Khả năng biểu hiện gene etx mã hóa độc tố epsilon của vi khuẩn clostridium perfringenstype d trên động vật thí nghiệm

i
LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành Đồ án này
Trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban
Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Phòng Đào tạo Đại học và
Sau đại học niềm kính trọng, sự tự hào được học tập tại trường trong những năm qua.
Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho thầy: TS. Lê Lập - Trưởng
Bộ môn Nghiên cứu Vi Trùng - Phân viện Thú y Miền Trung, TS. Vũ Ngọc Bội -
Phó Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha
Trang, Bác sĩ Lê Đình Hải và KS. Lưu Thị Nguyệt Minh - Bộ môn Nghiên cứu
Vi Trùng - Phân viện Thú y Miền Trung đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi
trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp này.
Xin cám ơn: ThS. Khúc Thị An - Quyền Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh
học và các thầy cô phản biện đã cho tôi những lời khuyên quí báu để công trình
nghiên cứu được hoàn thành có chất lượng.
Đặc biệt xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các thầy cô giáo trong
Bộ môn Công nghệ Sinh học - Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường
Đại học Nha Trang, Ban lãnh đạo Phân viện Thú y miền Trung, các cán bộ - Bộ
môn Nghiên cứu Vi Trùng và tập thể cán bộ công nhân viên – Phân viện Thú y
miền Trung đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt
thời gian tôi thực hiện đồ án này.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và các bạn bè đã tạo điều
kiện, động viên khích lệ để tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập
vừa qua.


Nha Trang, tháng 6, năm 2011
Sinh viên
Ngọ Thị Ngọc Tú
ii

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC ii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v
DANH MỤC HÌNH vi
DANH MỤC BẢNG vii
DANH MỤC BẢNG vii
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1. 1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 3
1.1.1. Nước ngoài 3
1.1.2. Trong nước 5
1.2. ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN C. perfringens 5
1.2.1. Phân loại 5
1.2.2. Đặc điểm hình thái và tính chất bắt màu. 6
1.2.3. Đặc tính nuôi cấy và sinh hóa 7
1.2.4. Đặc tính di truyền. 9
1.2.5. Sức đề kháng của C. perfringens 9
1.2.6. Các type độc tố (toxinotype) và khả năng gây bệnh 10
1.2.6.1. Type A 11
1.2.6.2. Type B 12
1.2.6.3. Type C 12
1.2.6.4. Type D 13
1.2.6.5. Type E 14
1.3. MỘT SỐ ĐỘC TỐ CHÍNH CỦA C. perfringens [18] 14
1.3.1. Alpha toxin (CPA) 14
1.3.2. Beta toxin (CPB) 15
1.3.3. Epsilon toxin (ETX) 15
iii

1.3.4. Iota toxin (CPI) 16
1.3.5. Enterotoxin (CPE) 16
1.3.6. Delta toxin 16
1.3.7. Theta toxin 17
1.4. HIỂU BIẾT VỀ ĐỘC TỐ EPSILON (ETX) CỦA C. perfringens 17
1.4.1. Tính chất vật lý và tính chất hóa học của ETX 17
1.4.2. Gen mã hóa ETX 17
1.4.3. Độc lực độc tố epsilon và phương pháp xác định 18
1.4.4. Cơ chế gây bệnh của độc tố epsilon (ETX) 19
1.5. MỘT SỐ LOẠI BỆNH DO VI KHUẨN C. perfringens GÂY RA
TRÊN DÊ, CỪU 20
1.5.1. Bệnh viêm ruột nhiễm độc huyết trên dê, cừu 20
1.5.2. Bệnh viêm ruột tiêu chảy ở dê, cừu do C. perfringens gây ra 21
1.6. ENZYME TRYPSIN 22
1.7. PHƯƠNG PHÁP PCR 23
1.7.1. Nguyên tắc của phương pháp PCR 23
1.7.2. Thực nghiệm 24
1.7.3. Các tác nhân ảnh hưởng đến phản ứng PCR 25
1.7.4. Phương pháp phân tích kết quả PCR 27
CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
29
2.2. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
29
2.3. VẬT LIỆU, DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
29
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29
2.4.1. Giám định một số đặc tính sinh học, hóa học của vi khuẩn C.
perfringens theo phương pháp của Quinn P.J. và cộng sự (1994) [34].
29

2.4.2. Xác định gen mã hóa độc tố epsilon bằng phản ứng PCR 31
iv
2.4.3. Kiểm tra khả năng biểu hiện gene mã hóa độc tố epsilon trên động
vật thí nghiệm 34
2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
35
CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36
3.1. KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HÓA CỦA VI
KHUẨN C. Perfringens 36
3.1.1. Kết quả kiểm tra hình thái của vi khuẩn C . perfringens
36
3.1.2. Kết quả kiểm tra khả năng di động bằng phương pháp soi tươi
36
3.1.3. Đặc tính nuôi cấy
37
3.1.4. Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa của vi khuẩn C. perfringens
38
3.2. KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH GEN MÃ HÓA ĐỘC TỐ ETX BẰNG
PHƯƠNG PHÁP PCR 41
3.3. KẾT QUẢ KIỂM TRA BIỂU HIỆN CỦA EPSILON TOXIN TRÊN
ĐỘNG VẬT THÍ NGIỆM 42
3.3.1. Kết quả kiểm tra biểu hiện của epsilon toxin trên chuột nhắt trắng 42
3.3.2. Kết quả kiểm tra biểu hiện của độc tố epsilon toxin trên dê 44
CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46
4.1. KẾT LUẬN 46
4.2. ĐỀ NGHỊ 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

C. perfringens Clostridium perfringens
E. coli Escherichia coli
ĐC + Đối chứng dương
ĐC – Đối chứng âm
BHI Brain Heart Broth
TBE Tris Boric EDTA
SPS Agar Perfringens Selective Agar
DNA Deoxyribonucleic Acid
dNTPs Deoxynucleotide Triphosphate
PCR Polymerase Chain Reaction
CPA Clostridium perfringens Alpha toxin
CPB Clostridium perfringens Beta toxin
ETX Clostridium perfringens Epsilon toxin
IA Clostridium perfringens Iota toxin
CPE Clostridium perfringens Enterotoxin
Cpa Gene mã hóa Clostridium perfringens Alpha toxin
Cpb Gene mã hóa Clostridium perfringens Beta toxin
Etx Gene mã hóa Clostridium perfringens Epsilon toxin
Ia Gene mã hóa Clostridium perfringens Iota toxin
Cpe Gene mã hóa Clostridium perfringens Enterotoxin
NĐRH Bệnh viêm ruột nhiễm độc huyết
MDCK Tế bào thận chó Madin Darby
vi
DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Hình thái vi khuẩn C. perfringens
6
Hình 1.2. Hiện tượng dung huyết beta
8

