đánh giá khả năng chịu hạn và phân lập gen cystatin liên quan đến tính chịu hạn ở cây đậu tương

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN VÀ PHÂN LẬP
ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN VÀ PHÂN LẬP
GEN CYSTATIN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN
GEN CYSTATIN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN
Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG (
Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merrill)
Người hướng dẫn khoa học : PGS.TS CHU HOÀNG MẬU
Thái nguyên 10/2010
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
HÀ THỊ PHƯỢNG

Më ®Çu


TỔNG QUAN TÀI LIỆU

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
NỘI DUNG TRÌNH BÀY

Cây Đậu tương Glycine max (L.) Merrill, có vị trí quan
trọng trong cơ cấu cây trồng nông nghiệp

Khí hậu nước ta phức tạp, tác động bất lợi đến cây trồng
Më ®Çu

Đậu tương thuộc nhóm chịu hạn kém. Đã có nhiều nghiên

cứu tìm hiểu đặc tính chịu hạn và cơ sở phân tử của đặc tính
này để tuyển chọn giống chất lượng, chịu hạn. Tuy nhiên, sự
hiểu biết về gen liên quan đến chịu hạn còn ít và chưa đầy đủ
1. Lý do chọn đề tài

Cystatin và gen cystatin được xác định có liên quan với khả
năng chịu hạn của thực vật và đã được nghiên cứu ở nhiều
loài cây trồng khác nhau Vậy gen cystatin liên quan thế nào
đến khả năng chịu hạn của đậu tương?

Mục đích: Đánh giá khả năng chịu hạn và phân lập gen
cystatin liên quan đến tính chịu hạn ở cây đậu tương
2. Mục tiêu :

Xác định khả năng chịu hạn và phân nhóm về mức độ
chịu hạn của các giống đậu tương ngiên cứu.

Phân tích đặc điểm gen cystatin liên quan đến tính
chịu hạn của cây đậu tương.
3. Nội dung:

Xác định khả năng phản ứng với hạn của các giống đậu
tương ở giai đoạn cây non trong điều kiện hạn nhân tạo;

Tách ARN tổng số từ hạt đậu tương ở giai đoạn hạt non;

Thu thập thông tin về gen cystatin, thiết kế và tổng hợp
cặp mồi để nhân gen cystatin;

Tạo dòng cADN từ mARN bằng phản ứng phiên ma ngược

và nhân gen cystatin bằng kĩ thuật PCR;

Đọc trình tự nu của gen cystatin ở cây đậu tương.
Më ®Çu
Đề tài luận văn đã tổng kết 56 tài liệu có liên quan thể hiện
một số vấn đề sau:

Đặc điểm, giá trị kinh tế và tình hình sản xuất của cây đậu
tương

Đặc tính chịu hạn của thực vật và cây đậu tương

Gen cystatin liên quan đến tính chịu hạn ở đậu tương
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Cystatin và gen cystatin
Cystatin và gen cystatin

Cystatin là chất ức chế có bản chất protein, có khả năng ức
chế đặc hiệu hoạt động của papain và các enzyme phân hủy
cysteine (cysteine proteinase).

Khi stress hạn xảy ra, một số protein bị biến tính và tổn
thương. Cysteine protease tham gia loại bỏ các protein biến
tính; tham gia hoàn thiện, tái tạo protein nhằm giúp cây thích
ứng với những tác động của ngoại cảnh. Quá trình này có thể
bị cản trở bởi cystatin.

Sự biểu hiện của gen cystatin thường trong điều kiện hạn,
lạnh, mặn và ở các pha riêng rẽ của quá trình sinh trưởng,
phát triển của thực vật.


Do vậy, phân lập gen cystatin nhằm tạo cơ sở cho việc
nghiên cứu làm giảm sự tích luỹ cystatin là rất cần thiết.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
STT Tên giống Nguồn gốc
1 Thái Nguyên Thái Nguyên
2 DT84 Viện di truyền
3 Bản Dốc Cao Bằng
4 Vàng Bắc Hà Yên Bái
5 Cúc Tuyển Bắc Giang
VẬT LIỆU
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Các loại hóa chất, thiết bị dùng cho các thí nghiệm phân tích hoá sinh
và sinh học học phân tử: gồm các loại mua của các hãng Anh, Đức, Mỹ,
Trung Quốc

Các thí nghiệm được thực hiện tại Phòng Công nghệ tế bào Thực
vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đánh gía khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non bằng phương pháp
gây hạn nhân tạo, theo phương pháp của Lê Trần Bình và cs (1998)
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phương pháp sinh học phân tử
Phương pháp sinh học phân tử

PP tách chiết RNA tổng số
PP tách chiết RNA tổng số từ hạt ở quả đậu tương non


Phương pháp điện di RNA trên gel agarose
Phương pháp điện di RNA trên gel agarose

Phương pháp RT-PCR
Phương pháp RT-PCR

Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR
Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR

Phương pháp gắn gen vào vector tách dòng
Phương pháp gắn gen vào vector tách dòng

Biến nạp vector tái tổ hợp vào TB khả biến E.coli DH5α
Biến nạp vector tái tổ hợp vào TB khả biến E.coli DH5α

Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (clony-PCR)
Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (clony-PCR)

Tách chiết plasmid
Tách chiết plasmid

Phương pháp xác định trình tự nucleotide
Phương pháp xác định trình tự nucleotide
2.3.3. Phương pháp xử lí số liệu
2.3.3. Phương pháp xử lí số liệu



