nghiên cứu phân lập và chuyển gen nac2 liên quan đến tính chịu hạn ở cây lạc

1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Một trong những hiện tượng thay đổi của môi trường ảnh hưởng tới sự sinh
trưởng và phát triển của thực vật là tình trạng hạn. Hạn hán có ảnh hưởng xấu ở các
mức độ khác nhau trong suốt quá trình hay từng giai đoạn sống của cơ thể thực vật
dẫn đến làm giảm năng suất cây trồng, chậm phát triển và gây chết. Hiện nay trên
thế giới có khoảng 45% diện tích đất trồng bị hạn hán. Tại Việt Nam trong 7,3 – 7,4
triệu ha đất trồng thì có tới 1,5 – 1,8 triệu ha bị thiếu nước.
Nghiên cứu bản chất tính chống chịu của cây trồng cho thấy đây là một tính
trạng đa gen. Vai trò cụ thể của từng gen riêng rẽ liên quan đến tính chống chịu ở
thực vật (ví dụ P5CS, RD22…) đã được nhiều nghiên cứu tìm hiểu và phân tích.
Tuy nhiên, dưới tác động của các yếu tố bất lợi từ ngoại cảnh, không chỉ các gen
riêng rẽ được biểu hiện mà là một hệ thống các gen liên quan được kích hoạt biểu
hiện nhằm đáp ứng với tình trạng bất lợi mà thực vật gặp phải. Một trong số những
yếu tố kích hoạt hoạt động của các gen liên quan đến khả năng chống chịu là các
nhân tố phiên mã (transcription factor – TF).
Họ nhân tố phiên mã NAC (NAC transcription factor) là một trong những họ
TF đặc trưng lớn nhất trong hệ gen thực vật [106]. Nhân tố phiên mã NAC có liên
quan đến nhiều quá trình sinh lý quan trọng trong cơ thể thực vật [99]. Nhiều gen
NAC tham gia vào phản ứng với những áp lực khác nhau từ môi trường trong đó có
hạn [87], [113], [133]… Nhiều tác giả đã nghiên cứu chuyển gen mã hóa nhân tố
phiên mã NAC thành công vào một số loài cây trồng như: cây lúa, lúa mỳ, thuốc
lá, [54], [55], [60], [77], [87], [103], [127], [133]. Trên đối tượng cây lạc, các gen
AhNAC1, AhNAC2, AhNAC3 liên quan đến tính chịu hạn đã được tách dòng thành
công [71], AhNAC2 đã được sử dụng để thiết kế vector mang cấu trúc chịu hạn và
chuyển thành công vào cây Arabidopsis [72].
Lạc là cây nông nghiệp ngắn ngày được trồng phổ biến trên thế giới. Ở nước
ta, cây lạc được trồng trên khắp các miền và phù hợp với nhiều vùng sinh thái khác
nhau. Tuy nhiên, hạn, mặn, lạnh vẫn là yếu tố hạn chế đối với sự sinh trưởng và

2

năng suất của cây trồng trong đó có cây lạc. Cây lạc là cây họ đậu, thuộc nhóm chịu
hạn kém [13]. Một số kỹ thuật chọn tạo giống có khả năng chịu hạn như lai giống
hoặc ứng dụng công nghệ tế bào thực vật đã được áp dụng [11], [13], [14], [15]. Tuy
nhiên, việc sử dụng kỹ thuật chuyển gen nhằm tạo ra những giống lạc có khả năng
chịu khô hạn còn chưa được nghiên cứu nhiều. Từ những lí do trên, chúng tôi đã
tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phân lập và chuyển gen NAC2 liên quan đến tính chịu
hạn ở cây lạc (Arachis hypogaea L.)” nhằm thử nghiệm khả năng chuyển gen chỉ
thị và tiến tới chuyển gen chịu hạn với mục đích tạo ra dòng cây chuyển gen phục
vụ chọn giống chịu hạn ở cây lạc. Ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu nhằm cải tạo
cây lạc và cải thiện về khả năng chống chịu trên đối tượng cây trồng này.
2. Mục tiêu nghiên cứu
(1) Phân lập được gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 từ giống lạc chịu hạn tốt.
(2) Thiết kế được vector chứa cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mã
NAC2. Tạo cây chuyển gen và biểu hiện được protein NAC2 ở cây thuốc lá.
(3) Tạo được dòng cây lạc chuyển gen. Phân tích các dòng cây lạc chuyển gen.
3. Nội dung nghiên cứu
(1) Phân nhóm các giống lạc nghiên cứu theo mức độ chịu hạn thông qua đánh
giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn mô sẹo và cây non.
(2) Phân lập, tách dòng và giải trình tự gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 liên
quan đến tính chịu hạn của cây lạc.
(3) Thiết kế vector chứa cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2, tạo
vi khuẩn A.tumefaciens mang vector tái tổ hợp và chuyển vào cây thuốc lá mô hình.
(4) Xác định sự có mặt của gen chuyển NAC2 trên cây thuốc lá, đánh giá khả
năng chịu hạn của các dòng thuốc lá chuyển gen thông qua sự thay đổi hàm lượng
proline. Phân tích biểu hiện protein tái tổ hợp NAC2 ở cây thuốc lá chuyển gen.
(5) Phát triển hệ thống tái sinh cây ở cây lạc và chuyển gen chỉ thị (GUS) qua mô
sẹo và phôi soma.
(6) Chuyển cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 vào cây lạc, phân

tích các dòng lạc chuyển gen.

3

Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. HẠN VÀ TÁC ĐỘNG CỦA HẠN ĐẾN THỰC VẬT
1.1.1. Tác động của hạn đến thực vật và cây lạc
1.1.1.1. Cây lạc
Cây lạc có nguồn gốc ở vùng Nam Bolivia, Tây bắc Achentina, Nam Mỹ.
Người Bồ Đào Nha đưa cây lạc từ Brazin sang Tây Phi và sau đó đến Tây Nam Ấn
Độ từ thế kỉ XVI. Sau đó được đem trồng ở rất nhiều nước trên thế giới. Ở Việt
Nam, cây lạc được du nhập từ Trung Quốc sang và được trồng vào khoảng thế kỉ
XVII- XVIII [8], [13].
Về mặt phân loại, cây lạc có tên khoa học là Arachis hypogaea (L.) với 2n=40
NST. Theo Krapo Vikas và một số tác giả khác, cây lạc thuộc họ cánh bướm
Fabaceae, thuộc chi Arachis. Loài lạc trồng Archis hypogaea (L.) gồm hai loài phụ:
Loài phụ Hypogaea gồm hai chủng: Hypogaea loại hình Virginia và Bersuta kohter.
Loài phụ Fastigiata gồm hai chủng: Fastigiata loại hình Valencia và Vulgaris harz
loại hình Spanish.
Về hình thái, cây lạc gồm các bộ phận chính là rễ, thân, lá, hoa và quả lạc.
Rễ lạc có rễ cọc và rễ con. Trên rễ lạc có nhiều nốt sần được tạo thành do vi
khuẩn Rhizobium sống cộng sinh, do vậy cây lạc có khả năng cố định nitơ phân tử
trong không khí thành đạm cung cấp cho cây và đất trồng. Những nốt sần này tăng
nhanh về số lượng và kích thước từ khi cây lạc có 6 - 7 lá đến lúc nở hoa. Thân
chính của cây lạc thường chỉ cao khoảng 25cm - 50cm. Lá lạc là loại lá kép hình
lông chim có 4 lá chét mọc đối nhau, hình trái xoan ngược, có 2 lá kèm hình dải
nhọn bao quanh thân. Trên thân chính thường có khoảng 20 lá. Khi cây lạc có 5 - 6
lá trên thân chính thì lạc bắt đầu phân hoá các mầm hoa. Hoa lạc mọc ra từ các mắt

của cành. Mỗi vị trí có thể có từ 3 - 5 hoa, khi cây lạc đã có 8 - 9 lá thì hoa nở. Lạc
là loại cây tự thụ phấn nghiêm ngặt, khi thấy hoa nở là cây đã thụ phấn xong. Hoa
lạc sau khi thụ phấn thì đâm tia xuống đất hình thành quả (thường gọi là củ). Quả
4