Hình 1.3. Cấu trúc của plasmid mang gene Etx
18
Hình 1.4. Thiết kế primer phân biệt etx gene C. perfringens type D và B
18
Hình 1.5. Phản ứng PCR
25
Hình 2.1. Tiêm độc tố vào tĩnh mạch chuột 34
Hình 2.2. Theo dõi chuột chết
34
Hình 2.3. Tiêm độc tố vào tĩnh mạch cổ trên dê
35
Hình 2.4. Mổ khám kiểm tra bệnh tích
35
Hình 3.1. Hình thái của vi khuẩn C. perfringens soi trên kính hiển vi
36
Hình 3.2. Hình thái vi khuẩn C. perfringens khi soi tươi
37
Hình 3.3. Vi khuẩn C. perfringens trên môi trường Fluid thioglycolate
37
Hình 3.4. Khuẩn lạc trên môi trường SPS.
38
Hình 3.5. khuẩn lạc trên môi trường thạch máu
38
Hình 3.6. Kết quả kiểm tra lên men đường
39
Hình 3.7. Kết quả nuôi cấy trên môi trường Litmus milk
39
Hình 3.8. Khuẩn lạc C. perfringens trên môi trường Egg yolk
40
Hình 3.9. Kết quả CAMP – test

40
Hình 3.10. Kết quả giám định gene mã hóa độc tố ETX bằng phản ứng PCR
42
Hình 3.11. Phổi, gan bị sưng, tụ huyết
45
vii
DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Vị trí gen mã hóa các loại độc tố của vi khuẩn C. perfringens 9
Bảng 1.2. Đặc tính phát triển của C. perfringens 10
Bảng 1.3. Các type độc tố của vi khuẩn C. perfringens 10
Bảng 1.4. Các bệnh gây ra bởi các type vi khuẩn C. perfringens 11
Bảng 1.5. Các enzyme thường sử dụng trong phản ứng PCR 26
Bảng 2.1. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 32
Bảng 2.2. Thành phần tham gia phản ứng PCR 33
Bảng 2.3. Trình tự mồi sử dụng trong phản ứng PCR 33
Bảng 3.1. Kết quả giám định một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn C.
perfringens 41
Bảng 3.2. Kết quả biểu hiện của epsilon toxin trên chuột nhắt trắng 43
Bảng 3.3. Kết quả kiểm tra biểu hiện của epsilon toxin trên dê 44




1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Clostridium perfringenes là một vi khuẩn yếm khí, gram dương, có khả
năng sinh bào tử thường được tìm thấy trong tự nhiên (trong đất, nước, và đường

tiêu hóa của nhiều loài động vật). Nó được coi là một trong những vi khuẩn chủ
yếu gây ra nhiều bệnh cho người và nhiều loài gia súc, gia cầm khác nhau.
Trong quá trình sinh trưởng, vi khuẩn C. perfringens sản sinh hơn 17 loại độc
tố khác nhau như: Độc tố Alpha (α), Beta (β), Epsilon (ε), Iota (i), Beta2,
Enterotoxin, Theta, vv…Dựa vào khả năng sản sinh 4 loại độc tố chính (alpha, beta,
epsilon, iota) người ta phân chia vi khuẩn C. perfringens thành 5 type độc tố
(toxinotype) khác nhau (A, B, C, D, E). Các type khác nhau thường gây ra các thể
bệnh khác nhau cho người và động vật. Trong số các loại độc tố do C. perfringenes
sản sinh, độc tố epsilon toxin (ETX) được tạo ra bởi vi khuẩn C. perfringens type B
và type D có độc lực mạnh nhất. Các kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy C.
perfringens type D đóng vai trò quan trọng trong bệnh viêm ruột hoại tử dê, cừu ở
Việt Nam [3,4]. Độc tính của độc tố epsilon, chỉ xếp sau độc tố botulinum và
tetanus, được trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh của Mỹ liệt vào nhóm
chất khủng bố sinh học.
Độc tố epsilon được mã hóa bởi gene Etx, gene này nằm trên plasmid của vi
khuẩn C. perfringens, tiết ra trong đường ruột dưới dạng tiền độc tố (prototoxin),
trọng lượng phân tử khoảng 34,25 kDa, sau đó được hoạt hóa bởi enzyme protease
như trypsin. Trypsin sẽ cắt đứt liên kết peptid giữa axit amin thứ 14 và 15 (Lys – 14
– Ala – 15) tính từ đầu N của chuỗi peptid, giải phóng một đoạn peptid gồm 14 axit
amin, hoạt hóa cho ETX hoạt động. Độc tố epsilon tác dụng lên nhóm lipid:
Cholesterol và sphingolipid có mặt trên màng tế bào động vật có xương sống, vì vậy
độc tố này tập trung ở não và thận của con bệnh. Độc tố epsilon được hấp thụ thông
qua dịch nhầy của ruột vào máu đi khắp cơ thể và đến các cơ quan bên trong. Tại
đây độc tố làm tăng áp lực thành mạch, gây phá hủy màng trong của mạch máu, làm
tăng tính thấm thành mạch và tích dịch trong các xoang của cơ thể, gây phù một số
cơ quan, đặc biệt là não, tim, phổi, gan và thận [18]. Khi tác động vào con vật, độc
tố sẽ gây tổn thương não, làm rối loạn các chức năng thần kinh bình thường, con vật
sẽ bị mù, la hét, mất phương hướng và không có khả năng ăn uống…Thận cũng sẽ

2

bị phân giải, xuất huyết, kèm theo một loạt các triệu chứng thông thường khác như:
tiêu chảy, phân có lẫn máu và niêm mạc, đặc biệt có mùi thối khắm, co giật toàn
thân, nghiến răng…và cuối cùng là dẫn đến chết nếu không được chữa trị kịp thời.
Để tìm hiểu về độc tính và tác động gây bệnh của độc tố epsilon do C.
perfringens type D tiết ra, chúng tôi thực hiện nghiên cứu đề tài: “Khả năng biểu
hiện gene etx mã hóa độc tố Epsilon của vi khuẩn Clostridium perfringens type
D trên động vật thí nghiệm ” .
Nội dung của đề tài:
1. Kiểm tra các đặc tính sinh vật hóa học của 10 chủng C.
perfringens type D phân lập từ dê mắc bệnh viêm ruột hoại tử.
2.
Giám
định gene Etx mã hóa độc tố epsilon bằng kỹ thuật PCR .
3. Nghiên cứu khả năng biểu hiện gene Etx mã hóa độc tố epsilon
trên động vật thí nghiệm.
Mục tiêu của đề tài:
Góp phần cung cấp những thông tin về độc tố epsilon của chủng C.
perfringens đang tồn tại và gây bệnh viêm ruột hoại tử ở dê trong những năm gần
đây. Giúp đề xuất biện pháp phòng trị bệnh có hiệu quả, để giảm thiểu tối đa
những thiệt hại do độc tố epsilon vi khuẩn C. perfringens gây ra.

