Giáo án điện tử môn sinh vật học: Samonella(Vi Sinh Học) ppt

PGS. TS. Nguyễn Ngọc
Hải
Khoa CNTY -
ĐHNLTP. HCM
Gr-, họ Enterobacteriaceae
Hình trực ngắn, không vỏ bọc, không bào tử
2 loài chính: S. enterica và S. bongori

Salmonella enterica chia 6 loài phụ:
–
ISalmonella enterica
–
II Salmonella salamae
–
IIIa Salmonella arizona
–
IIIb Salmonella diarizona
–
IV Salmonella houtenae
–
VI Salmonella indica

Salmonella bongori có một loài phụ V
Salmonella: Vi sinh học
PGS. TS. Nguyễn Ngọc
Hải
Khoa CNTY -
ĐHNLTP. HCM
* Nhóm gây bệnh trên người: Sal. typhi,
Sal. paratyphi A, S. paratyphi C. Tác nhân gây sốt thương hàn và phó
thương hàn

•
Nhóm gây bệnh trên thú: Sal. cholerae suis, Sal.
Galinarum
Kiểu kháng nguyên > 2500 kiểu

Kháng nguyên O

Kháng nguyên H

Kháng nguyên Vi

⇒ Phức tạp trong chẩn đoán!!!
Dòch tễ học
PGS. TS. Nguyễn Ngọc
Hải
Khoa CNTY -
ĐHNLTP. HCM
Khaùng nguyeân vi khuaån Salmonella
PGS. TS. Nguyễn Ngọc
Hải
Khoa CNTY -
ĐHNLTP. HCM
Vi khuaån Nhoùm
KN
Khaùng
nguyeân O
Khaùng nguyeân H
(flagellar)
Phase 1 Phase 2
S. Paratyphi A 1, 2, 12 a (1, 5)

S. Typhimurium B 1, 4, 12 i 1, 2
S. Typhi D 9, 12, (Vi) c 1, 2
S. Enteriditis D 1, 9, 12 g, m (1, 7)
S. Gallinarum D 1, 9, 12 - -
PGS. TS. Nguyễn Ngọc
Hải
Khoa CNTY -
ĐHNLTP. HCM
•
Phương pháp phân lập
•
Phương pháp miễn dòch
–
Huyết thanh học
–
ELISA (Bộ kit Hyoptest (Bommeli))
–
Miễn dòch huỳnh quang
•
Phương pháp phân tử
–
PCR (Polymerase Chain Reaction)
–
Real Time PCR
–
Multiplex PCR
Phương pháp chẩn đoán Salmonella
PGS. TS. Nguyễn Ngọc
Hải
Khoa CNTY -

ĐHNLTP. HCM
Nguyên tắc: kháng thể kháng Salmonella trong huyết thanh của cơ
thể thú ⇔ Kháng nguyên Salmonella

Thực hiện test

0,25ml kháng nguyên + 0,25ml huyết thanh ở độ pha
loãng 1/10 trong dung dòch muối sinh lý.

Với kháng nguyên O (somatic) ủ 24g còn flagella ủ 4g
ở 50
0
C

Huyết thanh cho phản ứng dương tính sẽ pha loãng
1/20- 1/320 và kiểm tra lại với kháng nguyên phù hợp
Kiểm tra huyết thanh học
PGS. TS. Nguyn Ngc
Hi
Khoa CNTY -
HNLTP. HCM
Kieồm tra huyeỏt thanh hoùc
a
b
c
a: aõm tớnh
b: nghi ngụứ
c: dửụng tớnh
PGS. TS. Nguyễn Ngọc
Hải

Khoa CNTY -
ĐHNLTP. HCM
•
* Nguyên tắc: kháng thể kháng Salmonella trong
huyết thanh của cơ thể thú được nhuộm huỳnh
quang ⇔ Kháng nguyên Salmonella
•
* Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang

