Nghiên cứu khả năng nhân nhanh cây khoai mỡ (dioscorea alata l ) bằng kỹ thuật in vitro

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Phân bố các mẫu giống Khoai mỡ (Dioscorea alata L.) trong tập đoàn
theo vùng sinh thái Error: Reference source not found
Bảng 4.1. Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl
2
0,1% đến hiệu
quả vô trùng vật liệu nuôi cấy chồi Khoai mỡ (Dioscorea alata L.) Error:
Reference source not found
Bảng 4.2. Kết quả ảnh hưởng của môi trường MS, B5, WPM đến khả năng tái
sinh chồi Khoai mỡ (Dioscorea alata L.) Error: Reference source not
found
Bảng 4.3. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ GA
3
đến khả năng bật chồi Khoai mỡ
(Dioscorea alata L.) (sau 30 ngày nuôi cấy) Error: Reference source not
found
Bảng 4.4. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi
Khoai mỡ (Dioscorea alata L.) (sau 30 ngày nuôi cấy) Error: Reference
source not found
Bảng 4.5. Kết quả ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BA kết hợp với nồng độ
Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Khoai mỡ (Dioscorea alata L.)
(sau 30 ngày nuôi cấy) Error: Reference source not found
Bảng 4.6. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của cây
Khoai mỡ (Dioscorea alata L.) (sau 30 ngày nuôi cấy) Error: Reference
source not found
DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Sơ đồ quá trình phân hóa và phản phân hóa của Tế bào Thực vật. Error:
Reference source not found
Hình 4.1. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl
2
0,1% đến

hiệu quả vô trùng vật liệu nuôi cấy chồi Khoai mỡ (Dioscorea alata L.)
Error: Reference source not found
Hình 4.2. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của môi trường MS, B5, WPM đến khả
năng tái sinh chồi Khoai mỡ (Dioscorea alata L.) Error: Reference source
not found
Hình 4.3. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ GA
3
đến khả năng bật chồi
Khoai mỡ (Dioscorea alata L.) Error: Reference source not found
Hình 4.4. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh
chồi Khoai mỡ (Dioscorea alata L.) Error: Reference source not found
Hình 4.5. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ BA và Kinetin đến khả năng
nhân nhanh chồi Khoai mỡ (Dioscorea alata L.). .Error: Reference source
not found
Hình 4.6. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của
cây Khoai mỡ (Dioscorea alata L.) Error: Reference source not found
DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT
ADN : Axit deoxyribonucleic
B1 : Thiamin
B3 : Nicotinic acid
B5 : Gamborg’s
B6 : Pyridocine acid
BA : 6-Benzyl amino purine
cs : Cộng sự
CV : Coefficient of Variation
Đ/C : Đối chứng
GA
3
: Acid Gibberellic
IAA : Indole-3-Axetic acid

IBA : Indole-3-Butyric acid
Kinetin : 6-Furfurylaminopurine
LS : Linsmaier & Skoog
LSD : Least Significant Difference
MS : Murashige and Skoog’s
NAA : -Naphlene Axetic acid
TN : Thí nghiệm
WP : Mc Cown & Lloyd
WPM : Woody Plant Medium (Lloyd & McCown, 1980)
MỤC LỤC
MỤC LỤC 4
PHẦN 1 1
MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
2.2.1. Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật 7
Gibberellin được phát hiện đầu tiên bởi nhà nghiên cứu người nhật Kurosawa
(1920) khi nghiên cứu bệnh ở mạ lúa do nấm Gibberella Fujikuroi gây ra. Năm
1939 đã tách chiết được Gibberellin từ nấm G. Fujikuroi và được gọi là
Gibberellin A. Gibberellin có tác dụng kéo dài tế bào, nhất là thân và lá vì vậy khi
xử lý với các cây đột biến lùn và các cây này có thể khôi phục lại bình thường.
Các nghiên cứu tiếp theo khám phá ra trong cơ thể thực vật cũng có các chất
giống như Gibberellin cả về cấu tạo và tác dụng. Những chất này đặt tên theo thứ
tự là A1, A2, A3 và A4. Do Gibberellin tồn tại trong thực vật, nó tham gia vào
các quá trình sinh trưởng và phát triển trong sự tương tác với các chất điều hoà
sinh trưởng khác [2], [13]. Trong cây Gibberellin được tổng hợp ở lá đang phát
triển, quả và rễ sau đó được vận chuyển đi khắp nơi trong cây và có nhiều trong
xylem [15] 12
e) Các chất bổ sung 12
2.5. Một số kết quả nghiên cứu trên thế giới và trong nước 15
3.3. Hóa chất và thiết bị 19

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1%
đến hiệu quả vô trùng vật liệu nuôi cấy chồi Khoai mỡ (Dioscorea alata L.) (sau
10 ngày nuôi cấy) 21
Hóa chất 21
Công thức thí nghiệm 21
Thời gian (phút) 21
HgCl2 0,1% 21
CT1 (Đ/C) 21
0 21
CT2 21
3 21
CT3 21
5 21
CT4 21
7 21
CT5 21
10 21
- Phương pháp nhân nhanh in vitro: 22
+ Các chồi sau khi được tái sinh, không bị nhiễm nấm, vi khuẩn được lựa chọn
đưa vào nuôi cấy 22
+ Sử dụng dao cấy (lưỡi dao số 11 đã được khử trùng) nhẹ nhàng tách các chồi
đã tái sinh ra khỏi đoạn thân, kích thước mỗi đoạn chồi có chiều dài từ 0,5-1cm,
dùng pank cấy gắp đặt trên bề mặt môi trường nuôi cấy đã được chuẩn bị trước.
22
+ Mẫu được cấy với mật độ đồng đều, cấy xong đưa vào phòng nuôi cây. Sau đó
tiến hành theo dõi số chồi và chất lượng chồi (quan sát bằng mắt thường) 23
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn. Với 5 công
thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình, mỗi bình cấy 1
mẫu. Thí nghiệm được bố trí như sau: 23
- Phương pháp tạo cây hoàn chỉnh in vitro: Lựa chọn chồi Khoai mỡ có từ 2-3 lá,

chiều cao thân 8-10 cm chuyển sang môi trường ra rễ. Môi trường ra rễ dựa trên
MT nền có bổ sung các nồng độ NAA khác nhau để kích thích tạo rễ bất định,
hình thành cây con hoàn chỉnh. 24
Hệ số nhân chồi (lần) 25
= 25
Tổng số chồi tạo thành (chồi) 25
Tổng số chồi nuôi cấy ban đầu (mẫu) 25
Số rễ trung bình/cây (rễ) 25
= 25
Tổng số chồi ra rễ (rễ) 25
Tổng số chồi nuôi cấy (mẫu) 25
4.1. Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến hiệu quả
vô trùng vật liệu nuôi cấy chồi Khoai mỡ (Dioscorea alata L.) 27
Ghi chú: *: Sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95% 27
Hình 4.1. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1%
đến hiệu quả vô trùng vật liệu nuôi cấy chồi Khoai mỡ (Dioscorea alata L.) 28
-Từ bảng 4.1 và hình 4.1 cho thấy: 28
Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm: Với giá trị LSD.05 đạt 7,43 các công thức khác
nhau đều có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Tỷ lệ mẫu sống không
nhiễm cao nhất ở CT4 khi khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong 7 phút
đạt 73,33%. Thấp nhất ở công thức Đ/C (đối chứng) với 0%. Với thời gian khử
trùng từ 0-7 phút thì tỷ lệ mẫu sống không nhiễm tăng dần từ 0-73,33%; Còn từ
7-10 phút thì tỷ lệ mẫu sống không nhiễm bắt đầu giảm xuống chỉ còn 65%. tỷ lệ
mẫu nhiễm thấp nhất 5% 28
Tỷ lệ mẫu chết: Với giá trị LSD.05 đạt 2,35 các công thức khác nhau đều có sự
sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. CT5 tỷ mẫu chết cao nhất đạt
30%.Thấp nhất ở công thức Đ/C (đối chứng) với 0%, tiếp theo CT4 đạt 10%. . 28
Sử dụng HgCl2 0,1% ở các mức thời gian khác nhau thì cho hiệu quả khử trùng
(khả năng diệt trừ nấm, vi khuẩn) khác nhau 28
- Kết quả trên được giải thích như sau: Gốc Hg2+ có hoạt tính, tính khử trùng