3

CHƯƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1. 1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC
1.1.1. Nước ngoài
Vào năm 1892 tại phòng thí nghiệm trường đại học Johns Hopkins ở
Baltimore, lần đầu tiên vi khuẩn C. perfringens được phát hiện và đặt tên là
Bacillus aerogenes capsulatus bởi William Welch và George Nuttall, sau đó
được đổi thành Bacillus welchii, và đến nay được gọi là C. perfringens [18].

C. perfringens là trực khuẩn yếm khí, gram dương, có khả năng sinh bào
tử, thường tìm thấy trong tự nhiên (trong đất, nước, và ống tiêu hóa của nhiều
loài động vật). Nó được coi là một trong những vi khuẩn độc nhất được biết đến,
nó là tác nhân gây ra nhiều thể bệnh khác nhau không chỉ nguy hiểm cho nhiều
loài gia súc, gia cầm mà còn nguy hiểm đến con người. Hiện nay đã có rất nhiều
công trình nghiên cứu trong và ngoài nước nghiên cứu về vi khuẩn C.
perfringens ở nhiều lĩnh vực khác nhau.
Theo Field và cộng sự (1955) thuộc trường Đại học Cambridge, từ những
năm 50 vi khuẩn C. perfringens (lúc đó có tên gọi Clostridium wellchii) đã gây
bệnh viêm ruột nhiễm độc huyết – enterotoxaemia (NĐRH) đối với động vật
nuôi như bê sơ sinh (Griner & Bracken, 1953), cừu non (Griner & Jonhson,
1954) và có thể gây chết heo con (Field & Gibson, 1955). Bệnh viêm ruột nhiễm
độc huyết phát triển làm xuất hiện trong ruột những đốm nhỏ viêm xuất huyết [16].
Niilo L. và Chalmers G. A. (1982) đã phát hiện bệnh NĐRH ở ngựa con 4
ngày tuổi tại Alberta, Canada. Bệnh này làm ngựa con chết, mổ khám phát hiện

ruột có nhiều điểm nhỏ xuất huyết và viêm hoại tử. Cũng tại miền Nam Alberta
vào năm 1973, lần đầu tiên phát hiện C. perfringens type D trên bê [29, 30].
Niilo L. (1986) cho biết đã phân lập được C. perfringens type C, type D từ
tá tràng của cừu trưởng thành 8-9 tháng tuổi, cừu thường chết vì bị xuất huyết
ruột với những điểm hoại tử [31].
Năm 1998, Miserez và cộng sự tiến hành định type vi khuẩn C. perfringens
trên dê, cừu với 52 mẫu bệnh phẩm biểu hiện triệu chứng của bệnh viêm ruột
hoại tử và 13 mẫu dê, cừu khỏe mạnh. Kết quả cho thấy tất cả 52 mẫu bệnh phẩm


4

trên dê, cừu bị bệnh đều phát hiện được gene mã hóa độc tố alpha và epsilon, còn
trên dê, cừu khỏe mạnh thì 11/13 thuộc chủng type A và 2/13 thuộc chủng type
D. Từ kết quả này cho thấy vi khuẩn C. perfringens type D có ở dê, cừu khỏe
mạnh và bị bệnh, chúng là nguyên nhân chính gây bệnh hoại tử trên dê, cừu [26].
Manteca C. và cộng sự (2001) đã phân lập được C. perfringens type A từ
dạ múi khế bị xuất huyết của bê con 2 ngày tuổi và 1 tháng tuổi ở Bỉ, bê không
biểu hiện bệnh và chết đột ngột [24].
Năm 2003, Sipos và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật Mutiplex định type độc tố
vi khuẩn C. perfringens trên các loài gia súc khác nhau. Thu được kết quả trên
cừu: 8/10 chủng thuộc type A, và 2/10 chủng thuộc type D (hầu hết là ở cừu
non). Còn trên dê: 18/26 chủng thuộc type D, 6/26 mẫu thuộc type A, 2/26 mẫu
thuộc type E. Kết quả này cho biết hầu hết type D đều gây bệnh trên dê, và cừu
non [36].
Theo Malone F. (2004) ở Bắc Ireland, cừu ở các lứa tuổi, đặc biệt từ 1-3
tháng tuổi thường bị bệnh viêm ruột nhiễm độc máu, còn gọi là bệnh mềm thận
(pulpy kidney) do C. perfringens type D. Sau khi mổ khám phát hiện ruột bị
xung huyết và thận bị mềm [22].
Năm 2004, Wen và cộng sự đã nghiên cứu và sử dụng kỹ thuật Multiplex

PCR để phát hiện các gene mã hóa độc tố cho alpha - toxin, epsilon – toxin, iota
– toxin. Tác giả đã phân lập được 52 chủng C. perfringens từ 104 mẫu cừu mắc
bệnh viêm ruột hoại tử và 61 chủng từ 194 mẫu cừu khỏe mạnh. Kết quả thu
được trong 52 chủng phân lập từ cừu mắc bệnh có 33 chủng (64%) thuộc type A,
và 11 chủng (21%) thuộc type D, 8 chủng (15%) thuộc type C. Trong 61 mẫu
cừu khỏe mạnh có 58 chủng (95%) thuộc type A, 3 chủng thuộc type D (5%).
Kết quả cho biết độc tố epsilon đóng vai trò quan trọng trong việc gây bệnh viêm
ruột hoại tử ở cừu [40].
Miyashiro và cộng sự (2007) đã tiến hành mổ khám và nghiên cứu dê 18
tháng tuổi đã chết và có biểu hiện xuất huyết ở thận phù gan và ruột. Tác giả đã
phân lập được các chủng vi khuẩn C. perfringens type D từ thận, type A từ ruột.
Xét ở mức vi thể thấy xuất hiện một vùng rộng động mạch thận bị tổn thương
nghiêm trọng (bệnh mềm thận). Gan xuất hiện xuất huyết và tổn thương các tiểu


5

thùy gan. Tổn thương nhung mao thành ruột, phù phổi, xuất huyết tiểu não và đại
não [27].
1.1.2. Trong nước
Lê Văn Tạo và cộng sự (2002) đã phân lập được các chủng vi khuẩn yếm
khí C. perfringens từ trâu, bò chết đột ngột tại các tỉnh phía Bắc, vi khuẩn có độc
lực cao trên động vật thí nghiệm [11].
Nguyễn Văn Sửu và cộng sự (2003) cho thấy số lượng vi khuẩn trong một
gam phân bê, nghé bị tiêu chảy cao hơn hẳn so với phân của bê, nghé bình
thường. Tác giả khẳng định vi khuẩn C. perfringens có vai trò quan trọng trong
hội chứng tiêu chảy ở gia súc nói chung và của bê, nghé nói riêng [10].
Lê Lập và cộng sự (2007) nghiên cứu sự lưu hành các type độc tố của các vi
khuẩn C.perfringens phân lập từ bò, bê, dê và cừu mắc bệnh tiêu chảy nuôi tại
một số tỉnh duyên hải miền Trung bằng kỹ thuật Multiplex PCR. Kết quả cho