lạc có hình trụ thuôn thắt lại ở giữa các hạt vỏ quả cứng có gân mạng. Mỗi quả có 1
- 3 hạt. Hạt hình trứng, có vỏ lụa màu đỏ, vàng, cánh sen hoặc trắng [13].
Theo thời gian sinh trưởng của cây lạc người ta chia làm giống chín sớm (thời
gian sinh trưởng 90 ngày - 125 ngày) và giống chín muộn (140 ngày - 160 ngày).
Cây lạc đòi hỏi khí hậu nóng ẩm, nhiệt độ cho sinh trưởng phát triển của cây lạc từ
24
0
C - 33
0
C. Nhiệt độ để hạt nảy mầm thấp nhất phải trên 12
0
C, từ 15
0
C hạt lạc đã
bắt đầu nảy mầm tốt, dưới 17
0
C hoa không thụ phấn, yêu cầu độ ẩm từ 60% - 70%,
độ ẩm thấp dưới 60% đã kéo dài thời gian nảy mầm và hạt không nảy mầm được ở
độ ẩm đất 40% - 50%. Đất trồng lạc lí tưởng phải là đất thoát nước nhanh, chân đất
nhẹ, thoáng, có màu sáng, tơi xốp, phù sa pha cát có đầy đủ canxi và lượng chất hữu
cơ vừa phải sẽ tạo điều kiện cho lạc nảy mầm, dễ dàng ngoi lên mặt đất và sinh
trưởng, hình thành quả tốt, độ pH của đất từ 6-7 là thích hợp nhất [13].
Cây lạc được coi là cây trồng có hiệu quả kinh tế cao và có giá trị đa dạng về
các mặt dinh dưỡng, chăn nuôi, trồng trọt và trong công nghiệp.
Diện tích trồng lạc tập trung nhiều nhất ở vùng Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh

rồi tới đồng bằng trung du Bắc Bộ (Bắc Giang, Bắc Ninh, Hà Nam, Nam Định,
Ninh Bình). Trên thực tế, diện tích trồng lạc ở nước ta còn nhỏ và phân tán, trừ một
vài vùng lạc tập trung như Diễn Châu (Nghệ An), Hậu Lộc (Thanh Hoá). Gần đây
cây lạc được khuyến khích phát triển mạnh, đặc biệt ở những nơi đất bạc màu, thoái
hoá như vùng trung du và đồng bằng Bắc Bộ, những dải đất ven biển từ Thanh Hoá
chạy dài tới giáp Đông Nam Bộ,… đều có thể trồng được lạc. Nhiều vùng đất nhất
là ở miền Nam có thể trồng được 2 vụ lạc trong năm [13].
1.1.1.2. Tác động của hạn đến thực vật
Hạn là một trong những yếu tố cực đoan phi sinh học được quan tâm đến
nhiều nhất hiện nay. Hiện tượng khô hạn xảy ra khi trong môi trường đất và không
khí thiếu nước đến mức áp suất thẩm thấu của cây không cạnh tranh được để lấy
nước vào tế bào. Trong trường hợp này, tác động của môi trường bên ngoài rất lớn,
gây ảnh hưởng đáng kể lên sự phát triển của thực vật, có thể dẫn đến hủy hoại cây
cối và mất mùa [7], [23], [27], [36]. Các yếu tố bất lợi của môi trường có thể là:
nhiệt độ cao, gió nóng, thời tiết và khí hậu. Khái niệm hạn dùng để chỉ tình trạng
5

mất nước của cây. Khả năng thực vật có thể giảm thiểu mức tổn thương do thiếu hụt
nước gây ra gọi là tính chịu hạn [7].
Xu thế thay đổi của khí hậu làm cho hạn hán bất thường xảy ra ở nhiều nơi,
đây là nguyên nhân chính làm giảm năng suất cây trồng [94]. Theo FAO, ước tính
có 70% tiềm năng về năng suất bị mất đi do điều kiện bất lợi của môi trường và sâu
bệnh hại, ngay cả ở những quốc gia có nền nông nghiệp phát triển. Hiện nay trên
thế giới có khoảng 45% diện tích đất trồng bị hạn hán [45]. Tại Việt Nam, trong
7,3-7,5 triệu ha đất trồng thì có tới 1,5-1,8 triệu ha thiếu nước.
Khi gặp hạn trạng thái của chất nguyên sinh trong tế bào thay đổi mạnh, ảnh
hưởng đến tính chất hoá lý của chất nguyên sinh như tính thấm, mức độ thuỷ hoá
của keo, thay đổi pH, độ nhớt, cuối cùng ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất bình
thường của cơ thể. Hạn ảnh hưởng xấu đến quá trình hình thành diệp lục, phá hoại
lục lạp nên hiệu suất quang hợp giảm xuống nhanh chóng. Hạn ảnh hưởng đến hoạt

động hút khoáng của bộ rễ, dẫn đến tình trạng thiếu những nguyên tố dinh dưỡng
quan trọng trong quá trình trao đổi và tổng hợp các chất hữu cơ khác nhau trong cơ
thể thực vật [28], [36], [45].
Để chống khô hạn, cây có thể giữ không bị mất nước, giảm diện tích lá, rút
ngắn chu kì sống. Bất kỳ sự mất nước nào cũng dẫn đến hiện tượng thiếu hụt nước
trong tế bào. Nước vừa là nguyên liệu, vừa là môi trường để các phản ứng trao đổi
chất xảy ra. Vì vậy, sự vi phạm chế độ nước ảnh hưởng rất lớn đến mọi quá trình
sinh trưởng và phát triển của cây.
Về tác động của hạn đến thực vật, các nhà khoa học tập trung nghiên cứu
theo 2 hướng: khảo sát tính chịu hạn của các đối tượng thực vật trong điều kiện tự
nhiên ngoài đồng ruộng hoặc trong điều kiện nhân tạo tại phòng thí nghiệm.
Nhiều cây trồng như ngô, lúa, đậu tương, lạc…đã được các nhà nghiên cứu
đánh giá, khảo sát về đặc tính chịu hạn thông qua các điều kiện tự nhiên ngoài đồng
ruộng. Một trong những phương pháp được sử dụng là chủ động gây ra sự thiếu
nước và tiến hành nghiên cứu phản ứng của các cơ thể thực vật trong điều kiện này.
[5]. Khi gặp hạn, cây lạc cũng chịu ảnh hưởng nặng nề đến quá trình sinh trưởng và
phát triển. Khi tiến hành nghiên cứu ngoài tự nhiên bằng phương pháp gây hạn nhân
6

tạo, nhận thấy sự thiếu hụt nước ở thời kì ra nụ hoa đã làm giảm diện tích lá, làm
giảm sút cường độ quang hợp của lá, giảm khả năng đậu quả và khối lượng quả
chắc, giảm hàm lượng lipit trong hạt lạc [8]. Những quan sát cho thấy, trong điều
kiện thí nghiệm gây thiếu nước ở thời kì ra hoa đã làm giảm nghiêm trọng số hoa,
đợt rộ không hình thành được, thời gian ra hoa kéo dài, tỉ lệ hoa có ích giảm đi do
quá trình thụ phấn bị cản trở [13].
Trong điều kiện nhân tạo, nhiều nghiên cứu tiến hành đánh giá tác động của
hạn ở một số giai đoạn phát triển của các đối tượng thực vật khác nhau như mô sẹo,
hạt nảy mầm, cây non 3 lá…Trên thế giới và Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu
nhằm đánh giá tác động của hạn và nâng cao tính chịu hạn ở cây trồng ở mức độ in
vitro như ngô [42], lạc [11], [14], lúa [2], khoai tây [67],…

Nhiều nghiên cứu đã sử dụng PEG, sorbitol, manitol… như những tác nhân
gây khô hạn trong môi trường nuôi cấy nhằm nghiên cứu tác động của hạn lên thực
vật. PEG là một hợp chất có ái lực rất lớn với nước, khi đưa vào môi trường nuôi
cấy nó không chỉ ngăn cản rễ hút nước mà còn chiếm nước từ rễ cây, khiến cây
nhanh chóng rơi vào tình trạng sốc hạn [67].
Như vậy có thể thấy, mức độ ảnh hướng của các yếu tố cức đoan trong đó có
hạn đến khả năng phản ứng của cây trồng là rất rõ rệt. Hiện tượng mất nước cục bộ
chỉ gây thiệt hại cho một nhóm nhỏ, nhưng hạn hán kéo dài sẽ gây thiệt hại cho
nhiều loại cây trồng, ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng. Các loài thực vật khác
nhau sẽ có khả năng chống chịu khác nhau với các yếu tố cực đoan phụ thuộc vào
bản chất di truyền từ bao thế hệ của chúng. Vì vậy, có cây có thể chống chịu được
và tồn tại, có cây sẽ bị chết. Ngay trong cùng một loài, các cá thể khác nhau cũng
phản ứng ở các mức độ không hoàn toàn như nhau [7].
1.1.1.3. Tác động của hạn đến cây lạc
Cây lạc được trồng trên 35,5 triệu ha ở 82 quốc gia trên thế giới. Hơn một
nửa số khu vực sản xuất, chiếm 70% diện tích trồng lạc thuộc vùng khô hạn và bán
khô hạn, ở những nơi này cây lạc thường xuyên chịu áp lực hạn hán với thời gian và
cường độ khác nhau [50], [79], [92], [104]. Dự kiến giá trị tổn thất hàng năm trong
sản xuất lạc tương đương với hơn 520 triệu USD gây ra bởi hạn [39], [40]. Tại Hoa
7

