ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN VÀ PHÂN LẬP GEN CYSTATIN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG Glycine max (L.) Merrill

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƢỜNG
ĐẠI HỌC
SƢ
PHẠM







HÀ THỊ
PH
Ƣ
ỢNG

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN VÀ PHÂN LẬP
GEN CYSTATIN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN
Ở CÂY ĐẬU
TƢƠNG
[Glycine max (L.) Merrill]















LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH
HỌC

Thái Nguyên -
2010






ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƢỜNG
ĐẠI HỌC
SƢ
PHẠM


HÀ THỊ
PH
Ƣ
ỢNG






ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN VÀ PHÂN LẬP
GEN CYSTATIN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN
Ở CÂY ĐẬU
TƢƠNG
[Glycine max (L.) Merrill]



Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 62.42.70






LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH
HỌC

NGƢỜI HƢỚNG
DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. CHU HOÀNG
MẬU









Thái Nguyên -
2010





LỜI CẢM
ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy PGS.TS. Chu Hoàng Mậu-
Phó Giám đốc Đại học Thái nguyên và TS. Chu Hoàng Hà - Phó Giám đốc
Phòng thí nghiệm trọng điểm , Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Khoa học
và Công nghệ Việt Nam đã tận tình
h
ƣ
ớng
dẫn , ch
bảo
, hêt long giúp đỡ tôi
trong suốt qua trinh nghiên
cƣu
va thực hiện đê tai luận văn .
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS .TS. Lê Trần Bình - Nguyên

Viên
tr
ƣ
ơng
Viện Công nghệ Sinh học đã giúp đỡ va tạo mọi điều kiện thuận
lợi đê tôi hoàn thành luận văn cua minh .
Tôi xin chân thành cảm ơn TS . Nguyễn Vũ Thanh Thanh -
Tr
ƣ
ơng
Đại
học khoa hoc
tƣ
nhiên –ĐH Thái nguyên và CN . Hoàng Ha - Phòng Công

nghệ tế bào thực vật , Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ tôi trong quá trình
thực hiện đê tai luận văn .
Trong quá trình
thƣc
hiên đê tai , tôi đã nhân
đƣợc
sự giúp đỡ nhiệt tình
của toàn thể cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh
học. Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo và các cán bộ Khoa sau đại
học,
Tr
ƣ
ờng
Đại học
Sƣ
phạm - Đại học Thái nguyên đã giảng dạy và tạo
điều kiện cho tôi hoàn thành khoá học.
Tôi xin cảm ơn lanh đao
tr
ƣ
ờng
THPT Đông Hy , các bạn đng nghiệp
đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn
Cuối cùng tôi rất biết ơn những
ngƣời
thân trong gia đình, các ban cua tôi
đã luôn động viên, quan tâm, tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu.

Thái Nguyên, tháng 8 năm
2010


Tác gi luận văn

Hà Th
Ph
ƣ
ợng





MỤC
LỤC





Trang phu bia Trang

Lơi cam ơn

Nh
ƣ
ng

chƣ
viêt tăt

Danh muc cac bang trong luân an

Danh muc cac hinh trong luân an

MỞ ĐẦU………………………………………………………… 1

Ch
ƣ
ơng
1. TỔNG QUAN TÀI
LIỆU
………………………………
4

1.1. CÂY ĐÂU
T
Ƣ
ƠNG
VA ĐĂC TINH CHIU HAN

CỦA CÂY ĐẬU
T
Ƣ
ƠNG
4

1.1.1. Cây đậu tƣơng…………………………… …………… 4

1.1.2. Đặc tính chịu hạn của cây đậu
t
ƣ
ơng…………
……… … 8

1.2. CHÂT
ƢC
CHÊ CYSTATIN VA GEN CYSTATIN

Ở THỰC VÂT VA CÂY ĐÂU
T
Ƣ
ƠNG
12

1.2.1. Chât
ƣc
chê Cystatin 12

1.2.1.1. Giơi thiêu chung vê Cystatin ơ sinh vât 12

1.2.1.2. Phân loại Cystatin 13

1.2.1.3. Cấu trúc, chức năng của Cystatin thực vật 15

1.2.2. Gen ma hoa Cystatin ơ
thƣc
vât va cây đâu

t
ƣ
ơng…
. …….….… 19

1.3. ỨNG DỤNG SINH HỌC PHÂN T TRONG

PHÂN LÂP GEN

21

Ch
ƣ
ơng
2. VẬT LIỆU VÀ
PHƢƠNG
PHÁP NGHIÊN CU 28

2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CU

28

2.1.1. Vật liệu thực vật 28

2.1.2. Hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu 29




2.2.

PHƢƠNG
PHÁP NGHIÊN CU

29

2.2.1. Đánh gía kh năng chịu hạn ở giai đoạn cây non

bằng
ph
ƣ
ơng
pháp gây hạn nhân
tạo
29

2.2.2. Xử lý kết qu và tính toán số liệu 31

2.2.3.
Ph
ƣ
ơng
pháp sinh học phân tử 31

2.2.3.1.
Ph
ƣ
ơng
pháp tách chiết ARN tổng số

từ mầm đậu

tƣơng

31

2.2.3.2.
Ph
ƣ
ơng
pháp điện di ADN trên gel agarose 32

2.2.3.3.
Ph
ƣ
ơng
pháp RT-P 32

2.2.3.4. Ph•¬ng ph¸p g¾n gen vµo vector t¸ch dßng 35

2.2.3.5. BiÕn n¹p vector t¸i tæ hîp vµo tÕ bµo kh¶ biÕn E.coli DH5 36

2.2.3.6. Ph•¬ng ph¸p PCR trùc tiÕp tõ khuÈn l¹c (colony-PCR) 36

2.2.3.7. Tách chiêt plasmit

37

2.2.3.8.
Ph
ƣ
ơng

pháp xác định trình tự gen

bằng thiết bị tự động(
N)
37

Ch
ƣ
ơng
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3.1. ĐẶC ĐIỂM CỦA HẠT VÀ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÁC
GIỐNG ĐẬU
T
Ƣ
ƠNG
NGHIÊN CỨU
.