thấy những chủng vi khuẩn C. perfringens phân lập từ phủ tạng của dê, cừu tiêu
chảy đều thuộc type D mang gen Etx mã hóa độc tố epsilon và gen Cpa mã hóa
độc tố alpha [4].
Để xác định vai trò của vi khuẩn yếm khí C. perfringens gây hội chứng tiêu
chảy, Huỳnh Thị Mỹ Lệ và cộng sự (2009) đã tiến hành phân lập và giám định
các đặc tính sinh học của vi khuẩn trong phân bò, lợn mắc hội chứng tiêu chảy
nuôi tại Hà Nội và vùng lân cận. Kết quả cho thấy các chủng vi khuẩn phân lập
mang đầy đủ các đặc tính sinh học của loài, có độc tố gây chết chuột. Kết quả
định type bằng kỹ thuật Multiplex PCR cho thấy: Các chủng C. perfringens phân
lập từ bò thuộc type A (48,1%) và type D (51,9%), các chủng phân lập từ lợn
thuộc type A, mang độc tố ruột (37,8%) và độc tố beta2 (18,9%) [5].
1.2. ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN C. perfringens
1.2.1. Phân loại
Feser (1865) lần đầu tiên phát hiện C. perfringens, sau đó các tác giả khác
lần lượt nghiên cứu về vi khuẩn và bệnh do vi khuẩn này gây ra. Loài
C.perfringens lần đầu tiên được phân lập và mô tả bởi Welch và Nuttall (1892)
và được đặt tên là Bacillus aerogens capsulatus, về sau được đổi tên là Bacillus
perfringens do Veillon và Zuber (1898) và thành Bacillus welchii .



6

Hiện nay C. perfringens được phân loại như sau [44]:
Giới (regnum) : Bacteria
Ngành (phylum) : Firmicutes
Lớp (class) : Clostridia
Bộ (ordor) : Clostridiales
Họ (familia) : Clostridiaceae
Chi (genus) : Clostridium

Loài (species) : C. Perfringens
1.2.2. Đặc điểm hình thái và tính chất bắt màu.
Vi khuẩn C. perfringens là trực khuẩn ngắn, yếm khí, bắt màu gram
dương. Vi khuẩn có thể đứng riêng rẽ, kết thành chuỗi hoặc đứng song song.
Kích thước vi khuẩn (0,6 – 2,4 × 1,3 – 19 µm ).

Hình 1.1. Hình thái vi khuẩn C.perfringens

Vi khuẩn không có khả năng di động, chỉ hình thành giáp mô trong cơ thể
động vật. Vi khuẩn có khả năng hình thành nha bào, nha bào hình ovan hơi lệch
tâm. Khuẩn lạc của C. perfringens tròn, nhẵn và bóng, được bao bởi một vòng
bên trong dung huyết hoàn toàn (do độc tố theta) và một vòng bên ngoài dung
huyết không hoàn toàn (do độc tố alpha). Người ta thường gọi hiện tượng này là
dung huyết beta trên môi trường nuôi cấy có bổ sung máu động vật [9, 18].


7

1.2.3. Đặc tính nuôi cấy và sinh hóa
C. perfringens là vi khuẩn dinh dưỡng hữu cơ, yếm khí không tuyệt đối
nên có thể sống sót trong môi trường có oxygen. Vi khuẩn có thể phát triển trong
khoảng nhiệt độ từ 12
0
C - 50
0
C, phát triển nhanh ở 43 - 47°C ở nhiệt độ tối thích
45
0
C, sau 8 giờ vi khuẩn mọc, thời gian mỗi thế hệ vào khoảng 8- 10 phút và
trong quá trình phát triển có sinh khí. C. perfringens có thể sống sót trong những

điều kiện khắc nghiệt nhờ sự biến đổi thích nghi của hệ thống biến dưỡng tế bào
với khả năng chịu đựng cao và sản sinh nha bào. Nha bào thể sống sót trong
những môi trường khắc nghiệt như nóng, khô, acid, chất tẩy rửa [1, 18].
Vi khuẩn có khả năng hình thành nha bào, nha bào hình ovan và hơi lệch
tâm nhưng không tìm thấy nha bào trong những môi trường thông thường. Việc
hình thành nha bào đòi hỏi sự có mặt của đường và protein và trong những điều
kiện đặc biệt [9].
C. perfringens là vi khuẩn yếm khí nhưng điều kiện nuôi cấy yếm khí
không đòi hỏi khắt khe như các vi khuẩn yếm khí khác [18, 34]:
- Điều kiện nuôi cấy: Phát triển tốt ở môi trường yếm khí thông thường 2-
10% CO2.
- Môi trường: Vi khuẩn phát triển tốt trên môi trường có bổ sung đường
hoặc máu động vật, có khả năng phát triển trên môi trường lỏng như
thioglycolate.
- Trên môi trường Fluid thioglycolate: Sau 24 – 28 giờ nuôi cấy ở 37°C, vi
khuẩn phát triển tốt làm đục môi trường.
- Trên môi trường thạch máu (5-10% máu cừu hoặc máu thỏ): Sau 24 – 28
giờ nuôi cấy ở 37°C, khuẩn lạc của C. perfringens tròn, nhẵn và bóng, được bao
bởi một vòng bên trong dung huyết hoàn toàn (do độc tố theta) và một vòng bên
ngoài dung huyết không hoàn toàn (do độc tố alpha). Hiện tượng này là dung
huyết beta (hình 1.2) trên môi trường nuôi cấy thạch máu.


8


Hình 1.2. Hiện tượng dung huyết beta
- Trên môi trường SPS (Perfringens Slection Agar) hoặc TSC agar
(Tryptose -Sulfit-Cycloserin Agar): Vi khuẩn phát triển cho khuẩn lạc tròn màu đen.
- Trên môi trường nước thịt gan yếm khí: Vi khuẩn phát triển rất nhanh

làm đục môi trường và môi trường chuyển sang màu vàng rơm.
- Vi khuẩn có khả năng lên men các loại đường: Glucose, Lactose,
Maltose, Saccharose. Không lên men Mannitol, không sinh Indol.
- Trên môi trường Egg yolk (lòng đỏ trứng gà): Vi khuẩn C. perfringens
phát triển sản sinh men Lecithinase, phân giải Lecithine tạo thành vòng trắng sữa
xung quanh khuẩn lạc.
- Trên môi trường Litmus milk: Vi khuẩn lên men đường Lactose, làm
đông vón Casein. Môi trường chuyển từ tím sang nâu rồi sang trắng với chỉ thị
pH Litmus, khi cục axit vỡ sẽ tạo thành khí gas.
- Phản ứng CAMP test: Khi nuôi cấy vi khuẩn C. perfringens và
Streptococus agalactiae trên môi trường thạch máu thành một đường vuông góc
thì các khuẩn lạc của Streptococus agalactiae sản sinh ra yếu tố có khả năng
khuếch tán sẽ làm rõ hơn vùng dung huyết không hoàn toàn tạo ra bởi độc tố
alpha của C. perfringens.
- Phản ứng O- F test: Khi nuôi cấy vi khuẩn C. perfringens trên môi
trường O- F, vi khuẩn phát triển, lên men đường trong môi trường tạo ra các sản
phẩm trung gian có tính axit. Làm môi trường chuyển từ tím sang vàng với chỉ
thị Bromocresol purple.