Kỳ, cây lạc đóng góp hơn 4 tỷ USD cho nền kinh tế của đất nước mỗi năm. Tại đây,
phần lớn cây lạc được trồng dưới điều kiện nước trời và chỉ có một diện tích hạn
chế được tưới tiêu [39]. Ở châu Á và châu Phi, cây lạc được trồng trong điều kiện
nước trời trong mùa mưa và bị hạn hán liên tục do lượng mưa ít có thể xảy ra tại bất
kỳ thời điểm nào trong chu kỳ sống của cây trồng. [40]. Ở Việt Nam, sản xuất lạc
được phân bố ở tất cả các vùng sinh thái nông nghiệp, với khoảng 40% tổng diện
tích các cây công nghiệp ngắn ngày [13].
Ảnh hưởng của hạn với cây lạc được thể hiện theo nhiều cách, ảnh hưởng
đến cả số lượng và chất lượng của cây trồng. Thâm hụt nước, tùy thuộc vào thời

gian xảy ra, có thể là nguyên nhân gây ra hiện tượng giảm đáng kể năng suất lạc
bằng cách tác động lên các quá trình sinh lý như cố định đạm, quang hợp, và sự hấp
thu canxi cho phát triển vỏ quả [50], [79]. Khi cây lạc gặp hạn sẽ làm mất độ ẩm từ
quả dẫn đến làm giảm hoạt động sinh lý của hạt, bên cạnh đó ảnh hưởng của hạn
hán còn làm thay đổi chất lượng dinh dưỡng của protein trong hạt lạc [39]. Hạn làm
ảnh hưởng đến lipid màng tế bào, các phản ứng quang hợp [92], quá trình trao đổi
chất, tăng trưởng và năng suất của cây lạc [39]. Thiếu hụt về độ ẩm làm cản trở quá
trình hình thành nốt sần ở các cây họ đậu. Có nhiều bằng chứng cho thấy, quá trình
hấp thụ N, P và K của cây lạc bị giảm do hạn hán [39].
Hạn đã ảnh hưởng xấu đến các mối quan hệ về nước, quang hợp, dinh dưỡng
khoáng, sự trao đổi chất và tăng trưởng ở lạc. Hạn hán căng thẳng nghiêm trọng làm
giảm hàm lượng chất diệp lục a, b và diệp lục tổng số. Sự sụt giảm chất diệp lục là
do sự ức chế tổng hợp chất diệp lục. Tích lũy hàm lượng chất khô bị giảm khi tình
trạng thiếu nước kéo dài [39], [40], [92]. Căng thẳng về nước thường xuyên dẫn đến
thay đổi về giải phẫu học như giảm kích thước của các tế bào và các khoảng gian
bào, vách tế bào dày hơn và phát triển hơn của mô biểu bì, giảm kích thước lá và
thay đổi trong hệ rễ [40], [92].
Sự thoát ra của các chất hòa tan là kết quả của hiện tượng tổn thương màng
tế bào. Đây là một phản ứng thông thường của mô cây lạc dưới ảnh hưởng của một
số điều kiện bất lợi từ môi trường như nhiệt độ thấp hoặc cao, độ ẩm của đất thấp
hoặc độ mặn của đất cao. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng canxi là yếu tố cần thiết
8

để duy trì tính toàn vẹn của màng. Quá trình bổ sung canxi có ảnh hưởng thuận lợi
đến mối quan hệ về nước của cây trồng và khả năng chịu khô hạn trong cây lạc
[39], [92]. Thiếu nước trong đất ở giai đoạn hình thành vỏ quả có thể làm giảm sự
hấp thu canxi cho phát triển vỏ và gây ra hiện tượng vỏ không dày, hàm lượng canxi
thấp trong vỏ và hạt. Dấu hiệu điển hình của sự thiếu hụt canxi trong hạt bao gồm
tim rỗng, hư hỏng phôi hoặc phát triển chồi mầm.
Hầu như tất cả các quá trình trao đổi chất đều bị ảnh hưởng bởi sự thiếu

nước. Hoạt động của các enzyme bị suy giảm do hiện tượng thiếu hụt nước nghiêm
trọng gây ra. Phức hệ carbohydrate và protein bị phá hủy bởi các enzyme thành các
loại đường đơn giản và các amino acid tương ứng. Proline, một amino acid, được
tích lũy mỗi khi thực vật gặp điều kiện bất lợi về độ ẩm. Hàm lượng proline được
tích lũy nhiều hơn sau khi cây trồng gặp hạn, do đó hàm lượng này được coi là một
chỉ số tốt khi nghiên cứu về cây trồng chịu hạn [39], [40].
Tốc độ tăng trưởng của rễ lạc bị ảnh hưởng bởi độ ẩm của đất. Thiếu hụt về
nước kích thích sự tăng trưởng của rễ vào trong đất sâu hơn. Nghiên cứu đã chỉ ra
rằng, rễ lạc chiết xuất nước trong đất có hiệu quả ở độ sâu ít nhất là 180 cm trong
đất cát mịn. Tất cả những đặc điểm này góp phần làm tăng khả năng tránh bị khô
hạn của cây lạc [92].
ng ca hn n phát trin ca cây lc
a) Thời kì trước ra hoa
Trong mỗi thời kì sinh trưởng cây lạc chỉ có khả năng chịu hạn ở một
mức độ nhất định [31]. Biểu hiện bề ngoài khi cây lạc bị hạn ở tất cả các thời kì sinh
trưởng rõ rệt nhất là ở bộ lá. Khi độ ẩm đất giảm, lá lạc nhỏ và dày hơn, màu lá từ
xanh đậm chuyển dần sang xanh nhạt do diệp lục bị phá huỷ. Ở thời kì trước ra hoa,
nhu cầu về nước không cao lắm. Cây lạc chịu được hạn nhất vào thời kì trước ra
hoa, bị hạn trong thời gian ngắn ở thời kì này chỉ làm chậm sự phát triển và tốc độ
sinh trưởng dễ được khôi phục trở lại nếu được tưới đủ ẩm [13], [62], [79].
b) Trong quá trình ra hoa
Những quan sát cho thấy, thời gian bắt đầu ra hoa của cây lạc không bị trì
hoãn bởi khô hạn [39]. Tuy nhiên thiếu nước trong thời kì ra hoa làm giảm nghiêm
9

trọng số hoa, đợt rộ không hình thành được, thời gian ra hoa kéo dài, tỉ lệ hoa có ích
giảm đi do quá trình thụ phấn bị cản trở. Vì vậy, hạn ở thời kì ra hoa có thể kéo dài
thời gian ra hoa – chín của lạc , gây ảnh hưởng đáng kể tới năng suất của lạc [13],
[39]. Sự thiếu hụt nước ở thời kì ra nụ hoa đã làm giảm diện tích lá, làm giảm sút
cường độ quang hợp của lá, giảm khả năng đậu quả và khối lượng quả chắc, giảm

hàm lượng lipit trong hạt lạc [8].
c) Quá trình hình thành quả
Cây lạc có thể gặp điều kiện bất lợi về nước trong suốt quá trình đâm tia và
phát triển quả [79]. Điều này sẽ dẫn đến làm giảm rõ rệt về năng suất, mức độ giảm
phụ thuộc vào từng giống lạc. Không chỉ năng suất lạc mà chất lượng của hạt cũng
bị giảm dưới điều kiện hạn hán. Tia không có khả năng thâm nhập hiệu quả vào
trong đất khô. Quá trình đâm tia và vùng rễ trong khu vực đất thiếu nước làm giảm
tốc độ tăng trưởng của quả và hạt giống xấp xỉ 30% và giảm trọng lượng cho mỗi
hạt từ 563 đến 428 mg [39]. Hạn trong giai đoạn hình thành quả và hạt làm giảm
năng suất 56-85% [84], [104]. Trong giai đoạn hình thành quả, do diện tích lá đạt
cao nhất, tốc độ chất khô tích luỹ cũng cao nên cần lượng nước lớn nhất so với các
giai đoạn khác trong thời kì sinh trưởng. Độ ẩm đất có thể giảm đi trong thời kì quả
chín (65% - 70%). Độ ẩm quá cao trong thời kì này (trên 90%) thường dẫn đến lốp
đổ và dễ làm quả bị thối, nảy mầm [7], [79].
1.1.2. Cơ chế chịu hạn của thực vật
Sự chống chịu hoặc mẫn cảm đối với các yếu tố cực đoan phụ thuộc vào đặc
tính của loài, kiểu gen, các giai đoạn phát triển của thực vật. Tính chống chịu là khả
năng của thực vật có thể ngăn ngừa được thương tổn khi bị tác động bất lợi từ ngoại
cảnh. Hạn tác động lên cây theo hai hướng chính, làm tăng nhiệt độ cơ thể của cây
và gây mất nước trong cây. Tính chịu hạn là khả năng của cây chịu đựng sự đốt
nóng và khô [7].
Cơ chế chịu hạn của thực vật rất phức tạp, không chỉ liên quan đến đặc
điểm hình thái giải phẫu mà còn liên quan đến những thay đổi thành phần hoá sinh
trong tế bào, sự điều chỉnh hoạt động của gen liên quan đến tính chịu hạn của thực
vật. Những thực vật tồn tại trên môi trường thiếu nước làm cho chúng bị mất cân
10

bằng về thẩm thấu và các cơ chế bảo vệ của thực vật được khởi động để phản ứng
với tình trạng thiếu nước cực đoan [45].
1.1.2.1. Cơ chế biến đổi hình thái của đặc tính chịu hạn