mạnh, gây thoái hóa tổ chức, tạo thành các hợp chất protein rất dễ tan làm tê liệt
chức năng của các nhóm thiol (-SH), các hệ thống men cơ bản và oxi hóa khử của
tế bào và có thể liên kết với các protein của máu và mô, làm tê liệt và phá hủy tế
bào nấm, khuẩn nhanh chóng. Khi tăng thời gian khử trùng lên 10 phút thì tỷ lệ
mẫu sống không nhiễm bắt đầu giảm xuống chỉ còn 65%, tỷ mẫu chết cao nhất
đạt 30% và tỷ lệ mẫu nhiễm thấp nhất 5% 29
Theo kết quả công bố của tác giả Đặng Ngọc Phúc và cs (2011) [10] nghiên cứu
phương pháp khử trùng đỉnh sinh trưởng và đoạn thân cây Sa Nhân tím
(Amomum longiligulare T.L.Wu) bằng HgCl2 0,1% trong các khoảng thời gian
khác nhau. Kết quả cho thấy thời gian khử trùng trong 12 phút cho tỷ lệ sống
không nhiễm cao nhất đạt 86,67% đối với đoạn thân 29
Theo kết quả công bố của tác giả Nguyễn Thanh Đào và cs (2013) [5] nghiên
cứu phương pháp khử trùng đoạn thân có chứa chồi nách hoặc chồi ngọn cây Bắp
cải cảnh (Brassica oleracea L. var. sabellica) bằng HgCl2 0,1% trong các khoảng
thời gian khác nhau. Kết quả cho thấy thời gian khử trùng trong 8 phút cho tỷ lệ
sống không nhiễm cao nhất đạt 90%. So với kết quả nghiên cứu của chúng tôi
trên đối tượng cây Khoai mỡ thì kết quả của các tác giả cao hơn điều này có thể
do: 29
Giống, thời điểm lấy mẫu và thời gian khử trùng khác nhau; 29
Cây Khoai mỡ dang thân leo không có khả năng tự đứng bò trên mặt đất. Đặc
điểm này làm cho đỉnh sinh và đoạn thân thường chứa nhiều nấm và vi khuẩn gây
khó khăn trong quá trình khử trùng mẫu; 29
Cây Khoai mỡ là loài thân mọng nước rất rất dễ bị tổn thương bởi vết xây xước
từ dụng cụ thao tác, hay hóa chất khử trùng 29
- Kết luận: Đối với Khoai mỡ khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 7 phút
cho hiệu quả tạo vật liệu vô trùng tốt nhất đạt 73,33% và tỷ lệ chết thấp nhất đạt
10% 29
4.2. Kết quả ảnh hưởng của môi trường MS, B5, WPM đến khả năng tái sinh chồi
Khoai mỡ (Dioscorea alata L.) 29
Hiện nay người ta đưa ra rất nhiều loại môi trường cho các cây khác nhau. Nhìn

chung chúng đều gồm thành phần khoáng, chất kích thích sinh trưởng, nguồn các
bon, các vitamine Các môi trường khác nhau đều thay đổi thành phần nồng độ
các chất cơ bản trong môi trường. Để tìm ra môi trường thích hợp chúng tôi tiến
hành thử nghiệm trên 3 loại môi trường đó là: 30
- Môi trường giàu dinh dưỡng (MS); 30
- Môi trường trung bình (B5); 30
- Môi trường nghèo dinh dưỡng (WPM). 30
Tiến hành theo dõi kết quả sau 20 ngày nuôi cấy, kết quả nghiên cứu được thể
hiện bảng 4.2 và hình 4.2 30
Bảng 4.1. Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến hiệu
quả vô trùng vật liệu nuôi cấy chồi Khoai mỡ (Dioscorea alata L.) (sau 10 ngày
nuôi cấy) 47
PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Khoai mỡ (Dioscorea alata L.) thuộc họ Củ nâu (Dioscoreaceae), bộ Củ nâu
(Discoreales), phân lớp Hành (Lilianae), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) và giới
thực vật bậc cao có mạch [4]. Là 1 loài trong số 10 loài quan trọng nhất có giá trị
kinh tế của chi Dioscorea, thuộc nhóm cây lấy củ được ghi nhận là một trong những
cây lương thực lâu đời nhất Việt Nam. Thành phần dinh dưỡng của củ Khoai mỡ
gồm có đường, tinh bột, chất xơ và một số loại khoáng chất như P, Ca, Mg, K,
vitamin C, vitamin nhóm B [3]. Đặc biệt củ Khoai mỡ chứa chất Diosgenin được
chiết xuất sử dụng để tổng hợp cortisone, pregnenolone, progesterone và các sản
phẩm steroid khác có hoạt tính estrogen trong sản xuất dược liệu làm giảm
cholesterol trong máu [3]. Và để điều trị khô âm đạo ở phụ nữ lớn tuổi hơn, hội
chứng tiền kinh nguyệt, kinh nguyệt đau, viêm khớp, tăng năng lượng và ổ định tình
dục ở nam giới và phụ nữ, và làm nở ngực [7], [19].
Hiện nay với nhu cầu sử dụng ngày càng nhiều nhưng việc cung cấp giống
cây Khoai mỡ để trồng chủ yếu do các hộ gia đình làm thủ công theo phương pháp
truyền thống, sau khi thu hoạch Khoai mỡ những củ cái to được bán thương phẩm còn