38
3.1.1. Đặc điểm hình thái, kích
thƣớc
và khối
lƣợng
hạt

5 giống đậu
tƣơng
nghiên cứu 38

3.1.2. Kh năng chịu hạn của 5 giống đậu
t
ƣ
ơng
39

3.2. KÊT QUA PHÂN LÂP VA XAC ĐINH TRINH
T
Ƣ


GEN CYSTATIN Ơ ĐÂU
T
Ƣ
ƠNG
40


3.2.1. Tách chiết ARN tông sô 40

3.2.2. KÕt qu¶ RT-PCR 43




3.2.3 KÕt qu¶ biÕn n¹p vector t¸i tæ hîp vµo tÕ bµo kh¶ biÕn

E.coli DH5α

44

3.2.4 Kết quả chọn dòng tế bào mang vector tái tổ hợp 46

3.2.5. Kết quả tách chiết ADN plasmid
47

3.2.6. Kết quả kiểm tra các dòng plasmid 48

3.2.7. Kết qu giải trình tự nucleotit

49

KÊT LUÂN VA ĐÊ
NGHI
……………… ……………….
… 58

CÔNG TRINH CÔNG BÔ LIÊN QUAN ĐÊN LUÂN VĂN 59

TÀI LIỆU THAM
KHẢO

60




NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

ADN
Axit deoxyribonucleic
ARN
Axit ribonucleic
ASTT
Áp suất thẩm thấu
ATP- aza
Enzym phân giải ATP
Bp
Cặp bazơ
cADN
Sợi ADN bổ sung
đƣợc
tổng hợp từ
mARN


nhờ enzyme phiên ma
ng
ƣ
ợc

dNTP
Deoxynucleotid
cs
Công
s
ƣ

DHA
Docosa Hexaenoic Axit
EDTA
Ethylendiamin tetraacetic axit
EPA
Eicosa Pentaenoic axit
HSP
Heat shock protein - Protein sốc nhiệt
HSG
Heat Shock Granules
HSPL
Hệ số pha loãng
Kb
Kilo bazơ = 1000 bp
LEA
Late embryogenesis abundant
MGPT
Môi giới phân tử - Molecular chaperone
MW
Molecular weight - Khối
lƣợng
phân tử
PCR
Polymeraza chain reaction - Phản ứng chuỗi polimeraza




DANH MC CÁC BẢNG

Bảng
Tên
Bang

Trang
2.1
Nguồn gốc, đăc điêm của 6 giống đậu tƣơng nghiên

cứu
30

2.2
Thành phần phản ứng của PCR
24

2.3
Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR
37

2.4

Thành phần phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector
tách dòng pBT
38

3.1
Màu sắc, sô
lƣơng

và khối
lƣợng
hạt của 6 giống đậu

tƣơng
nghiên cứu
42

3.2
Đanh gia kha năng chiu han cua 6 giông đậu
t
ƣ
ơng


nghiên cứu
45

3.3

Hê sô
tƣơng
đông va hê sô khac nhau cua gen cystatin
ở 10 giông đâu
tƣơng
(%)
58

DANH MC CÁC HÌNH



Hình
Tên
Hinh

Trang
2.1.

Sơ đ vector pBT
38

3.1

Hình ảnh hạt của 6 giống đậu
tƣơng
nghiên cứu
42

3.2

Hình ảnh cây đậu
tƣơng
3 lá
trƣớc
khi xử lý hạn

44

3.3

Hình ảnh cây đậu
tƣơng
3 lá sau khi xử lý hạn
44

3.4


Kết qu tách chiết RNA tổng số
46

3.5


KÕt qu¶ PCR nhân gen
cu
a giông đâu
tƣơng
Thai

Nguyên
48

3.6

Kết qu biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào kh

biến E. coli DH5α
49

3.7


PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi pUC18F-
50

3.8

Kết qu tách ADN plasmid tái tổ hợp
51

3.9

Kết qu cắt plasmid bằng enzyme giới hạn BamHI
52

3.10

Trình tự trình tự nucleotid của mẫu nghiên cứu

Thái Nguyên và 4 mâu giông đâu
tƣơng
đa công bô

trên genbank
54

3.11
Biêu đô hinh cây so sanh
mƣc tƣơng
đông gen

cystatin cua 10 giông đâu
t
ƣ
ơng

59

3.12
Trình tự axit amin cua mâu nghiên
cƣu
Thai

Nguyên va 4 mâu giông đâu
tƣơng
đa công bô trên

genbank
60





MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài

Đậu
tƣơng
Glycine max (L.) Merrill là loại cây có vị trí quan trọng trong cơ
cấu cây trồng nông nghiệp, có giá trị kinh tế và hàm
lƣợng
dinh
d
ƣ
ỡng
cao. Hạt
đậu
tƣơng
chứa 30%- 46% protein, 12%-25% lipit, và nhiều loại vitamin (B1, B2,
C,D, E, K…), chứa nhiều loại axit amin cần thiết (lizin, triptophan, metionin,
xystein, lizin…), là ngun năng
lƣợng
cần thiết cho con
ng
ƣ
ời.


Cây đậu
t
ƣ
ơng
có thời gian sinh

tr
ƣ
ởng
ngắn, hệ rễ có nốt sần mang vi
khuẩn cố định đạm, tạo kh năng cố định nitơ không khí thành chất hữu cơ
nên cây đậu
tƣơng
th
ƣ
ờng

đƣợc
trồng luân canh với lúa và ngô để tăng vụ và
cải tạo đất bạc màu. Vì vậy trồng đậu
t
ƣ
ơng
góp phần cải tạo đất và bảo vệ
môi
tr
ƣ
ờng.
Với những giá trị to lớn đó, mà cây đậu
t
ƣ
ơng

đƣợc
trồng phổ
biến ở nhiều

nƣơc
trên thế giới, phát triển mạnh ở Mỹ, Braxin,
Argentina
,
Trung Quốc va Ấn Độ. Ở Việt Nam, cây đậu tƣơng đƣợc gieo trồng ở c 7
vùng nông nghiệp trên c
nƣớc
với nguồn gen rất đa dạng và phong phú, gồm
các giống nhập nội, giống lai tạo, giống đột biến và tập đoàn các giống địa
phƣơng.
Sự đa dạng và phong phú đó chính là nguồn nguyên liệu phục vụ cho
công tác giống nhằm chọn tạo những giống đậu tƣơng mới cho năng suất và
chất
lƣợng
phù hợp với mục tiêu chọn giống [9]. Những giống đậu
t
ƣ
ơng
địa
phƣơng thƣờng
có năng suất thấp,
nhƣng
lại có chất
lƣợng
hạt tốt và kh năng
chống chịu cao đôi với các điều kiện bất lợi của ngoại cảnh.

Trong những năm gần đây diễn biến khí hậu ngày càng phức tạp, lƣợng
mƣa
phân bố không đều giữa các vùng và giữa các thờì kỳ trong năm nên hạn

hán và nắng nóng kéo dài cùng với sự biến đổi của các yếu tố môi
tr
ƣ
ờng
khác đã tác động xâu đến sự sinh
tr
ƣ
ởng
và phát triển, làm giảm năng suất và




chất
lƣợng,
gây suy giảm kh năng chống chịu của cây trông trong đo co đâu
tƣơng
[16]. Đậu
tƣơng
là cây
tƣơng
đối mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh và
thuộc vào nhóm cây chịu hạn kém, công tác chọn tạo các giống đậu
t
ƣ
ơng
có
kiểu gen chống chịu ngày càng
đƣợc
quan tâm nghiên cứu [6], [8], [11].