Khả năng chịu hạn của thực vật liên quan đến việc thay đổi toàn bộ cơ thể,
mức độ mô, mức độ sinh lý và phân tử. Biểu hiện của một hoặc sự kết hợp của
những thay đổi này xác định khả năng cơ thể thực vật duy trì được sự sống dưới
điều kiện độ ẩm giới hạn. Những cơ chế bảo vệ của thực vật đã được nhiều nhà
nghiên cứu tìm hiểu và phân tích, trong đó cơ chế biến đổi về mặt hình thái trong
điều kiện hạn đã được đề cập đến và giải thích [45].
Thực vật có thể phát triển nhanh về mặt hình thái và thúc đẩy quá trình hình
thành hạt (cơ chế thoát hạn). Cơ chế này được thể hiện ở việc trưởng thành và ra
hoa sớm, thay đổi thời gian sinh trưởng cho phù hợp với giai đoạn thiếu nước. Phát
triển những giống có thời gian sinh trưởng ngắn là một chiến lược có hiệu quả cho
việc giảm thiểu tổn thất về năng suất cây trồng dưới tác động của hạn, giúp cây
trồng tránh được những điều kiện bất lợi của môi trường [45], [75].
Các cơ chế làm giảm sự mất nước từ thực vật như kiểm soát sự thoát hơi
nước của khí khổng, hoặc duy trì sự hấp thu nước thông qua một hệ thống rễ tốt (cơ
chế tránh hạn) [75], [104]. Sinh khối, mật độ, chiều dài và chiều sâu của rễ là các
đặc điểm chính giúp cho việc tránh hạn và ảnh hưởng đến năng suất cây trồng dưới
tác động thiếu nước của môi trường [45], [75], [121, [104].
Có hai cơ chế của cây trồng để làm giảm lượng nước mất đi đó là sự thay đổi
độ mở của khí khổng và làm giảm lượng bức xạ hấp thụ. Khi cây gặp hạn khí khổng
đóng lại, ngăn chặn sự thoát hơi nước ra ngoài. Khi mất nước nhiều, khí khổng
không còn khả năng đóng, nước ồ ạt thoát ra ngoài dẫn đến cây héo và chết. Để duy
trì cân bằng nước nội bộ có hiệu quả, khí khổng phải đóng chặt và sự mất nước qua
tầng biểu bì phải nhỏ [45], [75]. Cơ chế làm giảm lượng nước mất đi bằng cách
giảm lượng bức xạ hấp thụ đạt được nhờ hoạt động của lá hoặc sự thay đổi đặc điểm
phản xạ của lá. Sự cuộn lá là chuyển động thụ động cũng có tác động làm giảm sự
bức xạ. Giảm diện tích bề mặt thoát hơi nước để làm giảm lượng nước mất đi. Các
cây trồng chịu hạn thường có số nhánh và số lá ít, diện tích lá giảm. Sự giảm sinh
11

trưởng của lá khi thiếu nước làm giảm nhu cầu nước. Giảm diện tích lá được coi là

một yếu tố quan trọng trong khả năng chịu hạn của cây trồng [45].
Trên phương diện hình thái thì chồi và rễ bị tác động nhiều nhất bởi tình
trạng thiếu nước. Đây đều là những bộ phận quan trọng của thực vật trong sự thích
nghi với hạn hán. Trạng thái lá có lông là một đặc điểm chịu khô hạn giúp bảo vệ lá
khi nhiệt độ quá cao. Lông lá làm giảm nhiệt độ và thoát hơi nước. Hình thành lớp
cutin và sáp trên bề mặt cũng là một trong những phương pháp hiệu quả về mặt kiểu
hình nhằm chống mất nước [45].
Như vậy, thực vật có thể thoát khỏi hạn hán bằng cách rút ngắn thời gian
sinh trưởng, và tránh hạn với việc duy trì tiềm năng nước trong mô bằng cách giảm
sự mất nước, tăng cường sự hấp thu nước, hoặc cả hai. Một số thực vật có thể làm
giảm diện tích bề mặt của họ bằng cách rụng lá hoặc tạo lá nhỏ.
1.1.2.2. Cơ chế sinh lý, hóa sinh của đặc tính chịu hạn
Điều chỉnh áp suất thẩm thấu (ASTT), bảo vệ thẩm thấu, các chất chống oxy
hóa có vai trò vô cùng quan trọng hình thành nên một hệ thống bảo vệ có ảnh hưởng
đến khả năng chịu hạn của thực vật [45], [73].
Cơ chế hóa sinh có tác dụng bảo vệ tế bào trong điều kiện mất nước là: khử
độc các sản phẩm trung gian trong quá trình phân giải các hợp chất cao phân tử, xúc
tiến sự phục hồi các cấu trúc sinh học bị hư hại. Sau khi hạn ngừng tác động, quá
trình phục hồi diễn ra nhanh nếu bộ gen được bảo tồn khỏi hư hại trong thời gian
khô hạn. Điều đó có được là do các protein trong nhân với sự tham gia của các
protein đáp ứng với stress đặc hiệu, nhờ vậy mà DNA chỉ bị biến đổi khi hạn nặng
kéo dài. Khi gặp hạn, trong tế bào xuất hiện nhiều H
2
O
2
gây độc cho tế bào và cho
cây, vì vậy trong cây có hiện tượng tăng hoạt tính các enzyme oxydoreductase để
giải độc. Đây cũng là một cơ chế để bảo vệ ti thể khỏi bị tổn thương.
Có rất nhiều hợp chất liên quan đến tính chịu hạn của thực vật, một số chất
được quan tâm nghiên cứu trong việc đáp ứng với hạn của cây trồng như các

phytohormon, amino acid, đường, polyamine, sắc tố và carotenoid… [45].
a) Bo v c trong t bào và mô
Cải thiện tình trạng nước trong mô có thể đạt được thông qua sự điều chỉnh
12

thẩm thấu hoặc thay đổi tính linh hoạt của tế bào. Điều này là cần thiết để duy trì
hoạt động sinh lý trong thời gian hạn hán kéo dài. Thay đổi tính linh hoạt của tế bào
có thể thông qua biến đổi thành tế bào. Như vậy, có thể ngăn cản nước đi từ trong tế
bào ra ngoài nhờ biến đổi cấu trúc thành tế bào, thu hẹp kênh trao đổi nước [45].
Các cơ chế khác nhau như điều chỉnh ASTT, hình thành abscisic acid… có
thể chống chịu đối với tác động của hạn bằng cách duy trì tiềm năng nước trong mô
cao. Với sự tích tụ các chất hòa tan, khả năng thẩm thấu của tế bào được tăng lên,
thu hút nước vào trong tế bào và giúp bảo vệ sức trương. Điều chỉnh ASTT giúp
duy trì sự cân bằng về nước trong tế bào cùng với sự tích lũy các chất hòa tan trong
tế bào chất, do đó giảm thiểu những tác hại của hạn hán [45], [75], [109].
b) Các cht chng oxy hóa
Hệ thống bảo vệ chống oxy hóa trong tế bào thực vật bao gồm cả các thành
phần thuộc enzyme và phi enzyme. Các thành phần có bản chất enzyme bao gồm
superoxide dismutase, catalase, peroxidase, ascorbate peroxidase và glutathione
reductase. Các yếu tố phi enzyme có cystein, glutathione khử và ascorbic acid [45].
Trong điều kiện môi trường bất lợi, như hạn, hoạt động của các enzyme chống oxy
hóa diễn ra mạnh và hàm lượng của các yếu tố phi enzyme rất quan trọng.
Enzyme chống oxy hóa là một trong những cơ chế hiệu quả chống lại stress
oxy hóa. Sự phiên mã của một số gen mã hóa cho enzyme chống oxy hóa như
glutathione reductase hoặc ascorbate peroxidase diễn ra mạnh trong suốt quá trình
phục hồi từ thời điểm thiếu nước, điều này đóng một vai trò quan trọng trong việc
bảo vệ các bộ phận của tế bào khỏi bị hư hại bởi các phản ứng oxy hóa. Thiệt hại do
oxy hóa trong các mô thực vật được giảm bớt bởi sự phối hợp hoạt động của một hệ
thống các chất chống oxy hóa có bản chất phi enzyme. Chúng bao gồm β-carotene,
acid ascorbic, α-tocopherol, glutathione khử [45]. Sự hình thành carotenes như một