những củ nhỏ thì được lưu giữ để làm giống. Mặt khác cây Khoai mỡ là có xu thế phân
nhánh củ ít, hệ số nhân giống thấp, hơn nữa củ con để từ vụ trước sang vụ sau nếu
không đảm bảo tốt thì rất dễ thối hỏng, giảm sức sống và sức nảy mầm của cây con.
Việc để giống theo cách truyền thống không thể kiểm soát được về mặt sâu bệnh của
giống, nhiều loại virus, nấm, ký sinh trùng gây bệnh trên cây Khoai mỡ có thể được lưu
giữ cùng giống từ vụ này sang vụ khác, giống không đảm bảo để trồng.
Nếu sử dụng phương pháp nhân giống như vậy thì việc đáp ứng kịp nhu cầu
thị trường là rất khó khăn. Cùng sự phát triển của khoa học kỹ thuật, kỹ thuật nuôi
cấy in vitro ra đời đã mở ra một hướng khắc phục hiệu quả những khó khăn trên.
Nuôi cấy in vitro có thể từ một lượng nhỏ mẫu ban đầu nhân lên với số lượng lớn
cây con, chất lượng tốt, độ đồng đều cao, giữ được đặc tính di truyền của cây mẹ và
chúng ta có thể kiểm soát được các loại dịch bệnh. Từ thực tiễn trên chúng tôi đã
tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả năng nhân nhanh cây Khoai mỡ
(Dioscorea alata L.) bằng kỹ thuật in vitro”.
1
1.2. Mục đích của đề tài
- Tìm ra quy trình nhân nhanh cây Khoai mỡ (Dioscorea alata L.) bằng kỹ
thuật in vitro.
1.3. Yêu cầu đề tài
-
Xác định ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch HgCl
2
0,1% đến
hiệu quả vô trùng vật liệu nuôi cấy chồi Khoai mỡ.
- Xác định được ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy (MS, B5, WPM) đến
khả năng tái sinh chồi Khoai mỡ.
- Xác định được ảnh hưởng của nồng độ GA
3
đến khả năng bật chồi Khoai mỡ.
- Xác định được ảnh hưởng của nồng độ BA, Kinetine đến khả năng nhân

nhanh chồi Khoai mỡ.
- Xác định được ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của chồi
Khoai mỡ.
1.4. Ý nghĩa của đề tài
Ý nghĩa trong học tập và nghiên cứu khoa học
- Kết quả nghiên cứu của đề tài đưa ra biện pháp tái sinh chồi Khoai mỡ bằng
phương pháp in vitro phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
- Giúp sinh viên củng cố và hệ thống hoá lại kiến thức đã học vào nghiên cứu
khoa học.
- Biết được phương pháp nghiên cứu một vấn đề khoa học, xử lý, phân tích
số liệu, trình bày một bài báo cáo khoa học.
Ý nghĩa thực tiễn
Hoàn thiện được quy trình nhân nhanh cây Khoai mỡ bằng kỹ thuật in vitro,
để đảm bảo sản xuất được cây con sinh trưởng phát triển tốt, đồng đều và sạch bệnh
với khối lượng lớn, kịp thời phục vụ cho sản xuất. Mặt khác khắc phục được những
khó khăn về diện tích canh tác, điều kiện tự nhiên, công chăm sóc so với phương
pháp nhân giống truyền thống.
2
PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu chung về cây Khoai mỡ
2.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây Khoai mỡ
2.1.1.1. Nguồn gốc cây Khoai mỡ
Khoai mỡ thuộc nhóm cây lấy củ được ghi nhận là một trong những cây
lương thực lâu đời nhất ở Việt Nam. Có rất nhiều quan điểm về nguồn gốc cây
Khoai mỡ, tuy nhiên cho đến nay, đa số quan điểm đều cho rằng loài này có nguồn
gốc ở trung tâm Đông Nam Á. Người ta cũng đã xác định được số lượng rất lớn các
giống Khoai mỡ bản địa đã tồn tại và được thuần hóa, trồng trọt từ rất sớm tại các
vùng từ Ấn Độ đến các đảo thuộc Nam Thái Bình Dương [3].
2.1.1.2. Phân loại cây Khoai mỡ

Theo hệ thống thực vật [4] cây Khoai mỡ được phân loại như sau:
Giới (regnum) : Plantae
Ngành (Phylum) : Magnoliophyta (Angiospermae)
Lớp (Class) : Liliospida (Monocotyledones)
Phân lớp : Lilianae
Liên bộ : Liliales
Bộ (Ordo) : Discoreales
Họ (Family) : Discoreaceae
Chi (Genus) : Discorea
Loài (Species) : Alata L.
3
2.1.2. Đặc điểm hình thái và đặc điểm phân bố cây Khoai mỡ
2.1.2.1. Đặc điểm hình thái cây Khoai mỡ
Cây có thân leo, quấn sang phải, màu xanh, không có gai, thỉnh thoảng có
những nốt sần con, có tiết diện vuông và có bốn cánh mỏng ở bốn góc. Củ có nhiều
hình dạng thay đổi: Hình trụ, hình chùy, hình trứng hay hình tù và phân nhánh ít
hay nhiều; vỏ củ mỏng, dễ cạo, màu nâu xám, có nhiều mắt; Thịt củ có màu trắng,
vàng ngà hay tím, tùy giống. Lá đơn, phần lớn mọc đối, hình tim hay hình mác, đầu
nhọn, dài từ 10-20 cm, có từ 5-7 gân hình cung, phiến lá mềm, nguyên. Cụm hoa
đực dạng bông, trục khúc khuỷu. Cụm hoa cái thõng xuống. Quả nang có 3 cánh;
Hạt có cánh màu nâu đỏ [3]. Cây đôi khi cũng có củ đeo [7].
a) Đặc điểm của rễ
Rễ thuộc loại rễ chùm, ăn ngang trong đất. Chính vì vậy hệ thống sợi rễ nằm
gần bề mặt đất, hầu hết ở độ sâu 30 cm và chỉ rất ít giống có rễ ăn sâu tới 80-100
cm. Có 2 loại rễ:
- Rễ mọc từ gốc của thân hay từ đầu củ thường mập và là rễ cung cấp dinh
dưỡng chính và nước cho cây, nếu củ có chồi trong bảo quản thì ngay tại gốc thân
vẫn mọc rất nhiều rễ ngắn, mập có đường kính khoảng 3 mm.
- Rễ mọc ra từ thân củ quá ngắn và quá bé nên hấp thụ chất dinh dưỡng
không đáng kể. Một số giống Khoai mỡ, rễ còn có thể mọc ra từ một số đốt gần gốc