9

1.2.4. Đặc tính di truyền.
C. perfringens là loài điển hình để nghiên cứu genome vì chúng có khả
năng phát triển nhanh chóng và việc thao tác trên bộ gene của C. perfringens
cũng dễ dàng hơn các chủng khác.
Năm 2002, cấu trúc bộ gene của C. perfringens đã được công bố. Bộ nhiễm
sắc thể bao gồm 3.031.430 cặp bp; có 2.660 vùng mã hóa cho các protein; 10 loại
RNA vận chuyển và hàm lượng C+G vào khoảng 28,6%.
Khi so sánh hệ gene của C. perfringens với hệ gene của những loài vi

khuẩn không có khả năng gây bệnh như C. acetabutylicum thì ta thấy rằng sự
khác biệt chính giữa hai bộ gene của hai loài này chủ yếu là do những gene có
khả năng sinh độc tố của C. perfringens.
Việc xác định trình tự bộ gene của vi khuẩn C. perfringens cho thấy các
gene gây độc không có tác động cộng gộp với nhau mà có sự tác động riêng rẽ.
Các nghiên cứu cũng cho thấy rằng độc tố alpha là loại độc tố được tất cả các
type vi khuẩn C. perfringens sản sinh ra. Gene mã hóa các loại độc tố ở vi khuẩn
này không chỉ nằm trên nhiễm sắc thể mà còn có trên plasmid [18].
[
Bảng 1.1. Vị trí gen mã hóa các loại độc tố của vi khuẩn C. perfringens
Độc tố Gen Vị trí của gen
Alpha Cpa Nhiễm sắc thể
Beta Cpb Plasmid
Epsilon Etx Plasmid
Iota Ia a/ Ia b Plasmid
Beta 2 Cpb 2 Plasmid
Enterotoxin Cpe Nhiễm sắc thể/ Plasmid

1.2.5. Sức đề kháng của C. perfringens
C. perfringens có khả năng sinh nha bào, tùy theo từng chủng, nha bào có
thể chịu được nhiệt hoặc không (1-30 phút ở 100°C). Phần lớn các chủng nhạy
cảm với nhiệt độ, tuy nhiên một số chủng gây bệnh lại chịu được ở nhiệt độ cao.
Đặc biệt một vài loài còn có khả năng sống sót rất lâu trong môi trường đông
lạnh. Các kết quả nghiên cứu ở thịt gà đông lạnh chỉ có khoảng 4% tế bào sống
sót khi thịt trữ ở - 17,7°C

sau 180 ngày, trong khi tỉ lệ này ở bào tử khô là 40%,


10

sau 90 ngày và 11% sau 180 ngày. Về pH, nhiều chủng thích hợp trong khoảng
pH (5,5 – 8,5) nhưng thường không dưới 5,5 và không trên 8,5. Nồng độ NaCl,
gần như bị ức chế ở nồng độ NaCl 5%, một số chủng ức chế ở NaCl 2,5% [1].
Bảng 1.2. Đặc tính phát triển của C. perfringens

Giới hạn
dưới
Tối thích Giới hạn trên

Tác giả
Nhiệt độ (C)

10 -12

43 - 47

50 - 55
Labbé,2000;Li và
McClane,2006
pH
5,0-5,5 6,0-7,2 8,0-9,0 Labbé,2000
NaCl(%)
- 5,0-5,8 -
Labbé,2000;Li và
McClane,2006
NaNO3(ppm)
- 60-2560 - Labbé,2000
aw
0,93 0,95-0,96 0,97 Labbé,2000

1.2.6. Các type độc tố (toxinotype) và khả năng gây bệnh.
C. perfringens sản sinh ra hơn 17 loại độc tố khác nhau. Dựa vào 4 loại độc
tố chính (alpha, beta, epsilon, iota) do vi khuẩn sản sinh người ta chia ra thành 5
type khác nhau (A, B, C, D và E) [18].
Bảng 1.3.Các type độc tố của vi khuẩn C. perfringens
Độc tố

Type
Alpha Beta Epsilon Iota
A + - - -
B + + + -
C + + - -
D + - + -
E + - - +

Ngoài 4 loại độc tố chính trên, vi khuẩn C. perfringens còn sản sinh một
số loại độc tố khác như: Gama, delta, eta, theta, kappa, mu, lambda, nu,
enterotoxin…

Các type khác nhau thường gây ra các thể bệnh khác nhau cho
động vật khác nhau.


11

Bảng 1.4.Các bệnh gây ra bởi các type vi khuẩn C. perfringens.
Type
Độc
tố

Bệnh Đối tượng gây bệnh
A α
- Hoại thư sinh hơi (hoại tử)
- Viêm ruột hoại tử
- Viêm ruột nhiễm độc máu
- Ngộ độc thực phẩm
- Viêm ruột kết
- Viêm dạ dày xuất huyết
- Người, động vật, gà
- Heo
- Bò và cừu con
- Người
- Ngựa
- Chó
B α,β, ε

- Bệnh lỵ
- Viêm ruột nhiễm độc máu
- Cừu con
- Ngựa con, cừu và dê
C α,β
- Viêm ruột hoại tử
- Viêm ruột nhiễm độc máu
- Người
- Cừu, bê con, cừu con, heo con
D α, ε
- Viêm ruột nhiễm độc máu
- Viêm ruột hoại tử
- Cừu con, cừu (mềm thận), dê và
trâu bò

E α, ι
- Viêm ruột
- Viêm ruột nhiễm độc máu
- Thỏ
- Bê con và cừu con

1.2.6.1. Type A
Các chủng C. perfringens thuộc type này được tìm thấy nhiều nhất ở ruột,
môi trường sống của những động vật máu nóng và trong đất. Độc tố type A gây
nên sự viêm nhiễm ở các vết thương, gây hoại thư sinh hơi và còn là yếu tố chính
gây nên các bệnh về đường ruột ở động vật. Bệnh hoại thư sinh hơi và xuất huyết
ở dạ múi khế của bê con nuôi thịt, triệu chứng thường gặp như: Sưng phù và tiêu
chảy, đôi khi chết đột ngột mà không có triệu chứng báo trước. Khi mổ khám
phát hiện dạ múi khế bị giãn nở, xuất huyết và loét, bị khí thủng trên thành và
nếp gấp. Dê thịt trên 4 tháng tuổi ít bị nhiễm bệnh này. Các chủng type A cũng
thường được phân lập từ vùng tai giữa, dạ múi khế ở bê mắc bệnh.
C. perfringens type A cũng gây ra bệnh viêm ruột hoại tử ở gà. Triệu chứng
đầu tiên khi gà bị mắc bệnh là giảm cân, sau đó là suy nhược, biếng ăn, tiêu chảy.
Những triệu chứng trên thường diễn ra trong một thời gian rất ngắn, khó quan sát
được hiện tượng và khi phát hiện thì gà đã chết. Vi khuẩn type A thường tồn tại