phần quan trọng của hệ thống bảo vệ chống oxy hóa ở thực vật [119]. β-carotene
trong lục lạp của tất cả các cây xanh liên quan chặt chẽ với hệ thống trung tâm
quang hệ I và quang hệ II. Ở đây, β-carotene, ngoài chức năng như một sắc tố còn
hoạt động như một chất chống oxy hóa hiệu quả và đóng một vai trò duy nhất trong
việc bảo vệ chu trình quang hóa [45].
13

c)  m
Màng sinh học là mục tiêu tác động đầu tiên của nhiều nhân tố phi sinh học
bất lợi. Việc duy trì tính toàn vẹn và sự ổn định của màng dưới điều kiện thiếu nước
là một cơ chế chính trong khả năng chịu hạn ở thực vật. Khả năng chịu hạn được
xem như tăng sự ổn định màng tế bào trong điều kiện thiếu nước [45].
Các nguyên nhân của sự phá vỡ màng chưa được biết, tuy nhiên, giảm bớt về
thể tích tế bào gây ra hiện tượng tăng độ nhớt của các thành phần tế bào chất. Điều
này làm tăng khả năng tương tác phân tử dẫn đến có thể gây ra biến tính protein.
Một loạt các hợp chất được xác định có thể ngăn chặn các phân tử tương tác bất lợi
trong điều kiện hạn. Có thể kể đến là proline, glutamate, glycinebetaine, sorbitol,
fructans, sucrose và oligosaccharides. Khả năng thoát ion ra khỏi tế bào có thể là do
hiện tượng ức chế bởi nhiệt của các enzyme chịu trách nhiệm giới hạn màng để duy
trì gradient hóa học trong tế bào [75].
d) hòa 
Điều hòa sự phát triển của thực vật liên quan đến các phytohormon được sản
xuất trong tế bào. Những chất có ảnh hưởng đến các quá trình sinh lý trong cơ thể
thực vật như auxin, gibberellins, cytokinin, ethylene và abscisic acid. Dưới điều
kiện khô hạn, các auxin nội sinh, gibberellins và cytokinin thường giảm, trong khi
đó abscisic acid và ethylene lại tăng [109].
ABA là một chất ức chế sự tăng trưởng và được sản xuất dưới tác động của
nhiều nhân tố bất lợi từ môi trường, trong đó có hạn. Hàm lượng ABA tăng kéo
theo sự đóng lỗ khí làm giảm cường độ thoát hơi nước, ABA xúc tiến quá trình
tổng hợp protein và amino acid có tác dụng tăng khả năng giữ nước của tế bào trong

điều kiện khô hạn. Tất cả thực vật đáp ứng với hạn và nhiều nhân tố bất lợi khác
bằng cách tích lũy ABA. ABA thường gặp trong tất cả thực vật có hoa và được
công nhận là một loại hoocmon điều chỉnh biểu hiện gen và hoạt động như một tín
hiệu cho sự khởi đầu của các qúa trình liên quan đến thích ứng với hạn và và các
yếu tố bất lợi khác từ môi trường [45]. Tăng nồng độ ABA dẫn đến nhiều thay đổi
trong quá trình phát triển, sinh lý và tăng trưởng. ABA làm thay đổi tốc độ tăng
trưởng tương đối của các bộ phận khác nhau trong thực vật như ức chế phát triển
14

diện tích lá, phát sinh rễ nhiều và sâu. ABA gây ra sự xuất hiện của một loạt các sự
kiện phức tạp dẫn đến việc đóng cửa khí khổng, vốn là một yếu tố phản ứng bảo tồn
nước. Do hiệu quả trong việc khí khổng đóng, ABA có thể kiểm soát tốc độ thoát
hơi nước, đến mức độ nào đó, có thể tham gia vào cơ chế chịu hạn ở thực vật [130].
Ethylene từ lâu đã được coi là một hormone ức chế sự tăng trưởng [109].
Ethylene có thể đáp ứng điều hòa hiệu suất lá trong suốt vòng đời của nó cũng như
xác định sự khởi đầu của quá trình lão hóa tự nhiên và sự lão hóa gây ra qua trung
gian hạn hán. Nhiều nghiên cứu gần đây cho rằng, cơ thể thực vật có thể tối ưu hóa
quá trình tăng trưởng và chống chịu stress phi sinh học như hạn hán. Phản ứng này
có liên quan đến quá trình tổng hợp ethylene [86].
Polyamine là cation có thể kết hợp với các thành phần anion của màng tế
bào, chẳng hạn như phospholipid, do đó bảo vệ màng kép lipid khỏi bị hư hỏng
dưới tác động của các yếu tố bất lợi. Sự quan tâm trong các nghiên cứu ngày càng
tăng về sự tham gia của polyamine trong phản ứng bảo vệ cơ thể thực vật chống lại
các yếu tố bất lợi từ môi trường [45]. Nhiều gen mã hóa cho các enzyme tham gia
vào quá trình trao đổi chất polyamine được tách dòng từ một số loài, và biểu hiện
của chúng dưới một số điều kiện bất lợi đã được phân tích [129].
e) C
Một trong những khả năng chống chịu các yếu tố bất lợi phổ biến nhất trong
thực vật là sản xuất lượng lớn các loại chất hữu cơ hoà tan khác nhau. Chúng bảo vệ
cơ thể thực vật khi gặp các yếu tố bất lợi thông qua các biện pháp như điều chỉnh

thẩm thấu, khử độc bởi các phản ứng oxy hóa, ổn định màng tế bào và cấu trúc tự
nhiên của enzyme, protein. Điều chỉnh thẩm thấu là một cơ chế để duy trì mối quan
hệ về nước dưới sự bất lợi về thẩm thấu. Nó liên quan đến sự tích tụ của một loạt
các phân tử/ion, bao gồm đường tan, proline, glycinebetaine, axit hữu cơ, canxi,
kali, ion clo…[7]
Quá trình điều chỉnh thẩm thấu được thực hiện với sự tích lũy các chất hòa
tan. Trong số này, proline là một trong những chất quan trọng nhất và sự tích lũy
proline tự do là một đáp ứng phổ biến của thực vật bậc cao, tảo, động vật và vi
khuẩn khi tiềm năng nước thấp [119]. Vai trò sinh lý của proline tự do bao gồm bảo
15

vệ các cấu trúc nội bào và các đại phân tử khi tế bào gặp các điều kiện bất lợi về
ASTT, bảo vệ các cấu trúc protein và nâng cao hoạt tính của nhiều loại enzyme
khác nhau, chống oxy hóa với chức năng phân cắt các gốc oxy phản ứng và bất hoạt
các gốc oxy tự do [108].
Glycinebetaine (N, N, N-trimethyl glycine) là một trong những hợp chất hoà
tan được nghiên cứu nhiều trong thực vật, động vật và vi khuẩn [119]. Nhiều nghiên
cứu chứng minh rằng, glycinebetaine đóng một vai trò quan trọng trong việc tăng
cường khả năng chống chịu của thực vật dưới tác động của các yếu tố bất lợi phi
sinh học trong đó có hạn hán [90].
Trehalose được biết đến là một disaccharide không có tính khử của glucose,
đóng vai trò quan trọng trong bảo vệ và nâng cao sức đề kháng của cơ thể chống lại
những yếu tố bất lợi của môi trường. Trong tự nhiên, trehalose được sinh tổng hợp
như một cơ chế đáp ứng với các yếu tố bất lợi của nhiều cơ thể sinh vật, bao gồm vi
khuẩn, nấm, tảo, côn trùng, động vật không xương sống và thực vật bậc thấp [121].
Khả năng sản xuất trehalose, trước đây được cho là không có ở thực vật bậc cao,
hiện nay đã có nghiên cứu cho thấy chúng được tích lũy với số lượng lớn ở một số
cây dương xỉ chịu hạn và thực vật hạt kín chịu khô hạn Myrothamnus flabellifolia
[45]. Sự có mặt với hàm lượng thấp của trehalose đã được chứng minh cả trong
thuốc lá và nhiều thực vật bậc cao [66]. Vai trò sinh lý của trehalose bao gồm ổn

định hiệu suất của các enzyme khử nước, protein và màng lipid, cũng như bảo vệ
các cấu trúc sinh học dưới tác động của khô hạn [121].
f) Protein 
Một số hormon hoặc chất kích thích (ví dụ như ABA) sẽ giúp cho cây hoạt hóa
một loạt các quá trình sinh tổng hợp các protein và các chất khác ngăn ngừa tác
động bất lợi và cây có thể thích ứng với điều kiện này. Dựa vào khả năng chống
chịu, tính chất và mức độ phản ứng khác nhau của từng loài, người ta có thể chia
các protein được sinh ra trong quá trình đó làm 2 loại, các protein có chức năng
chống chịu và các protein có chức năng điều khiển sự biểu hiện gen và có thể có
chức năng trong việc phản ứng đối với tình trạng stress [7].
Tùy trong từng điều kiện môi trường bất lợi khác nhau, thực vật sản sinh ra
16

những loại protein có chức năng chống chịu khác nhau. Ví dụ đối với khô hạn, có
thể biểu hiện những loại protein như: môi giới phân tử (MGPT)- molecular
chaperone, LEA protein, protein kênh chuyển nước qua màng - aquaporin, proline,
transporters, các enzyme loại độc tố (detoxification enzymes), protein chống đông
lạnh (antifreeze proteins), protein gắn với mRNA (mRNA binding protein), enzyme
chủ chốt trong sinh tổng hợp các chất điều hoà áp suất thẩm thấu và các loại
protease khác nhau (hình 1.1) [101].