của cây đang phát triển [3].
b) Đặc điểm của thân
Thân có cấu trúc hình dây; Bản thân nó không có khả năng tự đứng mà phải
tựa vào cọc hoặc leo vào giàn. Hầu hết các giống có thân phát triển dài vài mét
trước khi phân nhánh. Thân thường có màu xanh nhưng cánh thỉnh thoảng có màu
đỏ hay tím bởi sự có mặt của chất sắc tố, không có gai, thỉnh thoảng có những nốt
sần con, có tiết diện vuông và có bốn cánh mỏng ở bốn góc với màng chạy dọc theo
chiều dài của thân, khi leo nó thường quấn sang phải [3].
c) Đặc diểm của lá
Lá thuộc loại lá đơn, nhẵn, màu xanh, mọc đối, tuy nhiên một số giống có
hiện tượng mọc cách, thường có hình trứng, hình tim và đỉnh lá thường nhọn.
Những gân lá chính thường xuất phát từ gốc lá, các gân phụ phân bố theo hình mắt
lưới. Màu sắc và kích thước lá biến động khá lớn, phụ thuộc vào giống và điều kiện
4
chăm sóc. Các giống khác nhau về hình dạng lá, được xác định bởi độ rộng và sâu
của gian thùy giữa hai thùy lá. Cuống lá thường dài (6-12 cm) và cánh thường mở
rộng tại gốc [3].
d) Đặc điểm của củ
Củ Khoai mỡ thuộc loại thân củ hình thành từ Hypocotil – vùng giữa thân củ
và rễ (Onwueme, 1986). Củ chia thành 3 phần: phần đầu củ, phần giữa củ và phần
đuôi củ. Củ của cây Khoai mỡ thuộc dạng thân củ ngầm, thường là củ đơn nhưng
thỉnh thoảng có 2-5 củ mọc chụm. Củ có thể phân nhánh hoặc không, thịt củ thường
mịn nhưng đôi khi bị sần sùi, thô ráp. Vỏ củ mỏng, dễ cạo, màu nâu xám hay nâu
đen. Củ của các giống thường khác nhau về hình dạng, kích thước và màu sắc thịt
củ. Củ có hình dạng thay đổi: Hình trứng, hình ôvan, hình trụ dài, hình tù, hình con
rắn, hình bàn tay, hình chân tượng…Tùy thuộc vào giống và điều kiện trồng trọt.
Khi trong củ không có sắc tố, thịt củ có màu trắng hay kem, nếu có sắc tố biên độ
màu thịt củ biến động từ vàng, hồng tới tím. Ở một số giống chỉ có đường viền
ngoài thịt củ có màu hồng, đỏ hay tím trong khi ở một số giống khác nhau chất sắc
tố phân bố đều khắp củ hoặc không đều từ đầu đến cuối củ [3].

đ) Đặc điểm của hoa, quả và hạt
- Hoa: Trong thực tế hầu hết các giống Khoai mỡ đều không ra hoa, nếu có
thì hoc đực được hình thành từ trục bông, trong khi hoa cái sinh ra từ nhánh. Cả trục
bông và nhánh đều được mọc từ nách lá.
Hoa đực nhỏ, khó nhìn thấy, mỗi hoa có 3 lá đài, 3 cánh và 6 nhị; Cánh và lá đài
thường có màu xanh hay trắng, hạt phấn dính, nhìn dưới kính hiển vi thường có tật.
Hoa cái to hơn hoa đực, có chiều dài 2 mm và 1 mm, thường có màu xanh
hay màu tím. Hoa cái cũng có 3 đài, 3 cánh hoa và 3 bộ nhụy mọc ngắn. Bộ nhụy có
3 bầu nhụy, mỗi bầu nhụy chứa 2 noãn [3].
- Quả: Thuộc dạng quả nang, khô có nhiều ngăn với đường kính khoảng 1-2
cm. Quả có 3 ngăn, vỏ dễ nứt, điểm nối của ngăn kéo dài ra thành cánh phẳng, mỗi
ngăn quả có 2 hạt [3].
- Hạt: Thường nhỏ, dẹt và được bao quanh bởi màng cánh. Những hạt lấy được
từ giống ra hoa, kết hạ, thường không nảy mầm hoặc tỷ lệ nảy mầm rất thấp [3].
5
2.1.2.2. Đặc điểm phân bố cây Khoai mỡ
Cây mọc hoang dại rải rác khắp vùng rừng núi với độ cao từ 100-600 m,
cũng có khi lên đến 1000 m. Cây ưa sáng, ưa ẩm và thuờng chỉ mọc ở đất còn tuơng
đối màu mỡ. Hằng năm, chồi thân từ củ mọc từ tháng 3-4, sau hai tháng có chiều
dài tới vài mét, bao chùm lên các cây giá thể khác. Cây ra hoa quả nhiều và đến
cuối mùa thu, toàn bộ phần trên mặt đất bị tàn lụi [1].
Nguồn củ mọc tự nhiên ở Việt Nam tuơng đối phong phú. Truớc kia, khi
chưa có cây trồng thay thế, riêng ở các tỉnh phía bắc (từ Quảng Bình trở vào) mỗi
năm đã khai thác thu mua được 30 - 60 tấn để làm thuốc [1].
2.1.2.3. Số lượng quần thể
Discorea L. là chi duy nhất trong họ Discoreaceae, có tổng số khoảng 140
loài đều là loại dây leo, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới thuộc
Đông và Đông Nam châu Á. Ở Việt Nam, có khoảng 30 loài; Một số loài cây trồng
lấy tinh bột từ củ và hầu hết đuợc dùng làm thuốc [1].
2.1.3. Giá trị của cây Khoai mỡ

2.1.4.1. Giá trị kinh tế
a) Thành phần dinh dưỡng như sau [3]:
Thành phần Khoai mỡ
Nước (%) 70
Tinh bột (%) 28
Đường (%) 0,7 - 1,0
Chất béo (%) 0,1 - 0,3
Protein thô (%) 1,1 - 2,9
Xơ thô (%) 0,6 - 1,4
Khoáng (%) 0,7 - 2,1
Vitamin C (mg/100g) 5 – 8
Vitamin B
1
(mg/100g) 0,09
Vitamin B
2
(mg/100g) 0,03
Nguồn: Onwueme, I.C. 1978
Củ Khoai mỡ chứa hàm lượng protein thô khá cao, từ 1,1 - 2,9%. Khoảng 85
- 95% lượng đạm có thể được tạo thành 9 axit amin không thay thế, rất cần thiết cho
con người như lizin, treonin, valin, izolơxin, metionin, xittin, phênylalamin, tyrozin
6
và lơxin lượng khoáng (Ca, Fe) và các vitamin như vitamin C, B
1
và B
2
; tuy lượng
thấp nhưng là những chất rất cần thiết cho con người. Hiện nay một số công ty của
Đài Loan, Nhật Bản đang đặt mua Khoai mỡ ruột trắng để chế biến, nhưng với số
khiêm tốn, 1.000 tấn/năm. Thị trường và giá Khoai mỡ tại đồng bằng sông Cửu

Long tương ổn định, do đó, nông dân sản xuất khoai có thể bán ngay tại chỗ cho
thương lái để thu lợi nhuận từ sản xuất [3].
2.1.4.2. Giá trị dinh dưỡng (dược liệu)
Giá trị dược liệu của Khoai mỡ là vấn đề đã được quan tâm nghiên cứu từ
lâu. Ở Trung Mỹ, những sản phẩm thuốc công nghiệp đều được chiết xuất từ
Diosgenin. Hiện nay Diosgenin được yêu cầu như sản phẩm thương mại trên thế
giới [3]. Củ Khoai mỡ chứa chất Diosgenin được chiết xuất sử dụng để tổng hợp
cortisone, pregnenolone, progesterone và các sản phẩm steroid khác có hoạt tính
estrogen trong sản xuất dược liệu làm giảm cholesterol trong máu [3]. Và để điều trị
khô âm đạo ở phụ nữ lớn tuổi hơn, hội chứng tiền kinh nguyệt, kinh nguyệt đau,
viêm khớp, tăng năng lượng và ổ định tình dục ở nam giới và phụ nữ, và làm nở
ngực, …[7] [19].
Công dụng: Chữa kém ăn, gầy gò hay đái đục, đái tháo, di mộng tinh, nấu
cháo củ mỡ ăn, thì sẽ biết đói, ngon cơm, vừa béo người, chắc bắp thịt, mà hết các
chứng thận hư, mỏi lưng gối, tiết tinh, đái đục [7].
2.2. Khái quát về nuôi cấy mô Tế bào Thực vật
2.2.1. Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô là thuật ngữ dùng để chỉ quá trình nuôi cấy vô trùng in vitro các
bộ phân tách rời khác nhau của thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô dùng cho cả hai mục
đích nhân giống và cải thiện di truyền, sản xuất sinh khối các sản phẩm hóa sinh,
bệnh học thực vật, duy trì và bảo quản các nguồn gen quý…[2]. Các hoạt động này
được bao hàm trong thuật ngữ công nghệ sinh học [9].
Nguyên tắc cơ bản của nhân giống vô tính là: Mọi cơ thể sinh vật phức tạp
đều do nhiều đơn vị nhỏ là các tế bào hợp thành. Các tế bào đã phân hóa đều mang
thông tin có trong tế bào đầu tiên và là những tế bào độc lập, từ đó để xây dựng lại
toàn bộ cơ thể [2].
7
2.2.2. Cơ sở khoa học nuôi cấy mô Tế bào Thực vật
2.2.2.1. Tính toàn năng của Tế bào Thực vật
Nguyên lí cơ bản của nhân giống nuôi cấy mô tế bào là tính toàn năng của tế