12

trong đường tiêu hóa của gà, đất, bụi và những phần thức ăn bị ôi thiu. Chế độ ăn
uống không hợp lý cũng có thể làm gia tăng số lượng vi khuẩn C. perfringens
trong ruột gà lên dẫn tới bệnh hoại tử đường ruột ở gà. Số lượng gà chết do vi
khuẩn C. perfringens sẽ là rất ít nếu chúng được tiêm chủng với 2 loại vi khuẩn
Lactobacillus acidophilus hoặc Enterococcus faecalis. Việc phát triển một trong
hai loại vi khuẩn này trong đường ruột gà sẽ ngăn chặn khả năng sản sinh độc tố

alpha của vi khuẩn C. perfringens.
Bệnh đường ruột do type A gây nên cũng được phát hiện ở lợn sữa, với
những triệu chứng thường thấy như rụng lông hay hoại tử đường ruột dạng nhẹ.
Hiện tượng trên thường phát triển ở những vùng ruột nhỏ của lợn như ruột chay
và ruột hồi. Khi nuôi cấy vi khuẩn từ những vùng tổn thương này thì số lượng vi
khuẩn C. perfringens thấy được là rất lớn [18, 25].
1.2.6.2. Type B
C. perfringens type B là tác nhân chính gây nên bệnh lị ở cừu non và cả cừu
trưởng thành. Cừu non có thể mắc bệnh lị ngay từ những ngày đầu tiên khi mới
sinh ra. Nguyên nhân là do sự lây nhiễm vi khuẩn này từ cừu mẹ và môi trường
sang cừu con. Lúc này, vi khuẩn trong đường ruột sẽ tăng lên một cách nhanh
chóng, đặc biệt là khi cừu con bú sữa mẹ. Kết quả là ruột cừu sẽ bị loét và xuất
huyết, rồi chết một cách nhanh chóng. Triệu chứng cấp tính có thể nhận thấy là
cừu không ăn uống, đau bụng, cộng với hiện tượng tiêu chảy ra máu, nằm
nghiêng, hôn mê và chết chỉ trong vòng 24 giờ. Tỷ lệ mắc bệnh này ở cừu
khoảng 30%, trong một vài trường hợp tỷ lệ này có thể lên đến 100%. Bệnh mãn
tính ở những cừu trưởng thành cũng kèm theo chứng đau bụng mãn tính nhưng
sẽ không bị tiêu chảy. Ngoài ra, type B cũng là nguyên nhân gây nên chứng xuất
huyết đường ruột ở dê, bê, lừa và ngựa.
Vẫn còn rất ít nghiên cứu về khả năng gây độc của vi khuẩn type B này đối
với động vật. Khả năng gây độc của chúng là đơn lẻ hay cộng gộp với các loại
độc tố khác thì vẫn còn là vấn đề đang được tranh cãi [18, 25].
1.2.6.3. Type C
Vi khuẩn C. perfringens type C gây nhiễm độc tố ở heo, cừu, ngựa, gà, chó
và cả người. Gia súc, gia cầm mới sinh là những đối tượng dễ bị lây nhiễm nhất.
Vi khuẩn gây tổn thương tế bào biểu mô ruột và tế bào màng trong ruột của vật


13

chủ. Sự thay đổi thành phần thức ăn đột ngột của những động vật còn nhỏ là một
yếu tố thuận lợi cho sự xâm nhiễm của vi khuẩn C. perfringens type C vào cơ thể
vật chủ. Tỷ lệ lây nhiễm thường khác nhau ở những bầy đàn, chuồng trại khác
nhau, thông thường khoảng 30 – 50%, nếu không được chữa trị hay ngăn chặn
kịp thời trong vòng 24 tiếng thì tỷ lệ đó có thể lên đến từ 50 – 100% [18].
Lợn con là loài dễ bị lây nhiễm hơn cả, bệnh xuất hiện khi lợn con mới chỉ
từ 1 đến 2 ngày tuổi. Triệu chứng đi kèm là suy nhược cơ thể, tiêu chảy, bệnh lỵ,
xuất hiện máu và những tế bào ruột bị hoại tử ở trong phân. Đối với lợn được 1
đến 2 tuần tuổi, khi mắc bệnh thời gian điều trị sẽ phải kéo dài, vì lúc này các
triệu chứng bệnh đã nặng và phức tạp hơn nhiều, như mất nước, tiêu chảy cấp,
niêm mạc ruột có màu đỏ sậm sau đó là bị hoại tử.
Hoại tử không chỉ xuất hiện ở niêm mạc ruột mà nó còn lan rộng đến cả
màng cơ nhẵn trong một số lớp màng nhầy khác. Triệu chứng bệnh cũng được
thấy tương tự ở dê, bò và cừu như đau bụng, tiêu chảy, kêu rống, điên cuồng, mất
phương hướng…
1.2.6.4. Type D
Độc tố type này được biết đến là một trong những nguyên nhân chính gây
nên các bệnh đường ruột, hay đột tử ở cừu và một số động vật khác. Ngoài độc tố
alpha, vi khuẩn type D còn có khả năng sản sinh một loại độc tố khác, độc tố
epsilon, một loại độc tố rất độc. Đích của độc tố này là nhóm lipid, vì vậy độc tố
này thường tập trung ở não và thận. Khi tác động vào con vật độc tố sẽ gây tổn
thương não, làm rối loạn các chức năng thần kinh bình thường, con vật sẽ bị mù,
la hét, mất phương hướng và không còn khả năng ăn uống Thận cũng sẽ bị phân
giải, xuất huyết, kèm theo một loạt các triệu chứng thông thường khác và cuối
cùng là dẫn đến chết nếu không được điều trị kịp thời.
Cừu khoảng từ 3 đến 10 tuần tuổi hay những con cừu cái đang cho con bú sẽ
rất dễ bị mắc bệnh do độc tố type D gây ra. Cừu non sau khi cai sữa sẽ không sử
dụng sữa mẹ như là thức ăn chính nữa mà thay vào đó là những loại cây cỏ hay thức
ăn có hàm lượng tinh bột cao. Chính sự thay đổi thành phần, hàm lượng các chất có
trong thức ăn làm rối loạn hoạt động của đường ruột trong một thời gian ngắn. Vì

vậy, đây là lúc mà con vật dễ bị tiêm nhiễm độc tố type D nhất [25].