Hình 1.1. Chức năng của các gen cảm ứng với điều kiện khô hạn [101]
Để biểu hiện bất kỳ gen nào cũng đều cần có sự hoạt hóa promoter của chúng.
Hệ thống tín hiệu nhận biết từng loại stress khác nhau, bao gồm nhiều chất cảm ứng
có nguồn gốc protein hoặc là các chất khác. Đó là các yếu tố điều hòa phiên mã như
MYB, MYC, NAC, DREB, protein kinase như MAP kinase Các protein có chức
năng điều khiển sự biểu hiện gen và có thể có chức năng trong việc phản ứng đối
với tình trạng hạn như protein kinase, TF và các enzyme trong chuyển hoá
phospholipid.
Protein chức năng như aquaporins có khả năng tạo điều kiện thuận lợi và

điều chỉnh trao đổi nước thụ động qua màng. Chúng là thành viên thuộc một họ
17

protein bảo thủ cao trong màng tế bào. Ở thực vật, aquaporins có mặt nhiều trong
màng sinh chất và trong màng không bào. Phân tích cấu trúc của aquaporins đã cho
thấy cơ chế chung của protein vận chuyển nước qua màng. Aquaporins có thể điều
chỉnh tính thấm của màng tế bào theo cả hai hướng phụ thuộc vào ASTT [7].
Aquaporins giữ một vai trò đặc biệt trong việc kiểm soát vận chuyển nước qua
màng.
Protein sốc nhiệt (HSP – heat shock protein) có chức năng môi giới phân tử
được gọi là chaperone. Chúng có một vai trò quan trọng việc tái tạo lại cấu trúc
không gian đúng của protein mới tổng hợp, duy trì cấu trúc đặc hiệu của protein,
ngăn chặn sự hủy hoại của protein chưa tạo cấu trúc đúng, khởi đầu cho sự phân
giải protein bị biến tính. Protein sốc nhiệt có trọng lượng phân tử thấp thường được
sản xuất để đáp ứng với các yếu tố bất lợi của môi trường [7], [119]. HSP chiếm
trên 1% protein tổng số trong lá, rất đa dạng và có ở hầu hết các loài thực vật.
Chúng không những xuất hiện khi gặp nóng đột ngột mà còn luôn có mặt trong quá
trình sinh trưởng bình thường, các giai đoạn biệt hóa của mô, thời kỳ sinh sản, cũng
như được tổng hợp ở điều kiện cực đoan khác của môi trường trong đó có hạn [7].
Protein ổn định màng tế bào và protein biểu hiện trong giai đoạn cuối của
quá trình hình thành phôi (LEA) là những nhóm protein khác chịu trách nhiệm quan
trọng trong việc đáp ứng với khả năng chịu hạn. Thuộc về nhóm protein này có thể
kể đến dehydrins. Chúng đóng vai trò quan trọng trong việc cô lập ion được tập
trung trong quá trình mất nước của tế bào. Những protein này giúp bảo vệ protein
khỏi sự suy giảm và proteinases, có chức năng loại bỏ protein hư hỏng và biến tính.
Dehydrins thuộc nhóm protein LEA, được tích lũy để đáp ứng với sự mất nước và
nhiệt độ thấp. Trong cấu trúc của các protein này có vùng bảo thủ cao giàu Lysine
được dự đoán tham gia vào tương tác kỵ nước, dẫn đến làm ổn định cấu trúc của các
đại phân tử [107].
Nhiều protein biểu hiện nhằm đáp ứng với khô hạn trong đó có protein

thuộc nhóm LEA đã được Ramesh và đtg (2007) nghiên cứu. Các tác giả đã chứng
minh được sự liên quan về chức năng của các protein này với việc phát triển các
giống lạc có khả năng chịu hạn. Trong nghiên cứu, một số protein liên quan đến sự
18

bất lợi về nước trong kiểu gen cây lạc đã được xác định, đánh giá vai trò của các
protein này trong cây lạc để thích nghi với khí hậu và thích ứng với hạn hán [91].
1.1.2.3. Cơ chế phân tử của đặc tính chịu hạn
Thực vật phản ứng và thích ứng, sống sót dưới tác động của sự khô hạn bằng
cách đáp ứng khác nhau về mặt hình thái, sinh lý, hóa sinh và phân tử. Khả năng
chịu hạn được xem như thực vật có khả năng phát triển, ra hoa và cho năng suất
kinh tế dưới điều kiện không được cung cấp nước tối ưu [45]. Hạn hán làm ảnh
hưởng đến các mối quan hệ về nước của thực vật ở mức độ tế bào, mô và cơ quan,
gây ra những phản ứng đặc hiệu cũng như không đặc hiệu, phản ứng thích ứng hoặc
gây thiệt hại [23], [28].
Biểu hiện gen có thể được kích hoạt trực tiếp dưới tác động của các yếu tố bất
lợi hoặc là kết quả của các đáp ứng thứ cấp khi bị thương tổn. Tuy nhiên khả năng
chống chịu hạn là một hiện tượng phức tạp liên quan đến hoạt động của nhiều gen
[7]. Khi gặp hạn, một loạt các cơ chế bảo vệ được khởi động thông qua việc tiếp
nhận các tín hiệu được cơ thể thực vật nhận biết. Khi đó, những thay đổi trong biểu
hiện gen (điều chỉnh lên và xuống) sẽ diễn ra. Những gen khác nhau được cảm ứng
để đối phó với hạn hán ở mức độ phiên mã, các sản phẩm của gen được cho là có
chức năng trong chống chịu hạn [101].
Có hai xu hướng tìm kiếm các gen liên quan đến tính chống chịu của cây trồng
đối với điều kiện sinh thái phi sinh học bất lợi. Xu hướng thứ nhất là tìm những gen
liên quan trực tiếp đến khả năng chống chịu hạn, lạnh, ngập úng hay phèn
mặn…(Ví dụ RD29A), xu hướng thứ hai tập trung tìm hiểu về gen chống chịu theo
hướng các yếu tố điều khiển như các nhân tố phiên mã [1].
Các yếu tố cực đoan của môi trường trong đó có hạn tác động lên các nhân tố
phiên mã (ví dụ CBF1 – hình 1.2), tiếp theo, nhân tố phiên mã hoạt hóa khả năng

phát hiện và gắn với DNA nhờ các yếu tố cis phản ứng với sự mất nước (DRE –
drought responsive element) trên promoter của gen đích (ví dụ RD29A – hình 1.2)
tạo thành đường dẫn truyền tín hiệu phức tạp: từ sự nhận biết, cảm ứng với điều
kiện môi trường đến việc hoạt hóa các nhân tố phiên mã và tham gia vào quá trình
điều hòa biểu hiện gen đích ở giai đoạn phiên mã. Trong quá trình này, có thể đồng
19

thời tham gia nhiều gen, tổng hợp cùng một lúc nhiều loại protein điều hòa phiên
mã cũng như protein liên quan đến tính chống chịu.