bào thực vật. Mỗi tế bào bất kì của cơ thể thực vật đều mang toàn bộ lượng thông
tin di truyền của toàn bộ cơ thể. Trong điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể
phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Tính toàn năng của tế bào là cơ sở khoa học
của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. Hiện nay, người ta đã thực hiện được
khả năng tạo ra một cơ thể hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ [6].
2.2.2.2. Sự phân hóa và phản phân hóa
Cơ thể thực vật hình thành là một chính thể thống nhất bao gồm nhiều cơ
quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau. Tuy
nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử).
Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh chưa
mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa). Sau đó, từ các tế bào phôi sinh này chúng
tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô, cơ quan có
chức năng khác nhau [6].
Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô
chuyên hóa, đảm bảo các chức năng khác nhau. Quá trình phân hóa tế bào có thể
biểu thị như sau:
Tế bào phôi sinh → Tế bào dãn → Tế bào phân hoá có chức năng riêng biệt
Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên biệt,
chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình. Trong trường hợp cần
thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia
mạnh mẽ, quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào, ngược lại với sự phân hóa tế
bào [6]. Sự phân hóa và phản phân hóa được biểu thị bằng sơ đồ:
phân hóa tế bào
tế bào phôi sinh tế bào dãn tế bào chuyên hóa
phản phân hóa tế bào
Hình 2.1. Sơ đồ quá trình phân hóa và phản phân hóa của Tế bào Thực vật
8
Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa, ức
chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số
gen được hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ta tính trạng mới, còn một

số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo một chương trình đã
được mã hóa trong cấu trúc của phân tử ADN của mỗi tế bào khiến cho quá trình
sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hòa. Mặt khác, khi tế bào
nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi
tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối mô sẽ tạo điều kiện cho sự
hoạt hóa các gen của tế bào [6].
2.3. Môi trường nuôi cấy mô Tế bào Thực vật
Môi trường dinh dưỡng phải có đầy đủ các chất dinh dưỡng, các chất cần thiết
cho sự phân chia, phân hoá tế bào cũng như sự sinh trưởng bình thường của cây.
Thành phần hoá học của môi trường đóng vai trò quyết định đến sự thành
công hay thất bại của nuôi cấy mô tế bào thực vật. Mỗi một loại vật liệu khác nhau
có những đòi hỏi khác nhau về thành phần môi trường, khi bắt đầu nghiên cứu một
số loài mới hoặc giống mới cần phải chọn lựa cho đối tượng nghiên cứu một loại
môi trường cơ bản phù hợp.
Từ những năm 1933, Tukey đã nghiên cứu tạo ra môi trường nuôi cấy thực
vật, cho đến nay đã có rất nhiều loại môi trường khác nhau được sử dụng cho mục
đích này, trong đó có một số môi trường như: MS, LS, WP. Ví dụ, môi trường MS
là môi trường được sử dụng rộng rãi nhất trong nuôi cấy mô của tế bào thực vật,
môi trường MS thích hợp cho cả thực vật 1 lá mầm, 2 lá mầm.
Tuy có nhiều loại môi trường nuôi cấy mô Tế bào Thực vật nhưng đều gồm
một số thành phần cơ bản sau [2], [14], [16]:
- Các muối khoáng đa lượng và vi lượng;
- Các vitamin và amino acid;
- Nguồn cacbon: Một số các loại đường;
- Các chất điều hòa sinh trưởng;
- Chất bổ sung, chất làm thay đổi trạng thái môi trường.
a) Các muối khoáng đa lượng và vi lượng:
Đối với cây trồng, các chất khoáng đa và vi lượng đóng vai trò rất quan
trọng. Ví dụ magie là một phần của phân tử diệp lục, canxi cấu tạo màng tế bào,
9

nitơ là thành phần quan trọng của vitamin, amino acid và protein. Ngoài ra, các
nguyên tố vi lượng như Fe, Zn, Mo, Mn là thành phần của một số enzym cần thiết
cho hoạt động sống của tế bào.
Muối khoáng là thành phần không thể thiếu trong các môi trường nuôi cấy
Tế bào Thực vật, làm vật liệu cho sự tổng hợp các chất hữu cơ, enzym.
Các ion của các muối hoà tan giúp ổn định áp suất thẩm thấu của môi trường
trong tế bào, duy trì điện thế hoá của thực vật. Ví dụ: K, Ca rất quan trọng trong
điều hoà tính thấm lọc của tế bào [2], [14].
b) Các vitamin và acid amin
Ảnh hưởng của các vitamin đến sự phát triển của tế bào nuôi cấy in vitro ở
các loài khác nhau là khác nhau hoặc thậm chí còn có hại (gây độc).
Hầu hết tế bào nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các loại vitamin cơ
bản nhưng với số lượng dưới mức yêu cầu. Để mô có thể sinh trưởng, tốt nhất phải
bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin và amino acid. Trong các
loại vitamin, B1 được xem là vitamin quan trọng nhất cho sự phát triển của thực vật.
B3 và B6 cũng có thể được bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm tăng cường sức
sống cho mô [2], [14].
c) Nguồn cacbon
Khi nuôi cấy in vitro, các tế bào thực vật thường không có khả năng quang hợp,
do đó đòi hỏi phải cung cấp nguồn cacbon cho các hoạt động dinh dưỡng của tế bào.
Nguồn cacbon được ưa chuộng nhất hiện nay trong nuôi cấy là đường
saccarose, một số trường hợp sử dụng glucose và fructose thay thế cho saccarose
nhưng chúng thường nghèo hydrat cacbon so với nhu cầu của thực vật.
Ngoài ra, khi khử trùng môi trường, cần chú ý không nên kéo dài thời gian
để tránh xảy ra hiện tượng caramen hoá, làm cho môi trường chuyển sang màu vàng
dẫn đến ức chế sự sinh trưởng và phát triển của tế bào [2], [14].
d) Các chất điều hòa sinh trưởng
Chất điều hòa sinh trưởng hoạt động với liều lượng rất thấp, ở liều cao chúng trở
nên độc. Các chất điều hòa nội sinh có thể được kiểm soát do cơ chế chuyển hóa
của tế bào nên chúng được kiểm soát hoặc đào thải khá nhanh. Trái lại các chất điều