Để thúc đẩy sản xuất đậu
tƣơng
ở
nƣớc
ta vấn đề quan trọng là chọn tạo
đƣợc những giống thích hợp với điều kiện địa hình khí hậu, cho năng suất
cao, phẩm chất tốt. Vì vậy tuyển chọn giống đậu
t
ƣ
ơng
có chất
lƣợng
cao, có
kh năng chịu hạn là yêu cầu thực tiễn đặt ra cho ngành chọn giống đậu
tƣơng.
Do đó nghiên cứu đặc tính chịu hạn và cơ sở hóa sinh, sinh học phân
tử của đặc tính này làm cơ sở cho việc tuyển chọn giống đậu
t
ƣ
ơng
có chất
lƣợng
và
ƣu
việt về kh năng chịu hạn để làm vật liệu vật liệu phục vụ chọn
giống đâu
tƣơng
[30].

Đã có nhiều công trình nghiên cứu tìm hiểu cở sở phân tử của đặc tính
chịu nóng, chịu hạn của cây đậu
t
ƣ
ơng,
[8], [12], [17], [32]. Tuy nhiên, sự
hiểu biết về gen liên quan đến kh năng chịu hạn của cây đậu
t
ƣ
ơng
vẫn còn
vẫn còn rât ít và
chƣa đƣợc
đầy đủ . Cystatin là chất ức chế có bản chất
protein. Sự biểu hiện của các gen cystatin
thƣờng
trong điều kiện hạn, lạnh,
mặn và ở các pha riêng rẽ của quá trình sinh
tr
ƣ
ởng,
phát triển của thực vật. Ở
rễ cây dẻ (Castanea sativan) gặp lạnh, sốc muối, stress nóng thì mức độ phiên
mã tăng mạnh ở c tế bào rễ và tế bào lá. Cystatin ở cây dẻ không ch liên
quan đến phản ứng tự vệ với các mầm bệnh và sâu hại mà còn liên quan đến
kh năng chống lại tác động bất lợi của các nhân tố môi
tr
ƣ
ờng.
Cystatin và

gen mã hóa cystatin cũng đã
đƣợc
nghiên cứu ở cây đậu xanh (Nguyễn Vũ
Thanh Thanh và cs, 2008), ở lúa (Ngô Mạnh Dũng và cs 2008) và ở một số
loài cây nhƣ đậu đũa, cỏ dại… Đối với cây đậu
t
ƣ
ơng
việc nghiên cứu về
cystatin và gen mã hóa protein này vẫn còn là vấn đề mới mẻ.




Từ những lý do trên tôi đã chọn và tiến hành đề tài luận văn thạc sĩ là:

''Đánh giá khả năng chịu hạn và phân lập gen cystatin liên quan đến tính

chịu hạn ở cây đậu tương"

2. Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định kh năng chịu hạn và phân nhóm khá c nhau vê
mƣc
đô chiu
hạn của các giống đậu
t
ƣ
ơng
nghiên cứu;

- Phân tich đăc điêm cua gen cystatin liên quan đến tính chịu hạn của
cây đậu
t
ƣ
ơng.


3. Nội dung nghiên cứu

- Phân tích kh năng phản ứng đối với hạn của các giống đậu
t
ƣ
ơng
ở
giai đoạn cây non trong điều kiện hạn nhân tạo;

- Tách chiết ARN tổng số từ hạt đậu
tƣơng
ở giai đoạn hạt non;

- Thu thâp thông tin vê gen cystatin , thiết kế và tổng hợp cặp mồi để

nhân gen cystatin;

- Tạo dòng cADN từ mARN băng phan
ƣng
phiên ma
ng
ƣ

ơc
va nhân

gen cystatin bằng kĩ thuật PCR;

- Đọc trình tự nucleotide cua gen cystatin ở cây đậu tƣơng.




Chƣơng
1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. CÂY ĐẬU
TƢƠNG
V ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU
T
Ƣ
ƠNG


1.1.1. Cây đậu
t
ƣ
ơng


Đậu

t
ƣ
ơng
là cây họ đậu (Fabaceae) có tên khoa học là Glycine max
(L.) Merrill. Họ phụ cánh
b
ƣ
ớm
(Papilionoidea) có nguồn gốc từ Trung Quốc
là loại cây trồng không thấy xuất hiện ở loài hoang dại. Đậu
t
ƣ
ơng
là cây
công nghiệp, cây thực phẩm quan trọng của thế giới,
đƣợc
trồng trên diện tích
lớn của nhiều
nƣớc
đặc biệt ơ Trung Quốc và Mỹ. Các giống đậu
tƣơng
đang
trồng ở
nƣớc
ta đa
đƣợc
du nhập từ Trung Quốc từ lâu đời [7].

Cây đậu
tƣơng

có số nhiễm sắc thể
lƣỡng
bội là 40 và số kiểu gen nhất
định, cũng
nhƣ
có hàng loạt tính kháng bệnh, chịu hạn, chịu nóng và các đặc
điểm sinh thái khác. Đậu
tƣơng
là loài cây gồm các bộ phận chính là rễ, thân,
lá, hoa và quả. Rễ đậu tƣơng là rễ cọc, gồm rễ cái và các rễ bên, trên rễ có
nhiều nốt sần chứa vi khuẩn vi khuẩn Rhizobium japonicum có kh năng cố
định nitơ từ khí trời cung cấp đạm cho cây [4]. Đậu
t
ƣ
ơng
là loài cây thân
thảo, thân non có màu xanh hoặc tím, khi qu chín thì thân ng sang màu
vàng nâu. Lá đậu là lá kép với 3 lá chét, đôi khi cũng có những lá 4-5 lá chét.
Đậu
tƣơng
là cây tự thụ phấn, hoa đậu
t
ƣ
ơng
nhỏ, không
hƣơng
vị. Hoa mọc
thành chùm ở nách lá hoặc ngọn, có màu trắng hoặc tím. Qu thẳng hay qu
cong có nhiều lông và khi chín có màu vàng hoặc xám. Hạt đậu
tƣơng

không
có nội nhũ mà ch có một lớp vỏ bao quanh phôi và 2 lá mầm. Hạt có hình
tròn hoặc hình bầu dục, tròn dài, tròn dẹt, vỏ hạt đậu
tƣơng
có màu nâu , đen,
vàng va xanh ,
nhƣng
đa số là hạt màu vàng. Khối
lƣợng
hạt rất đa dạng dao
đông
tƣ
20-400 mg/hạt.