Hình 1.2. Mô hình hoạt động của gen liên quan đến khả năng chống chịu hạn [76]
Việc tìm kiếm gen liên quan đến khả năng chịu hạn theo xu hướng thứ nhất
được nhiều phòng thí nghiệm chú ý trên nhiều đối tượng khác nhau. Ví dụ như ở Cỏ
Ba lá, lúa mỳ, lúa mạch, ngô, Arabidopsis, lúa nước, đậu tương, lạc…Hai nhóm gen
được mô tả nhiều và chi tiết là nhóm LEA của cây lúa mạch và nhóm RAB của cây
lúa nước. Nhóm thứ nhất mã hóa những protein xuất hiện vào thời kỳ muộn của quá
trình hình thành phôi sau khi thụ phấn và đó là những protein góp phần bảo vệ phôi
trong quá trình ngủ và chịu hạn của phôi trong hạt khô. Nhóm thứ hai liên quan đến
tác động ức chế sinh trưởng tế bào của ABA khi thực vật gặp điều kiện bất lợi. Các
gen RAB phản ứng với ABA ngoại sinh và nội sinh tạo ra những protein có chức
năng ức chế và bảo vệ. Đây là hai nhóm gen được chú ý nhiều để sử dụng trong
công nghệ gen [1].
Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh vai trò làm tăng tính chống chịu khô
hạn của các gen mã hóa cho protein LEA như gen mã hóa cho protein Em của lúa
mỳ, đậu xanh, đậu tương, lúa gạo [7]. Chức năng của chúng được dự đoán dựa trên
khả năng giữ nước tốt của tế bào. Gen mã hóa cho protein D7 từ cây bông, protein
20

HVA1 từ đại mạch có chức năng cô lập ion trong quá trình mất nước. Gen mã hóa
cho LE25 từ cà chua và D113 từ cây bông, protein của các gen này có thể thay thế

vị trí nước trong màng tế bào để giữ ổn định cấu trúc này [7]. Gen OsLEA3-1 ở lúa
đã thể hiện tính chống chịu khô hạn trong điều kiện đồng ruộng nhờ sự điều khiển
của promoter CaMV35S [124]. Đặc điểm chung của các protein LEA là chúng có
các chuỗi peptide ưa nước cao nên một số LEA protein thích hợp với vai trò mang
nước, những protein này có thể giúp duy trì nhu cầu nước trong tế bào. Chúng có
thể xem như các chất tan thích hợp đóng vai trò duy trì cấu trúc của không bào khi
thiếu nước [7].
Phần lớn dehydrin đều được tổng hợp khi cảm ứng với điều kiện mất nước.
Gen mã hóa cho protein RAB 18 ngăn ngừa sự mất nước trong tế bào khí khổng ở
lá, còn gen mã hóa cho protein LTI29 và ERD 14 tăng cường giữ nước trong rễ. Khi
gặp hạn hoặc bị mất nước, chúng đều được tổng hợp với lượng đáng kể ở
Arabidopsis. Gen mã hóa cho protein DHN13 của đại mạch có trong hầu hết các mô
tế bào ở điều kiện bình thường cũng như khi gặp hạn, lạnh và xử lý ABA, còn
protein DHN4 chỉ có trong hạt, khi xử lý ABA và mất nước. Các gen dehydrin khác
của đại mạch như Dhn1, Dhn 3, Dhn 4, Dhn 6, Dhn 9 đều có sản phẩm phiên mã rõ
rệt khi mất nước và xử lý ABA [7], [94].
Nhiều gen mã hóa cho enzyme tham gia vào các phản ứng với hạn đã được
nghiên cứu về mặt chức năng. Các độc tố xuất hiện dưới ảnh hưởng của các yếu tố
bất lợi thường do nguyên nhân có sự tích lũy các phân tử phản ứng lại với các yếu
tố bất lợi như aldehyde. Các phân tử này có thể là nguyên nhân phân giải lipid, làm
biến đổi các protein và acid nucleic. Dưới tác động của aldehyde dehydrogenase
(ALDH), aldehyde có thể bị biến đổi thành carboxylic acid không độc. Gen mã hóa
cho ALDH xuất hiện trong tất cả các cơ thể sinh vật cho thấy sự quan trọng của nó
trong các chức năng sinh học nói chung. Sự cân bằng aldehyde là rất cần thiết trong
quá trình bảo vệ thẩm thấu khỏi các yếu tố bất lợi. Gen BADH (betaine aldehyde
dehydrogenase) cũng đóng vai trò quan trọng trong sự chống chịu của thực vật với
hạn và muối. Gen JcBD1 thuộc nhóm này đã được biểu hiện, sau khi đánh giá cho
thấy khả năng chịu hạn cao hơn so với đối chứng [131]. Trong các chất tan, proline
21

được xem là chất đóng vai trò chính trong điều chỉnh thẩm thấu ở các cây chịu khô
hạn hoặc đất nhiễm mặn. Vai trò của các gen mã hóa cho các enzyme xúc tác cho
quá trình tổng hợp proline liên quan tới khả năng chịu hạn của thực vật nói chung
và cây trồng nói riêng đã được nhiều nghiên cứu đề cập đến [42]. Hầu hết các
amino acid tăng lên khi cảm ứng với điều kiện bất lợi của môi trường nhưng proline
tăng lên rõ rệt hơn cả. Khi tế bào bị mất nước nghiêm trọng hàm lượng proline tăng
lên 48 lần so với đối chứng. Khi xử lý với muối, cây tích lũy proline một cách từ từ
và tăng gấp 7 lần so với đối chứng sau 72 giờ xử lý [112].
Rất nhiều gen được phân lập và biểu hiện có mối quan hệ với tính kháng hạn
đã được chứng minh như trehalose6-phosphate-synthase (gen TPS) phân lập từ cây
bông [66], gen CaAMP1 từ cây tiêu [69], gen TaAIDFFa từ lúa mỳ [126], gen codA
từ cây khoai tây [20], gen mã hóa chaperonin từ cây đậu tương [10] … Đã có nhiều
công bố nghiên cứu về gen mã hóa cho cystatin và thảo luận về mối liên quan của
cystatin với khả năng chống chịu của thực vật như khả năng chịu hạn, lạnh, mặn.
Gen mã hóa cystatin đã được phân lập từ cây lạc [16], đậu đũa [41], Arabidopsis
[132],…
Theo xu hướng thứ hai tập trung tìm hiểu về gen chống chịu theo hướng các
yếu tố điều khiển, ví dụ như các nhân tố phiên mã (bZIP, MYB, MYC,
EREBP/AP2, NAC, DREB và zinc fingers). Hiện nay nhóm gen mã hóa cho các
yếu tố điều khiển quá trình phiên mã của những gen liên quan đến khả năng kháng
hạn ở thực vật đang rất được quan tâm nghiên cứu. Gen NAC (mã hóa cho nhân tố
phiên mã NAC) khi được chuyển vào cây không chỉ biểu hiện tính chống chịu lại
cùng lúc với nhiều điều kiện bất lợi như hạn, mặn, lạnh mà còn ảnh hưởng tích cực
đến sự phát triển và năng suất cây trồng [57]. Gen TERF1 điều khiển tổng hợp
ethylene responsive factor (ERF) protein đã được chuyển vào lúa cho thấy biểu hiện
khả năng chịu hạn của cây và sống sót trong môi trường có nồng độ muối cao [48],
ngoài ra gen TERF1 cũng đã được phân lập và chuyển gen, giúp cây thuốc lá tăng
cường khả năng chống chịu trong điều kiện hạn [130]. Gen điều khiển tính chịu hạn
DREB (Dehydration responsive element/C repeat) được phân lập từ các cây trồng
nhau như đậu tương, súp lơ, cà chua, lúa, lúa mỳ. Biểu hiện của gen DREB1/CBF1,

22

DREB1/CBF2, DREB1/CBF3 dẫn đến cây chuyển gen tăng cường tính kháng hạn,
mặn và lạnh [56]. Biểu hiện của gen mã hóa DREB2A hoạt hóa sự biểu hiện của
nhiều gen chức năng tham gia vào tính kháng hạn ở thực vật [95].
1.2. CÁC NHÂN TỐ PHIÊN MÃ LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN
1.2.1. Nhân tố phiên mã liên quan đến tính chịu hạn ở thực vật
Sự phản ứng của cơ thể thực vật ở các mức độ khác nhau trước tác động của
các yếu tố cực đoan đang là vấn đề được quan tâm nghiên cứu hiện nay. Sự phản
ứng đầu tiên của tế bào khi mất nước là xuất hiện ABA. Trong trường hợp này các
gen đặc hiệu được biểu hiện, một loạt các chất được tổng hợp mới trong tế bào
Những yếu tố cực đoan khác nhau (hạn, mặn, lạnh) tạo ra những tín hiệu như nhau
và sự phản ứng của cơ thể sống đối với các yếu tố cực đoan của ngoại cảnh phụ
thuộc vào từng loài, kiểu gen, độ dài và tính khốc liệt của yếu tố cực đoan, độ tuổi
và giai đoạn của sự phát triển, dạng các cơ quan hoặc tế bào [7], [101].