Chuẩn bò kháng nguyên và cố đònh vết
bôi lên phiến kính
⇒
kết hợp kháng thể

Nhuộm vết bôi: dùng conjugate có chất
phát huỳnh quang

Kính hiển vi có thể chụp lại hình ảnh
Phương pháp miễn dòch huỳnh quang
PGS. TS. Nguyễn Ngọc
Hải
Khoa CNTY -
ĐHNLTP. HCM

Salmonella > 2.500 kiểu huyết thanh

cụm gen chung: inv (invasion) và iag giúp cho quá trình
xâm nhiễm vào trong thành ruột của người và động vật ⇒
gây bệnh
Cấu trúc phân tử của Salmonella

PGS. TS. Nguyễn Ngọc
Hải
Khoa CNTY -
ĐHNLTP. HCM
PCR (Polymerase Chain Reaction)

DNA đích (gen inv)  band 520bp trên gel điện di

Cặp mồi invA1 và invA2:

invA1 : 5’ - TTGTTACGGCTATTTTGACCA – 3’

invA2 : 5’ - CTGACTGCTACCTTGGCTGATG – 3’
Giếng 1: Thang DNA 100 bp
Giếng 2, 3, 4, 5: Các chủng
Salmonella khác nhau
Giếng 6: Escherichia coli
Giếng 7: Vibrio cholerae
Giếng 8: Clostridium perfringens
PGS. TS. Nguyễn Ngọc
Hải
Khoa CNTY -
ĐHNLTP. HCM
Real-time PCR: iQ- Check
TM
Salmonella

Phát hiện Salmonella trong các mẫu thực phẩm và
môi trường


Probe phát huỳnh quang (fluorescent probes) = một trình
tự oligonocleotide phát sáng rất chuyên biệt = tín hiệu phân
tử (molecular beacon)

Probe dạng tự do ⇒ tín hiệu huỳnh quang từ F sẽ bò Q
hấp thu ⇒ không phát sáng

Probe đã được bắt cặp đặc hiệu với trình tự đích ⇒ F và
Q tách ra xa nhau ⇒ tín hiệu huỳnh quang từ F không bò Q
hấp thu ⇒ phát sáng
PGS. TS. Nguyễn Ngọc
Hải
Khoa CNTY -
ĐHNLTP. HCM
Vòng mang
trình tự bổ
sung với DNA
đích
F – chất phát
huỳnh quang
fluorophore
Q – chất hấp
thu (quencher)
Phân tử
Beacon
ADN mẫu
Lai
Fluorophore Quencher
Phân tử Beacon
PGS. TS. Nguyễn Ngọc

Hải
Khoa CNTY -
ĐHNLTP. HCM
Ưu điểm iQ – Check
TM
Salmonella
o
Không cần điện di sau PCR
o
Nhanh
o
Qui trình đơn giản
o
Độ nhạy cao (10
2
Salmonella cfu/ml)
o
Độ đặc hiệu cao
o
Không dương tính giả/ không phản ứng chéo
o
Tự động
PGS. TS. Nguyễn Ngọc
Hải
Khoa CNTY -
ĐHNLTP. HCM
Tăng sinh Salmonella
(25/225ml, ủ 18 ±2 giờ ở 37
O
C)

Ly trích DNA
iCycle iQ Optical System
(Chọn chu kỳ nhiệt và vò trí plate)
Real Time PCR
Đọc kết quả
PGS. TS. Nguyễn Ngọc
Hải
Khoa CNTY -
ĐHNLTP. HCM
Salmonella enterica typhimurium
–
Primer Rfbj: gen rfbj (kháng nguyên O.4.)
–
Primer Flic: gen flic-1 (kháng nguyên H1-I
–
Primer Flib: gen flib (kháng nguyên H2- 1,2)
Primer Gen
đích
Độdài Trình tự Kích cỡ
đoạn
khuếch đại
(bp)
Rfbj-s
Rfbj-as
Fli-s
Fli-as
Flic-s
Flic-as
Rfbj
fliC