Đậu
t
ƣ
ơng
là cây trồng lấy hạt, là loại cây cung cấp dầu quan trọng
nhất trong các cây lấy dầu. Vơi thành phần dinh
d
ƣ
ỡng
cao, hạt đậu
t
ƣ
ơng

không chi co vai tro là ngun
thƣc
ăn cung câp năng
lƣơng
, protein đậu tƣơng
còn có tác dụng hữu hiệu giảm cholesterol trong máu, giảm thiểu nguy cơ các
bệnh liên quan đến tim mạch, ngăn cản sự phát triển các mầm bênh ung thƣ,
ngăn ngừa bệnh
thận
, bệnh tiểu
đ
ƣ
ờng
va bệnh xốp
xƣơng
[14].
Đậu tƣơng là cây trng có giá trị kinh tế cao, là cây công nghiệp, cây
thực phẩm, vừa là cây cải cải tạo đất, tăng năng suât cây trông vơi thơi gian
sinh
tr
ƣ
ơng
ngắn ngày, trng đƣợc nhiều vụ trong năm, với các nhóm giống
chín sớm, trung bình và muộn. Thời gian sinh
tr
ƣ
ởng
là một yếu tố rất quan
trọng để lựa chọn cây trng luân canh tăng vụ [15], theo thời gian sinh
tr

ƣ
ởng
có thể phân ra các giống đậu
tƣơng
chín rất sớm (75-90 ngày), các giống chín
sớm (90-100 ngày), các giống chín trung bình (100-110 ngày), loại chín muộn
trung bình (110-120 ngày), các giống chín muộn (130-140 ngày), các giống
chín rất muộn (140-150 ngày). Đậu
tƣơng
là cây
tƣơng
đối mẫn cảm với điều
kiện ngoại cảnh. Trong tập đoàn giống đậu
tƣơng
có những giống ch trng vào
vụ hè, có những giống ch trng vào vụ đông, có những giống trồng ở vụ xuân
hè và có những giống trng thích hợp với vụ thu đông [9].
Đậu
tƣơng
là cây trng chiến
lƣợc
của nhiều quốc gia . Cây đậu tƣơng
chiếm một vị trí rất quan trọng trong nền nông nghiệp nƣớc ta nói riêng v à
trên thê giơi noi chung . Vì đâu
tƣơng
là cây ngắn ngày , hạt có giá trị dinh
d
ƣ
ơng

cao
, là ngun nguyên liệu cho các ngành công nghiệp thực phẩm (ép
dâu, làm bánh kẹo , đô
uông
), làm thực phẩm cho
ngƣời
và thức ăn cho
chă
n
nuôi. Ngoài ra c ây đâu
tƣơng
con la cây cai tao đât tôt , Ở Việt Nam, phát
triên đâu
tƣơng
đang la môt trong 10
ch
ƣ
ơng
trinh
ƣu
tiên ơ
nƣơc
ta [56], đậu
tƣơng
đang
đƣợc
trồng trên c 7 vùng nông nghiệp trên c
nƣớc,
do điều kiện
sinh thái của mỗi vùng khác nhau nên có sự khác biệt khá rõ về diện tích

trồng, năng suất và sản lƣợng [10], trong đó vùng núi phía Bắc có diện tích
gieo trồng lớn nhất 46,6%, đồng bằng Sông Hồng 19,3%, vùng Tây Nguyên
11%, miền Đông Nam Bộ 10,2%, đồng bằng Sông Cửu Long 8,9%, khu Bốn

2,3% và vùng Duyên hải miền Trung 1,6% [9].
Tƣ
năm 1990 trơ lai đây, diên
tích, năng suât va san
lƣơng
đâu
tƣơng
không
ng
ƣ
ng
tăng (diên tich tăng
11,2%, năng suât tăng 46,8% và sản
lƣợng
tăng 63,9%. Gân
đây
, phong trào
trông đâu
tƣơng
phat triên manh , đem lai hiêu qua kinh tê cao
nhƣ
ơ Hà Nội,

Hà Nam , Ninh Binh , Hải
D
ƣ
ơng
,
Hƣng
Yên, Băc Ninh , Tây Ninh, Long
An, [56]. Trong 7 vùng sinh thái nông nghiêp khác nhau ở nƣớc ta, vùng
đông băng Sông Hô ng là vùng đạt
đƣợc
năng suất đậu
t
ƣ
ơng
bình quân cao
nhất. Niên giám thống kê 2008, năm 2006 diện tích trồng đậu
t
ƣ
ơng
là 66,5
nghìn ha, sản
lƣợng
đạt 103,0 nghìn tấn; đến năm 2007 tăng lên là 66,7 nghìn
ha, sản
lƣợng
đat 106,3 nghìn tấn. Hiên
nay
, diên tich canh tac cây đâu
t
ƣ

ơng
đang
đƣợc
mở rộng và phát triển.
Trên thế giới, đâu
tƣơng đƣơc
trông phổ biến ở Đông Nam Á, Bắc và
Nam Mỹ. Quê
hƣơng
của đậu
t
ƣ
ơng
là Đông Nam châu Á,
nhƣng
45% diện
tích trồng đậu tƣơng và 55% sản lƣợng đậu
t
ƣ
ơng
của thế giới nằm ở Mỹ.
Nƣớc
Mỹ sản xuất 75 triệu tấn đậu
t
ƣ
ơng
năm 2000, trong đó hơn một phần
ba đƣợc xuất khẩu. Các
nƣớc
sản xuất đậu

t
ƣ
ơng
lớn khác là Brasil,
Argentina, Trung Quốc và Ấn Độ.
Theo Oil World, sản
lƣợng
đậu
t
ƣ
ơng
thế giới niên vụ 2007 - 2008 đạt
tổng cộng 221,33 triệu tấn. Theo đo, Argentina là
nƣớc
cung cấp đậu
tƣơng
và
sản phẩm đậu
t
ƣ
ơng
lớn nhất thế giới. Trong năm 2007, Argentina cung cấp
59% tổng xuất khẩu dầu đậu
t
ƣ
ơng
thế giới. Hãng phân tích hạt có dầu Oil

World đã điều chỉnh tăng mức dự báo về sản
lƣợng

đậu
tƣơng
thế giới niên vụ

2009 - 2010 lên 258,2 triệu tấn, tăng 2,7 triệu tấn so với dự báo hồi tháng 3,

và tăng 46,5 triệu tấn so với niên vụ
tr
ƣ
ớc.
Con số này cao hơn so với mức




tiêu thụ đậu
tƣơng
toàn cầu là 234,2 triệu tấn do Oil World dự báo. Nam Mỹ
đã thu hoạch xong vụ mùa của mình, với sản
lƣợng
cao hơn nhiều so với năm
ngoái - khi hạn hán xảy ra. Sản lƣợng đậu tƣơng Brasil dự báo sẽ đạt 67,5
triệu tấn, tăng 1,5 triệu tấn so với dự báo
trƣớc
đây và tăng so với 57,5 triệu
tấn năm ngoái. Sản
lƣợng
của Argentina
ƣớc
tính đạt 54 triệu tấn, tăng 0,7