14

Độc tố này cũng gây nên các bệnh tương tự ở dê, bê, bò, ngựa. Tuy nhiên,
riêng đối với dê, còn xuất hiện một số triệu chứng khác như viêm chảy, tơ huyết,
xuất huyết đường ruột, nhưng lại không bị mềm thận như ở cừu…[25]
1.2.6.5. Type E
Trước đây, khả năng gây bệnh của type vi khuẩn này còn chưa được nhiều
tác giả nói đến, vì những nghiên cứu về nó vẫn chưa nhiều. Tuy nhiên, trong
những năm gần đây, việc xác định được gene mã hóa độc tố Iota của vi khuẩn C.
perfringens type E đã tạo nên những bước ngoặt mới. Khả năng gây độc của độc
tố Iota ở C. perfringens cũng tương tự như độc tố ở vi khuẩn C. spiroforme, một
loại vi khuẩn đã được nghiên cứu rất nhiều [25]. Ngoài khả năng gây nhiễm độc
tố đường ruột ở bò bê, chuột lang và thỏ, thì độc tố này còn có thể gây nên bệnh
lỵ ở cừu.
1.3. MỘT SỐ ĐỘC TỐ CHÍNH CỦA C. perfringens [18]
1.3.1. Alpha toxin (CPA)
Tất cả các type của vi khuẩn C. perfringens đều có khả năng sản sinh độc tố
này. Gene mã hóa cho độc tố alpha là cpa, độc tố Cpa nằm trên nhiễm sắc thể của
vi khuẩn. Trọng lượng phân tử của gen khoảng 43 kDa, gồm 1197 nucleotid mã
hóa cho 399 axit amin. Hàm lượng G + C thấp, chỉ khoảng 34% tổng Nu trong
bộ gen cpa, điểm đẳng điện pI 5,4.
CPA là một phospholipase C, có khả năng thủy phân phosphotidylcholine
và sphingomyeline. Phản ứng chỉ xảy ra khi có mặt enzyme phosphotidase,
enzym này chỉ hoạt động được khi có ion Ca
2+
trong tế bào [18]. Phản ứng đặc
trưng để nhận biết sự có mặt của độc tố CPA là phản ứng phân giải lecithin trên

môi trường Egg yolk, tạo thành vòng trắng sữa xung quanh khuẩn lạc. Khả năng
tạo vòng dung huyết trên môi trường thạch máu. Để chứng minh cho khả năng
tạo ra 2 phản ứng trên của CPA, Titball và cộng sự (1989) đã tiến hành chèn
đoạn gene mã hóa độc tố CPA vào plasmid của vi khuẩn E. coli và nhận thấy
rằng vi khuẩn E. coli mang plasmid tái tổ hợp này có khả năng tạo ra phản ứng
phân giải lecithin trên môi trường Egg yolk và tạo vòng dung huyết trên môi
trường thạch máu.


15

Khi xâm nhập vào cơ thể, CPA sẽ làm tăng tính thấm thành mạch, tăng tính
bám của tiểu cầu, gây xung huyết và hoại tử cơ. Độc tố này gây bệnh hoại thư
sinh hơi, hoại tử ruột và gây nhiễm độc máu ở một số động vật như bò, dê, ngựa…
1.3.2. Beta toxin (CPB)
Là độc tố được sản sinh bởi vi khuẩn C. perfringens type B và type C. là
một protein mẫn cảm cao với trypsin, gây hoại tử tế bào biểu mô ruột và tế bào
màng trong ruột. Gene mã hóa cho độc tố beta là cpb, gene này nằm trên plasmid
của vi khuẩn. Cpb có trọng lượng phân tử khoảng 40 kDa, tương đương với 1113
nucleotid mã hóa cho 371 axit amin, điểm đẳng điện pI = 5,6. Cả 2 đặc tính trên
đều gần giống cpa, vì vậy rất khó để phân tách được 2 độc tố CPA và CPB nếu
chỉ dựa vào 2 đặc điểm trên. Hàm lượng G + C trên cpb tương đối thấp, chỉ
chiếm khoảng 28,5% Nu tổng số .
Theo Lawrence và Cook năm 1980, CPB ở vi khuẩn C. perfringens type C
bị ức chế bởi sự hoạt động của enzyme protease. Khi con vật còn nhỏ chúng rất
mẫn cảm với bệnh gây ra bởi CPB so với con trưởng thành, bởi vì trong đường
ruột của con vật còn non có ít enzym có khả năng bất hoạt độc tố này. Mặc khác,
trong sữa đầu của mẹ có yếu tố làm ức chế hoạt động của enzym protease, điều
này càng làm tăng tính dễ bị tổn thương của con non đối với độc tố beta. CPB
còn có khả năng giải phóng catecholamines vào máu, làm huyết áp tăng nhanh,

nhịp tim giảm mạnh ở động vật mắc bệnh. CPB là nguyên nhân gây nên bệnh
viêm ruột hoại tử ở heo, dê, cừu và cả ở người, chúng gây tổn thương tế bào biểu
mô ruột và tế bào màng trong ruột của vật chủ. Ngoài ra, CPB còn tác động đến
mô thần kinh làm ảnh hưởng đến quá trình trao đổi Canxi màng gây rối loạn các
chức năng thần kinh bình thường [18].
1.3.3. Epsilon toxin (ETX)
Độc tố epsilon được tạo ra bởi vi khuẩn C. perfringens type B và type D.
ETX được mã hóa bởi gene etx, gene này nằm trên plasmid của vi khuẩn, trọng
lượng phân tử khoảng 34,25 kDal. ETX được tiết ra dưới dạng tiền độc tố và
được hoạt hóa bởi enzyme protease như trypsin [25]. Trypsin sẽ cắt đứt liên kết
peptid giữa axit amin thứ 14 và 15 (Lys – 14 – Ala – 15) tính từ đầu N của chuỗi
peptid, giải phóng một đoạn peptid gồm 14 axit amin, hoạt hóa cho ETX hoạt
động [18].


16

ETX được hấp thụ thông qua dịch nhầy của ruột vào máu đi khắp cơ thể và
đến các cơ quan bên trong. Tại đây độc tố làm tăng áp lực trong thành mạch, gây
phá hủy màng trong của mạch máu, làm tăng tính thấm thành mạch và tích dịch
trong các xoang của cơ thể, gây phù một số cơ quan, đặc biệt là não, tim, phổi,
gan và thận. ETX tác dụng lên nhóm lipid: Cholesterol và sphingolipid có mặt
trên màng tế bào động vật có xương sống, vì vậy độc tố này tập trung ở não và thận.
1.3.4. Iota toxin (CPI)
Độc tố Iota được tiết ra bởi vi khuẩn C. perfringens type E. Gen mã hóa độc
tố này nằm trên plasmid. CPI là độc tố gồm 2 phần là 2 polypeptid độc lập với
nhau. Vị trí hoạt hóa enzyme gọi là Iota a (gene mã hóa Ia) và vị trí gắn độc tố
với tế bào biểu mô đích Iota b (gene mã hóa Ib). Chuỗi nặng Ib có trọng lượng
phân tử khoảng 71,5 kDal; pI = 4,2 sẽ gắn độc tố với tế bào biểu mô đích và giúp
cho chuỗi nhẹ Ia có trọng lượng phân tử 47,5 kDa, pI = 5,2 thấm qua màng tế

