Chương II

—Ì7—

với sự hiện điện của NaBHa, để tạo thành
được biến đổi thành chất dẫn xuất của OPA,

CHO

`“

$
+

CHO

@-phiadiaidehid

4-anuno-I-butanol, Kế đó, chất trên

SR?

pH7,2
Š§R'` + HNCHCOO

Tiol

b

____„

<

Amino acid

con

AN

ee OO

VGi_AQT ISI
6-Aminoquinolil-N-hidroxisucinimil

carbamat

(AQC)

là tác chất cho

dẫn

xuất hồn với amino acid nhất và nhị cấp ,rong vài giây đồng hỗ . Sự tách các chất
dẫn xuất rất dễ bằng sắc ký lỏng cao áp HPLC.
Phương pháp có ưu điểm là các tác chất thừa trỏ thành aminoguinolin
(AMO), với độ hấp thu À cực đại = 520 nm khác
(A cực đại =

hẳn so với dé hấp thu của AQC

395 mm).

AGC
+ HNR,R

Amin nhất

và nhị cấp

+ HạO

nhanh 1 giấy

chậm 15 giây
O
NHạ

Ñ

Acces = 395 am

AMQ

\OH

OF

NHS

Amex = 520 5m

Các phương pháp trên đều có ưu và khuyết điểm, tùy thuộc điều kiện, sử dụng một
trong những phương pháp nêu trên để phân tích các amino acid.


Phin Téng Quan - Chuone H

BANG 2 : Vai amino acid tìm thấy trong cây có.
COO

HẠN -C-H

OY

HạN”- H

H

HẠNˆ-È-H
H

H,C

Alanin(Alanin) —

wt

goo"

H-C-OH

H-C-OH

Serin (Ser)

Treonin (Thr)

ĐO

HN -Ệ-H

bu-p

CH,

CH,

CH,

"NH

coo

HN" -Ê-H

Aspartat

coo

HẠN"- C-H

Hạ

+H,

boo

Hạ

(Asp)

HạN”-C-H
Ci

C,Hs

Phenilalanin (Phe)

goo

HạN”- C-H
CH,

C= CH

HN NH

N-H

C=NH¿`

H

NH,

Lisin (Lis)

Histidin (His)

Arginin (Arg)

COƠ

CoO

CH,

CH,

HN-È-H - H/N-C-H
SH

boo

Glutamat (Glu)

‘cH,

coo

Hạ
Oe

CHS
Hạ

(cH

Leucin(Leu)

coo

C-H

Tirosin (Tin

HC

éH,

HLN*-C-H - HN”

"Hy
CoH,

`CH;

H;N”-C-H

H

Isoleucin (He)

Hạ

coo

H)N*--H

CH,

HạN”-C-H

VahnCVal)

COO

COO

00

H;N”-C-H

CH,

Glicin(Gh)

CoH,

€00

GH
:

CH,

Cistein (Cis)

Metionin (Met)


Phần Tổng Quan - Chuong II

—]9—

L8. Phương pháp sắc ký lọc GEL .
Một trong những phương pháp đầu tiên thường được sử dụng để tính chế các
đại phân tử như protein, acid nucleic hay polisacarid là sắc ký lọc gel
(chromatographic par gel filration). Nguyên tắc của phương pháp là các phân tử
trong dung dịch được tách do kích thước khác nhau của chúng và tách theo phân tử
khối giảm dần. Các gel thơng dụng có tên thương mại như Sephadex, Sephacryl,
Scpharoz. Chất gol là một loại polimcr phân nhánh của dextran va biacrilamid,

- không tan nhưng rất ngậm nước . Nó có dạng hình cầu trịn, đường kính trung bình
là 100 pm,
Làm trương nở gel trong dung môi sẽ dùng trong phép sắc ký ; cho gel vào

cột ; cho tiếp mẫu chất vào đầu cột gol. Khi giải ly, các phân tử có trọng lượng
phân tử nhỏ, phân bố trong dung môi ở khoảng trống giữa các hạt gel, nó cũng có
thể xuyên vào và nằm trong những hạt gol ; các

phân tử có trọng lượng phân tử

lớn, khơng thể chui vào các hạt gol, nằm trong dung dịch , chiếm không gian giữa

các hạt gel .Khi giải ly, phân tử lớn sẽ di chuyển nhanh , ra khỏi cột gel trước tiên.