triệu tấn so với dự báo
trƣớc
đây và so với 31,5 triệu tấn năm ngoái.
Argentina đang thu hoạch vụ mùa, song thời tiết ở miền Bắc
nƣớc
này còn
nhiều yếu tố bất ngờ.
Theo dự báo của Bộ Nông nghiệp Mỹ, tổng sản
lƣợng
đậu
t
ƣ
ơng
trên
thế giới năm 2010- 2011 sẽ đạt 249,93 triệu tấn. Tổng diện tích đậu
t
ƣ
ơng
thế
giới dự báo đạt 101,37 triệu ha; năng suất bình quân sẽ đạt 2,47 tấn/ha so với
2,54 tấn/ha của năm 2009- 2010. Sản lƣợng đậu tƣơng năm 2010-2011 của

các
nƣớc
dự báo đạt (đơn vị: triệu tấn): Mỹ 90,08 ; Braxin 65,00 Achentina

50,00 ;Trung Quốc 14,60 ; Ấn Độ 8,80 ; Paragoay 6,50 ; Canađa 3,65 và các
nƣớc khác 11,30. Tổng diện tích, tổng sản
lƣợng
đậu tƣơng trên thế giới va

sản
lƣợng
của các
nƣớc
năm 2010-2011
dƣ
bao giảm so với năm 2009-2010.
Tuy nhiên tổng xuất khẩu đậu
t
ƣ
ơng
trên thế giới năm 2010- 2011 dự
báo đạt 88,24 triệu tấn, tăng so với 86,35 triệu tấn của năm 2009-2010. Trong
đó, xuất khẩu của Mỹ sẽ đạt 36,74 triệu tấn, Braxin 28,90 triệu tấn, Achentina
12,50 triệu tấn; Paragoay 4,84 triệu tấn, Canađa 2,23 triệu tấn.

Tổng dự trữ đậu tƣơng thế giới cuối niên vụ 2010 - 2011 dự báo đạt

66,99 triệu tấn so với 65,47 triệu tấn của cuối niên vụ 2009 - 2010.

Tổng sản
lƣợng
bột khô đậu
tƣơng
thế giới dự báo đạt 169,63 triệu tấn,
tăng so với 161,56 triệu tấn của năm 2009 - 2010. Tổng xuất khẩu bột khô đậu
tƣơng
dự báo đạt 56,81 triệu tấn, so với 55,20 triệu tấn của năm 2009 - 2010.
Tổng sản
lƣợng

dầu đậu
t
ƣ
ơng
thế giới dự báo đạt 39,97 triệu tấn trong

năm 2010 - 2011, tăng so với 37,98 triệu tấn của năm 2010 - 2011, tăng so




với 37,98 triệu tấn của năm 2009-2010. Tổng xuất khẩu dầu đậu tƣơng thế

giới dự báo đạt 9,06 triệu tấn so với 9,01 triệu tấn của năm 2009 - 2010.

1.1.2. Đặc tính chịu hạn của thực vật và của cây đậu
t
ƣ
ơng


Hạn đối với thực vật là khái niệm dùng để ch sự thiếu nƣớc do môi
tr
ƣ
ờng
gây nên trong suốt quá trình hay từng giai đoạn làm ảnh hƣởng đến
sinh
tr
ƣ
ởng

và phát triển của thực vật. Hạn cũng có thể
đƣợc
định nghĩa là sự
thiếu lƣợng nƣớc do
mƣa
hoặc
tƣới
nƣớc trong một thời gian dài tạo sự cạn
kiệt độ ẩm trong đất và gây nên tổn
th
ƣ
ơng
cho thực vật Bơi
nƣớc
vừa là
nguyên liệu khởi đầu vừa là sản phẩm trung gian và cuối cùng của các quá
trình chuyển hoá sinh học.
Nƣớc
là môi
tr
ƣ
ờng
để các phản ứng trao đổi chất
xảy ra. Thiếu nƣớc gây ảnh
hƣởng
đến sự mất cân bằng
nƣớc
của cây, từ đó
ảnh hƣởng đến các chức năng sinh lý khác nhƣ quang hợp, hô hấp, dinh
dƣỡng

khoáng và cuối cùng ảnh
h
ƣ
ởng
đến sinh
tr
ƣ
ởng,
phát triển. Mức độ
thiếu hụt
nƣớc
càng lớn thì càng ảnh
h
ƣ
ởng
xấu đến quá trình sinh
tr
ƣ
ởng
và
phát triển của cây, nếu thiếu nƣớc nhẹ sẽ làm giảm tốc độ sinh
tr
ƣ
ởng,
thiếu
nƣớc
trầm trọng sẽ làm biến đổi hệ keo nguyên sinh chất làm tăng
c
ƣ
ờng

quá
trình già hoá tế bào khi bị khô kiệt nƣớc, nguyên sinh chất bị đứt vỡ cơ học
dẫn đến tế bào, mô bị tổn
thƣơng
và chết.

Tùy theo từng loài, giống mà mức độ phản ứng của cơ thể cũng
nh
ƣ
thiệt hại do khô hạn gây ra khác nhau: một số bị chết, một số bị tổn thƣơng
nhƣng cũng có một số khác không bị ảnh
h
ƣ
ởng.
Kh năng thực vật có thể
giảm thiểu mức tổn thƣơng do thiếu hụt nƣớc gây ra gọi là tính chịu hạn.
Những cây trồng có kh năng duy trì sự phát triển trong điều kiện khô hạn gọi
là cây chịu hạn.

Mỗi cây trồng có một giới hạn nhất định đối với các nhân tố sinh thái
của môi
tr
ƣ
ờng

nhƣ
hạn, nóng, lạnh, Nếu ở ngoài giới hạn đó có thể gây hại

cho sự sinh
tr
ƣ
ởng
và phát triển của cây, giảm năng suất sinh học. Đã có rất
nhiều công trình nghiên cứu về kh năng chịu hạn ở cây đậu
t
ƣ
ơng,
ngô, lúa,
đậu xanh [1], [2], [8], [12], [18], [19].

Hạn là nguyên nhân chính của sự mất mùa và làm giảm năng suất gieo
trồng, nó làm giảm 50% năng suất cây trồng và có khi còn nhiêu hơn thế nữa.
Trên thế giới có khoảng 40 - 60% diện tích đất trồng bị hạn. Ở
nƣơc
ta
, địa
hình phức tạp, khí hậu cũng rất phức tạp,
lƣợng mƣa
phân bố không đều giữa
các vùng trong năm, cùng với các nguyên nhân khác
nhƣ
sự bùng nổ dân số, ô
nhiễm môi
tr
ƣ
ờng
dân đên môi

tr
ƣ
ơng
biên đôi nên hạn hán, lũ lụt thƣờng
xuyên xảy ra.