fliB
24
24
24
24
24
24
5’-CCAGCACCAGTTCCAACTTGATAC
5’-GGCTTCCGGCTTTATTGGTAAGCA
5’-ATAGCCATCTTTACCAGTTCCCCC
5’-GCTGCAACTGTTACAGGATATGCC
5’-ACGAATGGTACGGCTTCTGTAACC
5’-TACCGTCGATAGTAACGACTTCGG
663
183
526
PGS. TS. Nguyễn Ngọc
Hải
Khoa CNTY -
ĐHNLTP. HCM
PGS. TS. Nguyễn Ngọc
Hải
Khoa CNTY -
ĐHNLTP. HCM
PGS. TS. Nguyễn Ngọc
Hải
Khoa CNTY -
ĐHNLTP. HCM
Mô tả bảng 96 giếng
trên màn hình

Mô tả kết quả
ở thời gian thực
PGS. TS. Nguyễn Ngọc
Hải
Khoa CNTY -
ĐHNLTP. HCM
+ + + + + + + + + + + +
A N N 7 7 … …
B P P 8 8
C 1 1 9 9
D 2 2 10 10
E 3 3 11 11
F 4 4 12 12
G 5 5 13 13
H 6 6 14 14
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
+ : Khaùng nguyeân N : Ñoái chöùng aâm P : Ñoái chöùng döông
ELISA
PGS. TS. Nguyễn Ngọc
Hải
Khoa CNTY -
ĐHNLTP. HCM
-Đối chứng dương : ODpos - ODneg
-Mẫu : ODmẫu - ODneg
Giá trò (%) =
OD
mẫu
- OD
neg
OD

pos
- OD
neg
x 100%
Giá trò <20% 20%-30% >30%
Giải thích m tính Không xác
đònh
Dương tính
PGS. TS. Nguyễn Ngọc
Hải
Khoa CNTY -
ĐHNLTP. HCM
Bộ phận cảm ứng sử dụng FRET tạo sóng huỳnh quang
giữa vật phát và vật nhận
Đầu dò miễn dòch
Flourescence Resonance Energy Transfer (FRET)
Sơ đồ của
immunosensor FRET
PGS. TS. Nguyễn Ngọc
Hải
Khoa CNTY -
ĐHNLTP. HCM
Đầu sợi thủy tinh (a) Benchtop Fluorometer (b)
Phức hợp protein-kháng thể cố đònh trên đỉnh sợi thuỷ tinh
và được gắn vào benchtop flourometer giám sát những thay
đổi huỳnh quang
PGS. TS. Nguyễn Ngọc
Hải
Khoa CNTY -
ĐHNLTP. HCM

•
* Bacteriophage có tính chuyên biệt cho vi khuẩn chủ ⇒
dạng lý tưởng để xác đònh vi khuẩn
•
* Enzyme luciferase của vi khuẩn được dùng để dò tìm và
đònh lượng vi khuẩn:

Chuyển gen lux vào genome phage. Phage thiếu cơ chế
enzyme nội bào cần thiết
⇒
không phát sáng

Sau khi xâm nhập vào tế bào chủ, gen của phage và gen
lux sẽ thể hiện
⇒
tế bào chủ phát sáng
Kỹ thuật bacteriophage và
phân tách miễn dòch từ
PGS. TS. Nguyễn Ngọc
Hải
Khoa CNTY -
ĐHNLTP. HCM
Phân tách miễn dòch từ
Hạt từ được phủ kháng thể đa dòng kháng
Salmonella
Có Salmonella
trong dòch mẫu
Bacteriophage
Bacteriophage + Salmonella Bacteriophage bò rửa trôi
Không có Salmonella

trong dòch mẫu
Bacteriophage nhân lên
SAC (Signal Amplifing Cells)
SAC bò bacteriophage phá
hủy ⇒ Giảm mật độ quang
SAC nhân lên ⇒
Tăng mật độ quang
PGS. TS. Nguyễn Ngọc
Hải
Khoa CNTY -
ĐHNLTP. HCM