HÌNH 4 : Sự tách các phân tử do kích thước khác nhau bằng phương pháp sắc ký
lọc gcl

Phân tử lớn

__—_—_
e

C)

-

Phân tử nhỏ

°

(M1

Tùy theo mẫu chất có chứa phân tử có trọng lượng phân tử lớn hay nhỏ ,lựa
chọn

loại gel thương mại có độ chặn từ ! K]) đến 20000 KI.
Ưu điểm của phương pháp là bảo toàn được hoạt ứnh sinh học của protcin

khảo sát, nghĩa là, sau phép sắc ký lọc gol, cấu trúc nguyên thủy của protein vẫn
giữ nguyên.
Khuyết điểm của phương pháp là khả năng tách có giới hạn.Thí dụ : protcin

là chất đa điện phân mà bề mặt của nó mang những tâm ít, nhiều ky nước ; các lâm


—20——

Phần Tổng Quan - Chuong

này có thể tương tác với pha động bằng nhiều cách, làm ảnh hưởng đến thành phần
chất giải ly.
Tùy theo pH của dung dịch độn, lực ion, điểm đẳng điện của protein, có 3
loại tương tác giữa protein với pha ứnh của sắc ký : thí dụ protein có điện tich 4m
trong dụng dịch độn ,bị giải ly lớn hơn dự đoán, so với khối lượng phân tử tương đối
của — nó |!ð9], Vài loại gel thương mại của hãng PHARMACIA (Bảng 3)
BANG
Tên

3: Vai loại gel thương mại của hãng PHARMACIA
Khả năng phân tích

luại gel

dextran

protein dang c4u

Chất cá thể

Kích thước

ap dung

hat gel

tran
Sephacryl 100 HR

1 Q00 - 190000

Sephacry! 200 HR

1000 - 80000

Sephadex G-100F
Sephadex G-100 SF
Superoz 12

1000 - 100000
{000 - 100000

1006 - 300000

Bondage! 11-125

H.8.

(um)
Peptid-protein

25-75

$000 - 250000

Polisacarid .

25-75

4000 - 150000
4000 - 100000
LQ00 - 300000

Đại phân tử
-nt-ntDang cho may FPLC

40 - 120
20 - 50
20 - 40

2000 - 50000

Dang cho may HPLC

20 - 50

Phương pháp sắc ký trao đổi lan

:

11.9,1,Khái niêm tổng quái về thành tế bào thực vật :
Theo TREVOR

load polisacarid

ROBINSON

[671 ., vách

của

thành

tế bào thực vật gồm

rcolulo2, homicc lIlQ2, polsaocarild poobHc. Nhóm

ba

polisacarid pectic

gồm tất cả các polisacarid trích ly từ thành tế bào bởi nước nóng. Hemuiceluloz được

trích bởi dụng dịch kiềm tương đối mạnh và phần bã còn lại sau khi trích kiềm là
celuloz,
Polisacarid pectic 1a hén hợp phức tạp polmer

acid và trung tính [73|., Nó

là thành phần chú yếu trong trái, hội rau .Chuối dây chánh gồm các acid Dgalacturonic ni vdi nhau bằng œ 1-4 va day chánh nầy xen kẻ bởi những đơn vị
L.-ramnoz. L-rammoz nối vào acid uronic bởi C-Í và C-2 của nó để tạo nên góc lệch
- 90” so với trục chánh gọi là khuýu pecbc. Trên những carbon C-2, C-3, C-4 của
ramnoz và acid galacturonic, đơi khi có gắn thêm những đường khác như 6-D-xHoz,
8-ID-galacloz, L-arabinoz. Do chức acid, pecun để tan trong nước,

Cấu trúc tiêu biểu của pecun [79] được trình bày wong hình 5.
Chất pectic của cây tìm thấy nhiều trong tế bào nhấp cấp (55 %) và liên tế
bào, hiện diện nhiều trong cây 2 lá mâm hơn là cây 1 lá mầm. Nó gồm hỗn hợp
araban, galactan, metil eter cla galacturonan, chứa xioz, ramnoz

một khối dị- polimer, có trọng lượng phân tứ lớn gôm

Cá phân

tử là

1000 đơn vị hoặc nhiều hơn,


Phân Tổng Quan - Chuang H

HÌNH

—21—

5 : Cấu trúc phân tử tiêu biểu của pectin.