Chịu hạn ở thực vật
th
ƣ
ờng
kết qu của nhiều cơ chế đáp ứng stress hoạt
đông đông thơi . Khi nghiên cứu tính chịu hạn về mặt sinh lý, hóa sinh và cấu
trúc tế bào
ngƣời
ta nhận thấy hàng loạt những biến đổi sâu sắc ở những mức
độ khác nhau, trong giai đoạn phát triển khác nhau. Điều này chứng tỏ tính
chống chịu của thực vật do nhiều gen quyết định. Tuy nhiên hiện nay
ngƣời
ta
vẫn chƣa xác định
đƣợc
chính thức gen nào quy định tính chịu hạn của cây
mà ch tách chiết và phân lập các gen có liên quan.

Nghiên cứu bản chất của tính chịu hạn
ngƣời
ta tiếp cận theo hai hƣớng

chính:

(1) Kh năng bảo vệ của tế bào khỏi tác động bât lơi của điều kiện cực
đoan thông qua vai trò của nhóm protein sốc nhiệt (heat shock protein- HSP).
Các nhóm chất này liên quan đến sự bảo vệ các enzyme, các cấu trúc trong tế
bào và đào thải các chất bị biến tính có thể gây độc cho tế bào khi gặp phải
các yếu tố cực đoan.

(2) Kh năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu (ASTT) thông qua vai tro
của các chất và các gen
tƣơng
ứng có kh năng tạo áp suất thẩm thấu cao




trong tế bào để cạnh tranh nƣớc với môi
tr
ƣ
ờng
xung quanh (prolin, estoin,
glycinebetain, saccoza, fructoza), …

Đậu
tƣơng
là cây
t
ƣ
ơng
đối mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh và thuộc
vào nhóm cây chịu hạn kém. Cây đậu
tƣơng

la cây có nhu cầu về
nƣớc
cao
hơn các loại cây trồng lấy hạt khác. Đó chính là do trong hạt và cây đậu
t
ƣ
ơng
có hàm
lƣợng
protein và lipit rất cao, để tổng hợp 1kg chất khô cần 500 - 530
kg nƣớc. Trong quá trình nảy mầm thì nhu cầu về nƣớc của đậu
tƣơng
cũng
khá cao 50%, trong khi đó ở ngô ch là 30% và lúa là 26% [9].

Khi nghiên cứu về các đặc tính chịu hạn của cây đậu
t
ƣ
ơng
về phƣơng
diện sinh lí và di truyền đã cho thấy, các đặc tính này liên quan chặt chẽ đến
đặc điểm hoá keo của nguyên sinh chất, đặc điểm của quá trình trao đổi chất.
Tính chịu hạn của cây đậu
t
ƣ
ơng
mang tính đa gen. Chúng thể hiện ở nhiều
khía cạnh khác nhau:
nhƣ
sự phát triển nhanh của bộ rễ, tính chín sớm

t
ƣ
ơng
đối cũng
nhƣ
bản chất di truyền của từng giống có kh năng sử dụng
nƣớc
tiết
kiệm trong quá trình sinh
tr
ƣ
ởng
và phát triển của cây. cây có thể chống chịu
hạn bằng những biến đổi về hình thái nhƣ lá có nhiều lông, lớp cutin dày, lá
cuộn lại thành ống, để giảm thoát hơi
nƣớc.
Trong môi
tr
ƣ
ờng
khô hạn, cây
có thể chống lại sự mất nƣớc hoặc nhanh chóng bù lại phần nƣớc đã bị mất
nhờ hoạt động của bộ rễ và sự điều chỉnh ASTT của tế bào.

Ở giai đoạn cây con khi gặp hạn, đậu
tƣơng
có thể dễ vƣợt qua hơn,
còn ở những giai đoạn sau
nhƣ
giai đoạn ra hoa, kết quả, hạt chín sữa mà gặp

hạn thì sẽ dẫn đến năng suất giảm đáng kể.

Trong những năm gần đây các nhà khoa học đã có nhiều thành công khi
nghiên cứu sâu hơn về tính chịu hạn của cây đậu tƣơng. Maitra và Cushman
(1994) đã phân lập
đƣợc
cDNA của dehydrin từ lá đậu
tƣơng
khi bị mất nƣớc.
Jinn và các tác gi khác (1997) nghiên cứu về sHSP nhóm 1 (15-18kDa) đã




nhận thấy, chúng tăng lên ở
lƣợng
lớn trong mầm đậu
tƣơng dƣới
tác động của
nhiệt độ đƣợc tìm thấy ở cấu trúc dạng hạt trong nguyên sinh chất và trong
nhân cùng với protein bị biến tính [31]. Năm 2004, nhóm nghiên cứu Huang và
cs (Đài Loan) đã phân lập đƣợc gen P5CS Ở đậu tƣơng từ mARN với kích
thƣớc
2148bp. Gen P5CS là nhân tố giới hạn cho nhịp độ tổng hợp proline ở
thực vật trong điều kiện bất lợi do hạn và do mặn gây nên. Nghiên cứu của
Porcel và cs (2005), đã ch ra rằng, gen mã hoá protein dehydrin (LEA-DII) có
vai trò với kh năng chống chịu hạn của đậu tƣơng. Ở Việt Nam đã có một số
tác gi nghiên cứu kh năng chịu hạn của cây đậ u
tƣơng,
công trinh đanh gia

kh năng chịu hạn của các giống đậu
tƣơng
nhập nội của Nguyễn Huy Hoàng
(1992) phân lập các gen liên quan đến kh năng chịu nóng, chịu hạn của cây
đậu tƣơng. Nghiên cứu phân lập và đọc trình tự gen chaperonin
tƣ


giông đâu
tƣơng
chiu lanh Bonminori - Nhât Ban vơi kich
thƣơc
phân
tƣ
1,6 Kb của
Nông Văn Hai va cs (1997) [34]. Nghiên cứu của Trần Thị
Ph
ƣ
ơng
Liên (1999)
đã phân lập, xác định trình tự gen chaperonin tế bào chất CCTδ từ giống đậu
tƣơng
đột biến M103 với kích
thƣớc
1602 bp mã hóa cho 533 axit amin. Trân
Thị
Ph
ƣ
ơng
Liên và cs (2003), đa phân lâp

đƣơc
gen chaperonin CCT 
t
ƣ
giông đâu
tƣơng
đia
ph
ƣ
ơng
chiu han Cuc Vang , gen nay gôm 1602 nucleotit
mã hóa cho 533 axit amin [10]. Nâng cao tính chịu hạn của cây đậu
tƣơng
bằng
ph
ƣ
ơng
phap đôt biên
thƣc
nghiêm cua Chu Hoang Mâu (2001). Nguyễn Thị
Thu Hiền (2005), phân lập
đƣợc
gen dehydrin với kích
thƣớc
751bp liên quan
đến kh năng chịu hạn từ hai giống đậu tƣơng vàng
M
ƣ
ờng

Kh
ƣ
ơng
và Cao
Bằng 4 [5]. Hoàng Thị Thu Yến và cs (2003), Chu Hoang Mâu va cs (2006) đã
phân lập
đƣơc
gen
chaperonin
của giống đậu
tƣơng
đột biến ML61 [13].