hòa tổng hợp tồn tại lâu hơn nhiều nên thường được sử dụng cho các ứng dụng
trong thực tế.
10
- Auxin:
Chất auxin tự nhiên được tìm thấy nhiều ở thực vật là IAA. IAA có tác dụng
kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào và điều khiển sự hình thành rễ. Ngoài IAA,
còn có các dẫn xuất của nó là NAA và 2,4-D (2,4 - Diclophenoxy acid). Các chất
này cũng đóng vai trò quan trọng trong sự phân chia của mô và trong quá trình hình
thành rễ. NAA có tác dụng tăng hô hấp của tế bào và mô nuôi cấy, tăng hoạt tính
enzym và ảnh hưởng mạnh đến trao đổi chất của nitơ, tăng khả năng tiếp nhận và sử
dụng đường trong môi trường. NAA là auxin nhân tạo, có hoạt tính mạnh hơn auxin tự
nhiên IAA, NAA có vai trò quan trọng đối với phân chia tế bào và tạo rễ [2], [16].
Trong cây auxin được tổng hợp ở các mô non đặc biệt là lá đang phát triển và
vùng đỉnh chồi. Từ những vùng này auxin được chuyển xuống các phần phía dưới
của cây [2].
- Cytokinin:
Cytokinin là chất điều hoà sinh trưởng có tác dụng làm tăng sự phân chia tế
bào. Các Cytokinin thường gặp là Kinetin, BA. Kinetin được Skoog phát hiện ngẫu
nhiên trong chiết xuất acid nucleic. Kinetin thực chất là một dẫn xuất của bazơ nitơ
adenine. BA là Cytokinin tổng hợp nhân tạo nhưng có hoạt tính mạnh hơn nhiều
Kinetin. Kinetin và BA cùng có tác dụng kích thích phân chia tế bào kéo dài thời
gian hoạt động của tế bào phân sinh và làm hạn chế sự già hoá của tế bào. Ngoài ra
các chất này có tác dụng lên quá trình trao đổi chất, quá trình tổng hợp ADN, tổng
hợp protein và làm tăng cường hoạt tính của một số enzyme. Cơ chế tác dụng của
auxin ở mức độ phân tử trong tế bào thể hiện bằng tác dụng tương hỗ của Cytokinin
với các nucleoprotein làm yếu mối liên kết của histone với ADN, tạo điều kiện cho
sự tổng hợp ADN [2], [16].
Nghiên cứu của Miller và Skoog (1963) đã cho thấy không phải các chất kích
thích sinh trưởng ngoại sinh tác dụng độc lập với hormon sinh trưởng nội sinh. Phân
chia tế bào, phân hoá và biệt hoá được điều khiển bằng sự tác động tương hỗ giữa

các hormon ngoại sinh và nội sinh. Tác động phối hợp của Auxin và Cytokinin có
tác dụng quyết định đến sự phát triển và phát sinh hình thái của tế bào và mô.
Những nghiên cứu của Skoog cho thấy tỷ lệ Auxin/Cytokinin cao thì thích hợp cho
sự hình thành rễ, và thấp thì thích hợp cho quá trình phát sinh chồi. Nếu tỷ lệ này ở
mức độ cân bằng thì thuận lợi cho phát triển mô sẹo (callus). Das (1958) và Nitsch
11
(1968) khẳng định rằng chỉ khi tác dụng đồng thời của Auxin và Cytokinin thì mới
kích thích mạnh mẽ sự tổng hợp ADN, cảm ứng cho sự phân chia tế bào. Theo
Dmitrieva (1972) giai đoạn đầu của quá trình phân bào được cảm ứng bởi auxin còn
giai đoạn tiếp theo thì cần tác động tổng hợp của cả hai chất kích thích. Skoog và
Miller (1957) đã khẳng định vai trò của Cytokinin trong quá trình phân chia tế bào,
cụ thể là Cytokinin điều khiển quá trình chuyển pha trong mitos và giữ cho quá
trình này diễn ra một cách bình thường. Cytokinin được tổng hợp bởi rễ và hạt đang
phát triển [2], [16].
- Gibberellin acid:
Gibberellin được phát hiện đầu tiên bởi nhà nghiên cứu người nhật
Kurosawa (1920) khi nghiên cứu bệnh ở mạ lúa do nấm Gibberella Fujikuroi gây ra.
Năm 1939 đã tách chiết được Gibberellin từ nấm G. Fujikuroi và được gọi là
Gibberellin A. Gibberellin có tác dụng kéo dài tế bào, nhất là thân và lá vì vậy khi
xử lý với các cây đột biến lùn và các cây này có thể khôi phục lại bình thường. Các
nghiên cứu tiếp theo khám phá ra trong cơ thể thực vật cũng có các chất giống như
Gibberellin cả về cấu tạo và tác dụng. Những chất này đặt tên theo thứ tự là A1, A2,
A3 và A4. Do Gibberellin tồn tại trong thực vật, nó tham gia vào các quá trình sinh
trưởng và phát triển trong sự tương tác với các chất điều hoà sinh trưởng khác [2],
[13]. Trong cây Gibberellin được tổng hợp ở lá đang phát triển, quả và rễ sau đó
được vận chuyển đi khắp nơi trong cây và có nhiều trong xylem [15].
e) Các chất bổ sung
Agar: Trong môi trường nuôi cấy tĩnh, người ta thường sử dụng agar để làm
đặc môi trường. Nồng độ agar sử dụng thường là 0,6-1%, đây là loại tinh bột đặc chế
từ rong biển để tránh hiện tượng mô chìm và sẽ chết vì thiếu O

2
khi nuôi trong môi
trường lỏng [2], [12]. Agar tan ở nhiệt độ 100
0
C và đông đặc lại ở 45
0
C. Trong môi
trường quá acid (pH<4,5) agar không có khả năng đông đặc [12].
pH môi trường: Với mỗi loại cây trồng yêu cầu một loại môi trường khác
nhau nhưng pH của môi trường thường là 5,6-6,0. Nếu pH của môi trường thấp hơn
5,0 thì agar sẽ không đông và cao hơn 6,0 sẽ làm môi trường bị cứng [14]. Nếu pH
>7,0 hoặc <4,5 đều ức chế cho quá trình sinh trưởng, phát triển của mô, tế bào. Để
điều chỉnh pH của môi trường người ta thường dùng NaOH 1M, HCl 1M.
12
Than hoạt tính:
Bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy có tác dụng khử độc. Than hoạt
tính cho vào môi trường để hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol… trong
trường hợp những chất đó gây ức chế sinh trưởng của mẫu nghiên cứu. Than
hoạt tính làm thay đổi môi trường ánh sáng, do môi trường trở nên sẫm khi có nó
vì thế có sự kích thích sự hình thành và sinh trưởng của rễ. Than hoạt tính còn là
một trong những chất chống oxy hóa tốt. Nhìn chung nó có ảnh hưởng trên 3
mặt: hút các hợp chất cản, hút các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong môi
trường nuôi cấy hoặc làm đen môi trường [11].
2.4. Các giai đoạn chính trong nhân giống in vitro
2.4.1. Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ
Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ
(cây cho nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này cần phải sạch bệnh đặc biệt là bệnh
vi rút và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh. Việc trồng các cây trong điều kiện môi
trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi
lấy mẫu cấy sẽ làm giảm tỉ lệ mẫu nhiễm và tăng khả năng sống và sinh trưởng