L-Ramnoz

COOH

Nhánh bên

_OH

ee
&

5

ioe

8

Acid galacturonic

⁄⁄

OH
Nhánh bên (có galacloz, arabinoz, xioz)

—OH

o

HQ.

—

Acid galacturonic

<——

Poctc polisacarid là một hỗn hơn phức tạp của polimor acid va trung tính,
Dong chat trao 46i ion DEAE Sephadex để tách các polisacaril mang tính acid,
ramnogalackironan, ra khỏi polisacaril trung tính như araban, galaclan (khơng gắn
vio DEAE mic đù chúng có gắn mạnh vào ramnogalacturonan) |36].
Ở pH cao, nhiều carbon hidrat hoạt động như anion và có thể tách bởi

trao đối anion,/Trong vài trường hợp , có thể đồng resin trao đổi cation .

resin

H.9.2.Phương pháp sắc ký trao đổi iọn :
Kỹ thuật này dùng để cô lập và tách các chất có mang điện tích,với điều
kiện là một vài chất có thể gắn bằng lực nối tĩnh điện với chất trao đổi ion và một

số chất khác khơng có tính chất trên, thoo tiến trình được mơ tả như hình 6

Ngun tẮc này có thể áp dụng cho chất có mang một loại điện tích đơn

giản, nhưng vẫn có thể áp dụng cho các đại phân tử như protein, mang những điện
tích âm và dương cùng trên một phân tử,

i
Trong

sắc ký trao đổi ion, sự lựa chọn

loại ma

trận (anion

hay cation)

thy

thuộc vào điểm đẳng điện pI của protcin, và độ bền của protein trong một khoảng

pH của dụng dịch.


Phần Tổng Quan - Chuong I

HINH

ae 1

6 : Quá trình trao đối của chất trao đổi lon.

A

+ YH vasgt
Z

Fe

x

Cc

z

|m

~ +X

+

+

le

XOX

fx

- +x

+.

XE XE

gradient

2 +X

-~ +7

+

YH 7
+

Chấm dứt

hiện xong ! phần

~ +7

X

„

Gradient thực

> +YH

= +

D

.

Gradicnt sin

xX

)

+

B

sàng

pr

X

.

xã

:

~ +X

+

+

[YHYHYHYHF

:

+

x

x

| zt zt gt ott

Hình 6A : Chuẩn bị để chất trao đổi lan mang đầy đủ các điện tích.
Hình 6B : Các chất cần phân tích được cho tiếp xúc với chất trao đổi ion trong một
thời gian vừa đủ để thiết lập cân bằng.

Chto tiin
ay

11a cane thion SY

`

-

Dat

Chất trao đổi ion @ + Z
Chất trao đổi ion mang

điện tích âm

C—

s

©

2

© Z

VYHỲ, Z' là các lon đương.

phân tử trung tính và các lon âm khơng gán vào cột sẽ được

Hình ĨC, 6D

wes

chất rao đổiion

=

và X”,

on

Cịn các

loại ra khỏi cật.

; Những ion dương VYHT, 2” gắn vào chất nền duần tự bị đuổi ra khỏi

cột trao đổi ian khi tăng nồng độ X ; để X” có khả năng thay VHỲ và 2 trong cân

hằng trên, hoặc tăng dé pH dé chuyén YH" va Z thank ¥°, ZOH.

Khi nồng độ X” được tăng; lực nổi tày thuộc vao sO dién tich cha YH* va Z*

Chất càng mang điện tích lớn, nồng độ của X” phải càng lớn để duổi nó ra khỔi cội.

(YH

Hoặc

+ ON

khi

===

pH

thay

đổi

lực

Y + HOH hoặc

7

nối

tày

+ ON

2 hoặc VHT càng cao, pH của dụng dịch phải lán,

thuộc

===

pK

cia

loai

ion

ZOH), néu pK chaion

Nói chung, sắc ký trao đổi anion đùng để tách các protein acid và sắc ký trao
đổi caton dùng để tách protein mang tính baz [13] .Tuy vậy,tầy thuộc pH, phân tử
protein c6 thé trở nên âm điện hoặc đương điện. Nếu pH tăng, protein trở nên âm

điện HẠH - CH(R) - COO” và gắn vào chất trao đối anion và nếu pH thấp, acid,
potcin tr nên dương điện

HẠN” - CH(H) - COOH và gắn vào chất trao đổi
cation,