1.2. CHÂT
ƢC
CHÊ CYSTATIN VA GEN CYSTATIN Ơ
THƢC
VÂT VA
CÂY ĐÂU
T
Ƣ
ƠNG


1.2.1. Chât
ƣc
chê Cystatin

1.2.1.1. Giơi thiêu chung

Cystatin là một thuật ngữ đề cập đến các loại protein có kh năng ức
chế đặc hiệu hoạt động của papain và các enzyme phân hủy cysteine (cysteine
proteinase)
nhƣ
Cathesin
B
, H và
L
, ficin va Bromelain. Sự tồn tại của chúng
trong cơ thể vi sinh vật, động vật và các loài thực vật rất phổ biến. Những
protein này đều có mối liên hệ với nhau bởi có những cấu trúc và chức năng
liên quan tới chất ức chế enzyme phân hủy cystatin, lần đầu tiên
đƣợc
chứng
minh tồn tại trong lòng trắng trứng và sau đó đƣợc gọi là cystatin lòng trắng
trứng (Colella et al., 1989) [39]. Cystatin là chất ức chế có bản chất protein
[30]. Chúng có mặt trong vi sinh vật, động vật, thực vật, là chất ức chế
cysteine proteinase.
Các nghiên cứu chứng minh rằng cysteine proteinase
đƣợc
phân tách
từ ấu trùng của các côn trùng có thể
đƣợc
ức chế bởi c bởi non-proteinaceous
và proteinaceous cystatin. Một số thành viên trong lợp bọ cánh cứng bao gồm
côn trùng ăn củ, hạt, rễ và lá. Sự tồn tại của cysteine proteinase trong ruột của
côn trùng để phân giải các protein có chứa trong thức ăn của chúng, đã chứa

c phytocytatin
nhƣ
là các protein liên quan đến cơ chế phòng chống đối với
ngoại cảnh (Abe et al., 1992; Gillikin et al., 1992; Waldron et al., 1993;
Gruden et al., 2004) [22], [40], [41], [42]. Hiệu ứng của chất gây ức chế
enzyme phân hủy protein trên bộ máy tiêu hóa của côn trùng là một lĩnh vực
nghiên cứu rất quan trọng và những kết qu thu
đƣợc
có sức thuyết phục lớn
trong lĩnh vực phòng chống côn trùng trong sinh thái học.




Các chất ức chế phân hủy protein Cys đóng vai trò quan trọng trong
thực vật, từ việc kiểm soát các quá trình sinh lý khác nhau và các quá trình
sinh tổng hợp trong tế bào ở thực vật tới việc gây ức chế của các enzyme
p
hân
hủy Cys ngoại sinh vẫn còn là những dấu hỏi bên trong các động vật chân đốt
ăn thực vật và các loại sinh vật gây bệnh khác để tiêu hủy hoặc là tái hợp các
mô thực vật.
1.2.1.2. Phân loại Cystatin

Cystatin thực vật
đƣợc
mô t lần đầu tiên ở lúa vào năm 1987 bởi Abe
và cs. Các cystatin tìm thấ y co môi liên quan đên nhau tạo thành “liên họ
cystatin”. Các thành viên của liên họ cystatin có thể
đƣợc

chia thành ba họ
protein có liên hệ mật thiết với việc tạo thành các cystatin động vật (Barrett et
al., 1986; Barret 1987) [23], [24] và một họ thuộc cystatin thực vật. Hiên nay
ngƣơi
ta phân chia cystatin thanh 3 họ
nhỏ
. Việc phân chia trong các họ dựa
trên tính chất
t
ƣ
ơng
tự về trình tự cấu trúc cơ sở, khối
lƣợng
phân tử, số lƣợng
các cầu nối disulfide và sự định vi của chúng trong tế
bào
.
Họ Cystatin-1
thƣờng đƣợc
biết đến
nhƣ
là họ stefin gôm cac đơn miên
với khối
lƣợng
phân tử khoảng 11 kDa, không chứa các cầu nối disulfide và
các nhóm carbohydrate, phân tử bao gồm khoảng 100 axit amin và là các
enzyme phân giải protein cytosolic (cytosolic proteinase) (Machleidt et al.,
1983; Sato et al., 1990) [43], [44].

Họ Cystatin -2 hay còn gọi là họ cystatin gôm các đơn miền với khối

lƣợng phân tử khoảng 13 - 24 kDa, họ này chứa hai liên kết disulfide trong
chuỗi ở gần carbon cuôi cung va
đƣơc
glycosyl hóa. Cystatin có 2 khoảng xấp
x 115 axit amin.
Họ Cystatin- 3 hay họ Kininogen , chứa các kininogen tê bào chất
của
tế
bào hồng cầu và là các cystatin phức tạp nhất với khối lƣợng phân tử cao
hơn (60 - 120 kDa). Các protein này có chứa các miền gối lên nhau tạo ra từ




việc nhân đôi vật liệu di truyền của Cystatin họ- 2. Chuỗi kết hợp của chúng
chứa khoảng 355 axit amin. Kininogen đóng một vai trò quan trọng trong quá
trình đông máu. Tất ca các loại cystatin với cấu trúc nguyên thủy đã đƣợc
chứng minh rõ ràng rằng có chứa pentapeptide Gln-Val-Val-Ala-Gly (trong
hầu hết các loại cystatin họ - 1 và họ - 3) và các chuỗi đồng đẳng
đƣợc
tìm
thấy trong các chất ức chê cysteine proteinase khác trong họ - 2 (Barrett et al.,
1986) [23]. Các chuỗi Phe -Ala-Val định vi gần cực carboxyl và dipeptide
Phe-Try, gần cực amino
đƣợc
giữ trong họ- 2
nhƣng
hầu
nhƣ
vắng mặt trong

họ - 1 và họ - 3. Có thể kết luận rằng các khu vực pentapeptide và dipeptide
có thể quan trọng trong việc gắn kết với cysteine proteinase (Machleidt et al.,
1989; Turk et al., 1997) [45], [46].