của mẫu cấy in vitro [11].
2.4.2. Khử trùng mẫu và cấy khởi động
Giai đoạn này nhằm tạo mẫu sạch và non trẻ cho các giai đoạn nuôi cấy tiếp
theo nên cần đảm bảo tỷ lệ mẫu bị nhiễm ít, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh
trưởng tốt. Bộ phận của cây được chọn làm mô nuôi cấy phụ thuộc vào hình thức
nhân giống thích hợp cho từng loại cây và đúng giai đoạn phát triển. Đỉnh sinh
trưởng và chồi bên được sử dụng ở hầu hết các loại cây trồng. Ngoài ra chóp đỉnh
và chồi non nảy nầm từ hạt cũng được sử dụng nhiều. Mẫu trước khi cấy vào môi
trường cơ bản phải được làm sạch nguồn bệnh bằng cách rửa nhiều lần bằng nước
sạch, sau đó ngâm vào trong dung dịch khử trùng với hàm lượng và thời gian thích
hợp. Tùy vào từng vật liệu mà chọn các hóa chất khử trùng khác nhau. Trong đó
quá trình khử trùng mẫu phải đảm bảo không làm ảnh hưởng đến sức sống của mẫu
cấy. Sau đó đặt mẫu vào môi trường đồng nuôi cấy như MS, B
5
,… Khi nuôi cấy cần
chú ý tới điều kiện ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm và hàm lượng CO
2
thích hợp.
13
2.4.3. Tạo chồi và nhân nhanh
Đây là giai đoạn cực kỳ quan trọng và quyết định sự thành công của toàn bộ
quá trình nhân giống. Trong giai đoạn này vai trò của chất điều hòa sinh trưởng có
đóng góp rất lớn trong việc kích thích tạo chồi mà vẫn đảm bảo được sức sống và
bản chất di truyền của vật liệu nuôi cấy.
2.4.4. Tạo cây mô hoàn chỉnh
Kích thích chồi ra rễ là giai đoạn quan trọng để có được cây hoàn chỉnh.
Chồi hữu hiệu được chọn lựa đưa vào môi trường ra rễ. Môi trường tạo rễ thường
giảm đi một nửa hàm lượng các chất môi trường cơ bản nhằm hạn chế quá trình
sinh trưởng, tập chung cho ra rễ, loại bỏ các chất kích thích tạo chồi, phân chia chồi
và thay vào đó là một số auxin kích thích tạo rễ. Tùy theo loại cây mà sử dụng các

hàm lượng Auxin cho phù hợp. Thông thường các chất NAA, IBA, IAA được sử
dụng với hàm lượng 1-5 mg/l để kích thích chồi ra rễ đối với một số cây thân gỗ.
Một số trường hợp đặc biệt nếu chồi tạo ra quá nhỏ và ngắn có thể sử dụng GA
3
và
và một số hợp chất như nước dừa… bổ sung vào môi trường để đạt tiêu chuẩn cây
con chuyển sang khu huấn luyện.
2.4.5. Chuyển cây in vitro ra ngoài vườn ươm
Cây con đạt tiêu chuẩn về hình thái nhất định (số lá, số rễ, chiều cao cây) sẽ
được đưa ra ngoài huấn luyện một thời gian để thích ứng với điều kiện môi trường
bên ngoài, sau đó chuyển từ ống nghiệm ra nhà kính hay nhà lưới, sau đó chuyển
cây ra ngoài vườn ươm. Cây in vitro do được nuôi cấy trong điều kiện ổn định về
dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, điều kiện vô trùng tốt nên khi chuyển ra
ngoài với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác hẳn như dinh dưỡng thấp, ánh sáng có
cường độ mạnh, nhiệt độ cao, ẩm độ thấp, cây con dễ mấy nước và mau héo.
Để tránh tình trạng này, vườn ươm cây nuôi cấy mô phải mát, cường độ
chiếu sáng thấp, ẩm độ cao Cây con được cấy trong luống ươm có cơ chế dễ thoát
nước, tơi xốp, giữ được ẩm. Trong những ngày đầu phải được phủ nilon để giảm
thiểu quá trình thoát hơi nước của lá (thường 7-10 ngày kể từ ngày cấy). Rễ tạo ra
trong quá trình nuôi cấy mô sẽ dần bị lụi đi và rễ mới xuất hiện, cây con thường
được xử lý thêm với các chế phẩm kích thích ra rễ bằng cách ngâm hoặc phun lên lá
để rút ngắn thời gian ra rễ.
14
2.5. Một số kết quả nghiên cứu trên thế giới và trong nước
2.5.1. Tình hình nghiên cứu cây Khoai mỡ (Dioscorea alata L.) trên thế giới
Theo Jean Martine và cs (1991) [24] khi nghiên cứu về tác động của một số
chất điều hòa sinh trưởng vào quá trình tạo củ của loài Dioscorea alata L. 'Brazo
fuerte'. Cắt đoạn thân của Dioscorea alata L.‘Brazo fuerte’ và Dioscorea abyssinica
Hoch được nuôi trong ống nghiệm để đánh giá ảnh hưởng của NAA về sản xuất củ
bi. Trên đối tượng D. alata, nồng độ cao của NAA (27 và 54 mg/l) ủng hộ việc sản

xuất củ bi lớn, trong đó số lượng cao nhất của củ bi thu được với nồng độ NAA 2,7
mg/l; Trọng lượng của củ bi tăng khi nồng độ ABA tăng; BAP ở nồng độ thấp 0,22
mg/l ảnh hưởng xấu đến sự sống còn của mẫu cấy. Tác động này, chỉ quan sát trên
nuôi cấy dưới 8 giờ chiếu sáng, nhưng không phải trên nuôi cấy dưới 16 giờ. Trên đối
tượng D. abyssinica với nồng độ NAA cao hơn 0,27 mg/l thúc đẩy sự tăng
trưởng của mô sẹo trên bộ rễ. Trong loài này, việc sản xuất các củ bi lớn nhất thu
được 2,7 mg/l trong khi số lượng củ bi không bị ảnh hưởng bởi bất kỳ nồng độ kiểm
tra.
Theo Hodeba D. Mignouna và cs (2003) [20] đã tìm thấy loài Dioscorea
alata được trồng đầu tiên ở Đông Nam Á tuy về diện tích không lớn như ở châu
Phi, nhưng giống D. alata phân bố rất rộng trên thế giới tại châu Á, châu Đại
Dương, châu Phi và tây Ấn. Và loài này được tuyển chọn vào danh sách giống từ
vạc có giá trị kinh tế.
Theo Mandal B. B. và cs (2007) [23] nghiên cứu ảnh hưởng của các chất
điều hòa sinh trưởng thực vật đến khả năng tái sinh chồi đỉnh của cây Dioscorea
floribunda được bảo quản lạnh: Ban đầu đỉnh chồi được bảo quản lạnh nuôi trên
môi trường với BAP 1,5 mg/l + NAA 0,2 mg/l + GA
3
0,2 mg/l trong vòng 25 ngày
tiếp theo nuôi trong 15 ngày trên môi trường với BAP 1 mg/l + NAA 0,5 mg/l +
GA
3
0,3 mg/l. Cuối cùng, chuyển sang một môi trường với BAP 0,05 mg/l + NAA
0,15 mg/l kích thích sản xuất cây con phát triển đầy đủ. Kết quả tất cả các cây tái
sinh mà không hình thành mô sẹo.
Theo I. Q. Ezeibekwe và cs (2009) [21] đã đưa ra kết quả nghiên cứu ảnh
hưởng của sự kết hợp giữa Auxin (NAA) và Cytokinin (BAP) đến khả năng nhân
nhanh in vitro ở cây Discorea rotundata L. (White Yam) như sau: Người ta tiến
hành bổ sung vào môi trường MS lần lượt các nồng độ NAA (0; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0
15

mg/l) và BAP (0 - 0,4 mg/l)