Hình 1.3. Hệ thống điều hòa phiên mã của các tín hiệu stress phi sinh học
và sự biểu hiện gen [101]
23

Trong những năm gần đây, các nhà nghiên cứu tập trung tìm hiểu về gen chống
chịu theo hướng các yếu tố điều khiển, ví dụ như các nhân tố phiên mã nhằm tiếp
cận cách điều hòa tổng thể hơn của thực vật khi gặp điều kiện bất lợi trong đó có
hạn hán [1]. Nhân tố phiên mã là các protein tham gia điều khiển mức độ biểu hiện
gen thông qua việc gắn vào các trình tự DNA ngắn đặc hiệu trong vùng promoter
của các gen đích và làm tăng hoặc giảm mức độ biểu hiện của chúng. Gen mã hoá
cho TF có chứa motif gắn DNA (bZIP, MYB, MYC, EREBP/AP2, NAC, DREB và
zinc fingers) được mô tả hoạt hoá bởi tác động của các yếu tố bất lợi. Tiếp theo đó,
chúng có vai trò điều hoà các gen chức năng (hình 1.3) [101].
Vai trò của các yếu tố phiên mã trong phản ứng với các điều kiện bất lợi đã

được nhiều nghiên cứu đề cập đến [19], [33], [99], [116]. Hệ gen thực vật có
khoảng 7% trình tự mã hóa cho họ nhân tố phiên mã [116]. Trong hệ gen của cây
Arabidopsis có khoảng 1500 nhân tố phiên mã tham gia vào đáp ứng biểu hiện gen
khi gặp các nhân tố tác động bất lợi. Nghiên cứu trên cây Arabidopsis và rất nhiều
các cây trồng khác đã cho thấy, có một số con đường đáp ứng một cách độc lập với
các áp lực từ môi trường (bao gồm cả con đường phụ thuộc ABA và không phụ
thuộc ABA). Như vậy, đặc tính chống chịu các yếu tố bất lợi được điều khiển ở
mức độ phiên mã bởi một hệ thống điều hòa gen vô cùng phức tạp [101].
ABA được xem là chất có vai trò điều hòa chính khi cây trồng gặp các yếu tố
bất lợi, đặc biệt là trong khả năng chống chịu với hạn hán của thực vật, cùng phối
hợp với một hệ thống điều hòa biểu hiện gen phức tạp cho phép thực vật đối phó
với việc thiếu nước [37], [65]. Phụ thuộc vào phản ứng với ABA những đường dẫn
truyền tín hiệu chia thành 2 loại.
Nhân tố phiên mã và con đƣờng dẫn truyền tín hiệu phụ thuộc ABA
MYB - DNA binding domain là một nhóm nhân tố phiên mã rất đa dạng ở các
loài Eukaryote. Vùng MYB là trình tự DNA trên promoter của các gen chịu hạn,
trên promoter có trình tự để các protein MYB, MYC nhận biết. Ở Arabidopsis,
ATMYB2 nhận biết trình tự TGGTTAG trên promoter để hoạt hóa gen rd22
(dehydration –responsive gene rd22) trong điều kiện mất nước [18]. Đây là gen cảm
ứng với ABA. Còn gen AtMYB60 biểu hiện trong tế bào khí khổng, giúp cho tế bào
24

thực vật vượt qua được tình trạng mất nước [7]. Vùng gắn DNA – MYB (MYB –
DNA binding domain) được biết đến lần đầu tiên ở dạng v-myb oncogene (gen gây
ung thư) của virus gây bệnh ung thư tủy xương (Myeloblastosis) ở loài chim [7].
Protein MYB đặc trưng bởi sự có mặt của 2 hoặc 3 Myb motif, mà mỗi motif này
chứa cấu trúc xoắn chuyển xoắn (helix-turn-helix) với 3 vị trí gốc Trp. Protein
MYB của động vật có chứa 3 Myb motif được ký hiệu là R1, R2, R3, trong khi đó ở
thực vật chỉ chứa 2 Myb motif R2, R3 [18].
Protein MYC là nhân tố phiên mã được biểu hiện cảm ứng do ABA và nhận

biết trình tự đặc trưng MYC trên promoter các gen chịu hạn. Protein MYC được đặc
trưng bởi cấu trúc domain cơ bản basic helix-loop-helix (bHLH). bHLH có thể nhận
biết được trình tự dạng CANNTG trên promoter (N – nucleotide bất kỳ). Tuy vậy,
hai nucleotide NN đặc trưng cho từng vùng. Kết quả nghiên cứu promoter rd22 của
Arabidopsis trên cây thuốc lá chuyển gen cho thấy, protein rd22BP1 chỉ nhận biết
trình tự CACATG đầu tiên phản ứng với hiện tượng mất nước, còn trình tự
CACATG thứ hai trong vùng này lại có chức năng ức chế [7].
Nhóm nhân tố phiên mã AREB/ABF (bZIP) nhận biết yếu tố ABRE (ABA –
responsive element) - PyACGTGGC trong vùng promoter. Hoạt hoá gen phản ứng
với sự mất nước RD29B, RD20A. ABRE lần đầu tiên được phân lập từ gen Em của
lúa mỳ và từ rab của lúa gạo. Protein gắn với Em (EmBP) mã hoá cho bZIP
(leucine zipper motif) protein. Trình tự ACGT là điểm gắn đặc hiệu của bZIP
protein [47], [73], [101].
Nhân tố phiên mã và con đƣờng dẫn truyền tín hiệu không phụ thuộc ABA
Nhận biết yếu tố DRE- yếu tố điều hòa phản ứng với sự mất nước là tên của
trình tự dài 9 bp: TACCGACAT trên promoter. Trong đó, vùng quan trọng nhất của
DRE motif là vùng lặp lại giàu C (CRT – C repeat) - CCGAC. Các yếu tố protein
gắn với trình tự DRE (DRE binding proteins - DREBs) ở vùng promoter đã được
nghiên cứu và phân lập. Những protein này chứa các vùng bảo thủ như các protein
EREBP (tham gia biểu hiện ethylene-responsive gene) và AP2 (Apetala2) - tham
gia trong quá trình biểu hiện kiểu hình của thực vật có hoa. Chúng phản ứng rất
nhanh với các yếu tố cực đoan trước khi xuất hiện ABA. Ví dụ như promoter của
25

gen phản ứng với sự mất nước rd29A ở Arabidopsis [73], [95], [101].
NAC (NAM, ATAF và CUC2) và HD-ZIP transcription factors liên quan đến
sự biểu hiện của gen ERD1 (Early responsive to dehydration stress 1) trong điều
kiện hạn [33], [76], [77]. Nhân tố phiên mã NAC nhận biết các trình tự đặc trưng
phản ứng với sự mất nước trong promoter của gen ERD1 [113].
Tuy nhiên, một số nghiên cứu đã xác định được sự tồn tại của cả con đường

phụ thuộc ABA và không phụ thuộc ABA trong đáp ứng với các yếu tố bất lợi ở các
họ nhân tố phiên mã chức năng như AP2/EREBP, NAC/ZF-HD, DREB/CBF.
Ngoài những nhân tố phiên mã đã biết này, một số lượng lớn nhân tố phiên mã khác
có liên quan đến khả năng đáp ứng với điều kiện bất lợi cũng đóng một vai trò rất
quan trọng trong việc tăng cường khả năng chống chịu ở thực vật [33].
Một số gen mã hóa cho TF được phân lập và chuyển vào thực vật nhằm mục
đích kích hoạt một lúc nhiều gen có phản ứng với điều kiện cực đoan, làm tăng
cường khả năng chịu hạn của cây trồng và tạo ra cây chuyển gen chống chịu tốt.
1.2.2. NAC và gen mã hóa NAC liên quan đến tính chịu hạn
1.2.2.1. Nhân tố phiên mã NAC liên quan đến tính chịu hạn
Họ NAC là một trong những họ nhân tố phiên mã đặc trưng lớn nhất trong
hệ gen thực vật với 106 và 149 thành viên trong cây Arabidopsis và lúa, 101 thành
viên trong hệ gen đậu tương [68], [106]. Chúng có một vùng bảo thủ cao nằm trong
khu vực vùng đầu N (NAC domain – được chia ra thành 5 phân vùng bảo thủ từ A
đến E) và một vùng điều hòa phiên mã hay biến đổi ở đầu C (có thể kích hoạt hay
ức chế sự phiên mã của nhiều gen đích) [54], [106], [71]. Tên NAC được bắt nguồn
từ ba chữ cái đầu tiên của tên mô tả nhân tố phiên mã chứa miền NAC, cụ thể là
NAM (no apical meristem), ATAF (Arabidopsis transcription activation factor) và
CUC (cup-shaped cotyledon). Các yếu tố cis của nhân tố phiên mã NAC [NAC
recognized sequence (NACRS)] cũng đã được xác định trong Arabidopsis [33],
[113].
Nhân tố phiên mã NAC liên quan đến nhiều quá trình sinh lý quan trọng
trong cơ thể thực vật như sự phát triển mô phân sinh ngọn, sự phát triển hình dạng
hoa, hình thành lá và già hóa, phát triển phôi, phát triển hạt, sinh tổng hợp