Ngoài 3 họ trên,
dƣa
vao
sƣ
khac nhau
giƣa cystatin
phân lâp
tƣ
đông vât
và cystatin phân lập từ thực vât,
ngƣơi
ta bô sung thêm môt họ Cystatin 4.
Cystatin họ - 4 hay còn gọi là phytocystatin (Turk and Bode, 1991; Turk et al.,
1997) [46], [47] chứa hầu hết tất c chất ức chế cysteine proteinase thực vật.
Họ protein này sở hữu các tính chất mà có thể đƣợc tìm thấy ở hầu hết trong
cystatin họ - 1 và họ - 2. Chất gây ức chế cysteine proteinase của thực vật có
thể chia thành hai nhóm: Một
đƣợc
tạo thành bởi phytocystatin mà chứa miền
đơn, tạo nên phần lớn phytocystatin. Loại thứ hai sở hữu các đa miền, ví dụ, đa
cystatin
đƣợc
phân lập từ cuống củ khoai tây (Walsh and Strickland, 1993) [48]
và cystatin từ lá cây cà chua (Bolter, 1993) [26]. Một số nhà nghiên cứu chứng
minh rằng phytocystatin là các protein gây ức chế
nh

ƣ
ng
thể hiện sự ức chế
không cạnh tranh với papain. Phytocystatin đã đƣợc phát hiện trong các loại
thực vât bậc cao trong c thực vật một lá mầm và hai lá mầm
nhƣ
lúa, ngô, đậu
tƣơng, khoai tây, dứa, Khối
lƣợng
phân tử của phytocystatin đã tinh sạch
khoảng 5 đến xấp x 87 kDa và rất bền với nhiệt độ và pH cao




Trong số các cystatin thực vật, oryzacystatin từ hạt lúa là chất ức chế
đầu tiên của thực vật mà đƣợc coi nhƣ là thành viên của liên họ cystatin có
liên quan đến cấu trúc cystatin lòng trắng trứng (Barret et al., 1986) [23].
Oryzacystatin là loại cystatin thực vật lần đầu tiên
đƣợc
nghiên cứu kỹ nhất,
có thể
đƣợc
xấp vào họ cystatin - 1 và 2. Các đặc điểm phổ biến giữa
oryzacystatin và cystatin họ -1 bao gồm: Sự thiếu cầu nối disulfide, peptide
bậc 5 đƣợc tạo thành bởi chuỗi Gln-Val-Val-Gly và khối
lƣợng
vào khoảng
11,5 kDa với 102 axit amin. Ngoài ra một số loại cystatin cùng
đƣợc

phân lập
và đọc trình tự, một số cystatin thể hiện tính đồng đẳng với các chất ức chế
cysteine proteinase serine. Trong củ khoai tây có thể tìm thấy chất ức chế
cysteine proteinase, nó thể hiện một nhóm protein khác biệt có thể thuộc về
họ ức chế trypsin loại Kunitz trong đậu tƣơng. Chúng có trình tự bảo thủ
(Gln-X-Val-Y-Gly) mà
th
ƣ
ờng
đặc
trƣng
cho liên họ cystatin (Stubba et al.,
1990; Hanato et al., 1996, 1998) [29], [49], [50], [51].

1.2.1.3. Cấu trúc, chức năng của Cystatin thực vật

Cystatin thực vật đƣợc mô t lần đầu tiên ở lúa vào năm 1987 bởi Abe
và cs. Cystatin thực vật là một đối
tƣợng đƣợc
tập trung nghiên cứu nhiều nhất
từ hơn vài thập kỷ
trƣớc
trở lại đây. Khi stress han xay ra , môt sô protein bị
biến tính và tổn
th
ƣ
ơng.
Cysteine protease tham gia loại bỏ các protein biến
tính. Cysteine protease là enzyme có vai trò thiết yếu trong quá trình sinh
tr

ƣ
ởng
và phát triển của thực vật, sự già và chết theo
ch
ƣ
ơng
trình của tế bào,
trong sự tích lũy protein dự trữ trong hạt, huy động protein dự trữ và kh năng
chống chịu với những stress của môi
tr
ƣ
ờng.
Cysteine protease tham gia vào sự
hoàn thiện protein, tái tạo protein và loại bỏ protein biến tính nhằm giúp cây
thích ứng với những tác động của môi
tr
ƣ
ờng
bên ngoài. Quá trình này có thể
bị cản trở bởi các chất ức chế cysteine protease
(đƣợc
gọi là cystatin) [30], [38].




Vê cấu trúc, cystatin thực vật hay còn gọi là phytocytatin (Kondo et al.,

1991) [52] là các chất ức chế protein cạnh tranh thuộc họ enzyme phân huỷ
(Cys protease) Cys C1A (giống

nhƣ
papain) có nhánh với liên họ cystatin, có
tên viết chung là Gln-X
aa
-Val-X
aa
-Gly kiêu nằm trong khu vực trung tâm của
chuỗi peptide (mà Xaa là bất kỳ một axit amin nào), một Pro-rp (hay Leu-
Trp) dipeptide kiêu nằm ở khu vực đầu C-terminal và một đầu Gly trong khu
vực N-terminal [23], [47]. Cấu trúc bậc ba của ozycystatin là cystatin thực vật
đầu tiên đƣợc nghiên cứu sâu nhất (Abe et al., 1987; Arai et al., 2000) [20],
[21] chứa 5 dải β chứa các chuỗi đối song bọc quanh xoắn kép α
tƣơng
tự
nh
ƣ
xoắn bậc ba trong cystatin động vật (Nagata et al., 2000) [53]. Cystatin ức chế
hình thành nên một phức hợp đồng đẳng vê câu truc phân tử
ng
ƣ
ợc
với
enzyme phân giải Cys, đóng vai trò
nhƣ
chât nền để xâm nhập vào miền hoạt
hóa của enzyme đích và ngăn chặn việc đi vào các nền protein khác. Từ các
cấu trúc và chức năng của mô hình cystatin động vật, hoạt tính ức chế của
những protein này có đƣợc bởi cấu trúc không gian ba chiều hình thành nên
dạng hình cha c ba đƣợc cắm vào trong miền hoạt hóa enzyme đích (Bode et
al., 1988; Stubbs et al., 1990) [25], [49]. Thành phần cấu trúc đầu tiên, mà có

tƣơng tác vật lý với các miền hoạt hóa đích, có chứa vòng kẹp tóc bề mặt
mang kiêu bảo thủ Gln-Xaa-Val-Xaa-Gly
(tƣ
Gln-53 đến Gln-57 trong
cystatin lòng trắng trứng). Thành phần thứ hai, cũng đi vào miền hoạt hóa có
chứa một vòng kẹp tóc bề mặt trong khu vực C-terminal chứa kiêu bảo thủ
Pro (Leu)-Trp (Pro-103 và Trp-104 trong cystatin trứng). Thành phần thứ ba,
nằm trong khu vực N-terminal, chứa đoạn bảo thủ Gly (Gly-9 trong cystatin
của trứng) đặc
trƣng
cho kh năng hoạt động ức chế. Phần protein này không
xâm nhập vào khe hoạt hóa,
nhƣng
lại đóng góp rất đáng kể tới quá trình liên
kết và ảnh
h
ƣ
ởng
mạnh tới tinh đặc hiệu của Cystatin với enzyme phân hủy
protein Cys (Cys protease).