để cấy chuyền cây con Discorea rotundata L Chiều
cao cây, số lá, mắt, dây leo, rễ và trọng lượng tươi đã được đánh giá môi trường cơ
bản. Kết quả thu được với nồng độ BAP 0,2 mg/l + NAA 0,5 mg/l hầu hết cho các
thông số đo cao nhất.
Theo Heena J. Shah. S. S. Lele (2012) [19] khi nghiên cứu về nhân giống in
vitro của Dioscorea alata var. purpurae đã chỉ ra rằng sự nẩy mầm chồi nách của
một số loài trong chi Dioscorea bị ức chế điều chỉnh bởi GA
3
thể hiện tốc độ tăng
trưởng chậm. Kết quả của nghiên cứu cho thấy GA
3
nội sinh duy trì trạng thái ngủ
của chồi nách.
2.5.2. Tình hình nghiên cứu cây Khoai mỡ (Dioscorea alata L.) ở trong nước
Theo Lê Văn Tú và cs (2009) [13] đã đưa ra kết quả đánh giá đa dạng nguồn
gen cây Khoai mỡ (Dioscorea alata L.). Bao gồm:
- Kết quả đánh giá sự phân bố của Khoai mỡ, tập đoàn Khoai mỡ đang bảo
quản tại Trung tâm được thu thập từ nhiều vùng khác nhau trong cả nước. Bảng 1
cho thấy 102 mẫu giống trong tập đoàn được thu thập từ 7 vùng sinh thái trong cả
nước. Vùng Đông Bắc là vùng thu được số lượng mẫu giống cao nhất (44 mẫu
giống chiếm tỷ lệ 43,14 %). Khu vực Nam Trung Bộ và Tây Nguyên có số lượng
mẫu giống thu thập ít nhất (01 mẫu giống chiếm tỷ lệ 0,98 %).
Bảng 2.1. Phân bố các mẫu giống Khoai mỡ (Dioscorea alata L.) trong tập đoàn
theo vùng sinh thái
STT Tên Vùng Số lượng giống Tỷ lệ (%)
1 Vùng Tây Bắc 14 13,73
2 Vùng Đông Bắc 44 43,14
3 Vùng Châu Thổ Sông Hồng 4 3,92

4 Vùng Bắc Trung Bộ 29 28,43
5 Vùng Nam Trung Bộ và Tây
Nguyên
1 0,98
6 Vùng Đông Nam Bộ 3 2,94
7 Vùng Đồng Bắng Sông Cửu
Long
7 6,86
Tổng 102 100
16
- Kết quả đánh giá sự đa dạng một số tính trạng định tính của tập đoàn Khoai
mỡ tập đoàn Khoai mỡ được mô tả, đánh giá với 48 chỉ tiêu hình thái nông học. Kết
quả mô tả 102 mẫu giống có 6 hình dạng khác nhau trong đó hình tim dài có số
lượng mẫu giống cao nhất 45 giống chiếm tỷ lệ 44,12% và lá có dạng hình mác
chiếm tỷ lệ thấp nhất 0,98%. Màu cánh, có 3 màu trong đó cánh màu xanh với rìa
mép tím chiếm tỷ lệ cao nhất 84,31% và cánh có màu xanh và tím có tỷ lệ bằng
nhau chiếm 7,84%. Về màu cuống lá có 3 màu chính, cuống có toàn cuống màu
xanh và tím ở hai đầu có số lượng giống cao nhất (42 mẫu giống chiếm tỷ lệ
41,18%) và cuống có toàn cuống xanh chiếm tỷ lệ thấp nhất 28,43%. Hình dạng củ
có 6 hình dạng khác nhau trong đó củ hình trụ chiếm tỷ lệ cao nhất 49,02% và củ có
dạng hình khác chiếm tỷ lệ thấp nhất 0,98%. Thịt củ có 7 màu khác nhau, trong đó
thịt củ màu vàng kem/trắng ngà có số lượng giống cao nhất 42 mẫu giống chiếm tỷ
lệ 41,18% và thịt củ màu vàng nhạt chiếm tỷ lệ thấp nhất chiếm 2,94%. Kết quả mô
tả, đánh giá cho thấy tập đoàn Khoai mỡ rất đa dạng về đặc điểm hình dạng lá, màu
sắc cánh, màu cuống lá, hình dạng củ, màu thịt củ Những đặc điểm hình thái quan
trọng này có thể sử dụng làm khoá phân loại dưới loài cho tập đoàn Khoai mỡ.
- Kết quả nghiên cứu các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của tập
đoàn khoai mỡ. Cho thấy số lượng củ/khóm có sự biến động rất lớn trong đó số
lượng mẫu giống có từ 1 đến 5 củ/khóm chiếm đa số 86 giống chiếm tỷ lệ 84,31%;
Các giống có số lượng trên 5 củ/khóm chiếm tỷ lệ thấp nhất 1,96%. Trọng lượng củ

trung bình cũng dao động khá lớn (từ 70-840 g/củ), các giống có trọng lượng củ dưới
400g chiếm tỷ lệ cao nhất 73,53% còn các giống có trọng lượng củ trên 800g chỉ
chiếm 0,98%. Nhưng trong thực tế sản xuất hiện nay thì củ có trọng lượng từ 400 đến
800 g/củ có ý nghĩa quan trọng nhất vì dạng củ này đang được thị trường chấp nhận
vì củcó trọng lượng vừa phải phù hợp với nhu cầu cho một bữa ăn của gia đình. Năng
suất lý thuyết trong tập đoàn Khoai mỡ dao động từ 2,22-51 tấn/ha; Với TB là 18,3
tấn/ha; Nhóm có năng suất 13,9-27,8 tấn/ha chiếm tỷ lệ cao nhất chiếm 47,06% và
nhóm có tỷ lệ thấp nhất là nhóm có năng suất trên 27,8 tấn/ha (15,69%).
- Kết quả điều tra một số đặc điểm nông sinh học của một số giống Khoai
mỡ triển vọng: Giống Khoai mỡ có màu thịt củ có thể là trắng, tím, tím pha trắng,
trắng pha tím. Củ có dạng hình 5 trụ, hình oval hoặc hình elip; Vỏ củ nhẵn, rễ trên
bề mặt củ ít, trọng lượng củ 500-1000g là được thị trường chấp nhận và tiêu thụ
17