bào, xâm nhập vào tế bào chất và gây chết tế bào. CPI gây nên các triệu chứng về
bệnh nhiễm độc tố, bệnh đường ruột ở cả bò, bê, chuột lang và thỏ. Ngoài ra, khi
vào cơ thể CPI sẽ là tăng tính thấm thành mạch của tế bào vật chủ.
1.3.5. Enterotoxin (CPE)
Là một độc tố đường ruột được sản xuất bởi chủng vi khuẩn type A.
Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng CPE còn là nguyên nhân gây nên bệnh tiêu chảy,
viêm ruột và hoại thư sinh hơi ở động vật. Độc tố gây tiêu chảy làm mất nước và
chất điện giải trong cơ thể. Enterotoxin được sản sinh trong quá trình hình thành
bào tử của vi khuẩn, và độc tố sẽ tăng khi tế bào sinh dưỡng bị phá hủy. Gene mã
hóa cho CPE là cpe nằm trên cả nhiễm sắc thể và plasmid của vi khuẩn C.
perfringens. CPE là một đoạn polypeptide mạch đơn nặng 35 kDal, điểm đẳng
điện pI = 4,3 tồn tại ở pH = 5-12 [20]. Khi bị nhiễm độc enterotoxin các triệu
chứng xuất hiện bao gồm: Tiêu chảy, nôn mửa, sốt kéo dài trong vòng 1 ngày,
thời gian ủ bệnh từ 6 – 24giờ 24 giờ, thường từ 10 – 12 giờ.
1.3.6. Delta toxin
Được sản sinh bởi vi khuẩn C. perfringens type B và type C. Gene mã hóa
độc tố này có trọng lượng phân tử khoảng 42 kDal và pI = 7,1. Độc tố Delta là
chất gây nên hiện tượng tiêu máu ở cừu, dê, và heo. Tuy nhiên, độc tố này lại bị
ức chế bởi các hạch bào có ở người, ngựa, chuột và các loại động vật có vú khác.


17

1.3.7. Theta toxin
Được tạo ra bởi tất cả các type của vi khuẩn C. perfringens. Là yếu tố tạo
nên một trong hai vòng dung huyết của khuẩn lạc vi khuẩn. C.perfringens, khi
nuôi cấy chúng trên môi trường thạch máu. Độc tố này có khả năng tiêu hủy tế
bào và rất dễ bị biến đổi hoạt tính khi có oxi. Gene mã hóa của Theta nằm trên
nhiễm sắc thể của vi khuẩn [20]. Thời gian gần đây nhiều tác giả còn đề cập đến
beta 2 toxin (Beta2). Gen mã hóa độc tố Beta2 nằm trên plasmid. Độc tố thường

gây triệu chứng tiêu chảy có liên quan đến kháng sinh và tiêu chảy tự nhiên.
1.4. HIỂU BIẾT VỀ ĐỘC TỐ EPSILON (ETX) CỦA C. perfringens
ETX là độc tố được sinh ra bởi cả hai chủng C. perfringens type D và type
B. Nó thường gây ra các bệnh cho các loài động vật như dê, cừu và bê, nhanh
chóng gây tử vong và làm thiệt hại cho nền kinh tế nông nghiệp.
1.4.1. Tính chất vật lý và tính chất hóa học của ETX
Độc tố epsilon được tổng hợp từ DNA plasmid có chiều dài 311 acid
amin, ở dạng tiền độc tố bất hoạt “protoxin” trọng lượng phân tử khoảng 34,25
kDal đến 35,2 kDal, điểm đẳng điện pI = 8,2. Sau đó được hoạt hóa bằng enzyme
ngoại bào thủy phân protein như trypsin, chymotripsin hoặc độc tố Kappa,
Lampda do chính vi khuẩn C. perfringens sinh ra. Độc tố sau khi hoạt hóa có
trọng lượng phân tử là 31,2 kDal; điểm đẳng điện là pI = 5,36 [20].
Thực chất của sự hoạt hóa là làm cho protein độc tố hoạt động nhanh hơn sau khi
gắn kết vào tế bào vật chủ. Hơn nữa, sự hoạt hóa giảm điểm đẳng điện của độc tố
(từ 8,2 ở tiền độc tố xuống 5,36 ở độc tố hoạt hóa hoàn toàn, hoặc 5,74 ở độc tố
hoạt hóa từng phần) [32]. Sự hoạt hóa làm thay đổi về cấu trúc của tiền độc tố
[20], có hoàn thiện tương tác của độc tố với thụ thể
.
1.4.2. Gen mã hóa ETX
Phản ứng PCR đã được sử dụng để xác định sự có mặt của gen mã hóa
độc tố epsilon của các chủng C. perfringens type B và D nuôi cấy trong các phòng
thí nghiệm. Gen etx mã hóa độc tố epsilon nằm trên plasmid lớn có khả năng chuyển
ngang giữa các vi khuẩn (conjugative plasmid). Toàn bộ plasmid có độ dài trên 64
Kb (hình 1.3), và đoạn mã hóa cho độc tố epsilon trên 1Kb trong đó có 933
nucleotid mã hóa cho 311 axit amin của tiền protein toxin epsilon.


18

Hình 1.3. Cấu trúc của plasmid mang gene Etx
Promoter của gen etx nằm ngay trước vị trí khởi đầu phiên mã. So sánh
trình tự nucleotid các yếu tố chính để khởi động quá trình phiên mã bao gồm hộp
TTGTAT khoảng 35 bp trước điểm phiên mã, hộp TATA 10 bp trước điểm phiên
mã. Chúng lần lượt được gọi là vùng -35 và vùng -10 (hộp Pribnow) [6]. So sánh
trình tự nucleotid của các promoter của hai gen EtxB (từ C. perfringens type B)
và EtxD (từ C. perfringens type D) cho thấy không có sự tương đồng, chúng khác
nhau về trình tự ở vùng -35 và vùng -10 (Hình 1.4). Từ sự khác nhau này chúng
ta có thể thiết kế các cặp mồi đặc hiệu để phát hiện gen mã hóa độc tố epsilon từ
C. perfringens type B hay từ type D [32].

Hình 1.4. Thiết kế primer phân biệt Etx gene C. perfringens type D và B
Khung đọc mở (open reading frame, ORF) là một trình tự mã hóa chuỗi
polypeptide được bắt đầu với mã khởi đầu (start codon - ATG) và kết thúc bằng
một mã dừng (stop codon - TAA) [6].
So sánh trình tự gen của EtxB và EtxD trong khung đọc mở cho thấy chỉ
sai khác 2 nucleotide, kết quả của quá trình dịch mã chỉ có 1 axit amin được thay
thế [18].
1.4.3. Độc lực độc tố epsilon và phương pháp xác định
Có nhiều phương pháp để phát hiện độc tố epsilon và giám định các bệnh
do độc tố gây ra ở động vật. Các kỹ thuật miễn dịch học đã được áp dụng để phát
hiện sự có mặt của độc tố như kỹ thuật khuyếch tán phóng xạ đơn, phản ứng vi kết