Phương pháp thống kê bằng chương trình Excel

Phương pháp thống kê bằng chương trình Excel

Phương pháp xử lý trình tự gen
Phương pháp xử lý trình tự gen
kÕt qu¶ VA THAO LUÂǸ ̉ ̣
Hình 3.1. Hạt của 5 giống đậu
tương
Đặc điểm hình thái, kích thước và khối lượng hạt
kÕt qu¶ VA THAO LUÂǸ ̉ ̣
Bảng 3.1. Màu sắc, số lượng và khối lượng hạt của 5
giống đậu tương nghiên cứu
Đặc điểm hình thái, kích thước và khối lượng hạt 5 giống
đậu tương nghiên cứu
Giống
Màu vỏ
hạt
Màu rốn
hạt
Số lượng
Khối lượng
1000 hạt (g)
Quả / cây Hạt / cây
Thái
Nguyên
Vàng Đen 79,6 144,2 68
DT84 Vàng Nâu 73 155,2 145
BD
Vàng phớt
xanh
Nâu 71 136,4 70

BH Vàng Đen 48,8 78,8 106
Cúc
Tuyển
Vàng Đen 107,8 195,4 68
Sau 5 ngày
Sau 7 ngày Sau 9 ngày
Hình 3.2. Hình ảnh cây đậu tương non 3 lá
A. trước khi xử lí bởi hạn; B. sau khi xử lý hạn
Khả năng chịu hạn của giống đậu tương
B
A
kÕt qu¶ VA THAO LUÂǸ ̉ ̣
Khả năng chịu hạn của giống đậu tương
Bảng 3.2. Khả năng chịu hạn của 5 giống đậu tương nghiên cứu
Khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non 3 lá: BD > BH> TN> CT> DT84
STT Tên giống Chỉ số chịu hạn
tương đối (%)
Số ngày hạn cây
chết 100 %(ngày)
1 Thái Nguyên
1682,99
13
2 DT84
215,07
11
3 Bản Dốc
3595,77
15
4 Vàng Bắc Hà
1880,13

14
5 Cúc Tuyển
262,07
12
kÕt qu¶ VA THAO LUÂǸ ̉ ̣
Hình 3.3. Kết quả tách
chiết RNA tổng số
3.2.1. Kết quả tách chiết ARN tổng số
2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN CYSTATIN
Ở GIỐNG ĐẬU TƯƠNG THÁI NGUYÊN
Chương 3. kÕt qu¶ VA THAO LUÂǸ ̉ ̣
bp
1000
750
Hình 3.4.
Hình 3.4.
Kết quả PCR
Kết quả PCR
nhân gen cystatin từ hạt
nhân gen cystatin từ hạt
non của giống đậu tương
non của giống đậu tương
Thái Nguyên
Thái Nguyên
3.2.2. Kết quả khuếch đại gen cystatin
Hình 3.5.
Hình 3.5. Hình ảnh khuẩn lạc
3.2.3. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến
E.coli DH5α
kÕt qu¶ VA THAO LUÂǸ ̉ ̣

3.2.4. Kết quả chọn dòng tế bào mang vector tái tổ hợp
750
M 1 2 3 4
1000
bp
Hình 3.6. Sản phẩm
clony-PCR
clony-PCR
738
M: Marker 1Kb
; Các giếng còn lại:
; Các giếng còn lại:
Plasmid tái tổ hợp tách từ dòng khuẩn lạc
Plasmid tái tổ hợp tách từ dòng khuẩn lạc
trắng ký hiệu 1,2, 3 và 4.
trắng ký hiệu 1,2, 3 và 4.
H.3.7. Kết quả tách plasmid tái tổ
H.3.7. Kết quả tách plasmid tái tổ
hợp từ các dòng khuẩn lạc trắng
hợp từ các dòng khuẩn lạc trắng
3.2.5. Kết quả tách chiết plasmid tái tổ hợp
M 1 2 3 4
kÕt qu¶ VA THAO LUÂǸ ̉ ̣
750
M 1 2 3
M: Marker 1Kb; Giếng
1: Plasmid không mang
đoạn DNA (đối chứng âm);
Giếng 2;3: Plasmid mang
đoạn ADN chèn vào.

H.3.8. Kết quả cắt plasmid
bằng enzyme giới hạn BamHI
3.2.6. Kết quả kiểm tra các dòng plasmid
738
kÕt qu¶ VA THAO LUÂǸ ̉ ̣
3.2.7. Kết quả đọc trình tự nucleotit

Đọc trình tự nucleotit trên máy xác định trình tự ADN tự
động ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analizer, xử lí bằng
phần mề̀m DNAstar.

So sánh trình tự này trong BLAST của ngân hàng NCBI,
kết quả cho thấy đây là trình tự gen cystatin của đậu tương
kích thước mong muốn dài 738 bp
SO SÁNH TRÌNH TỰ NU CỦA GEN CYSTATIN CỦA GIỐNG ĐẬU
TƯƠNG THÁI NGUYÊN VỚI 4 GIỐNG ĐẬU TƯƠNG TRÊN GENBANK
70 80 90 100 110 120

| | | | | | | | | | | |
AK246065 TTCCTCTCCATTCTCTTCGCTCTTCGATCCTCGTCCGGGGGCTGCTCCGAATACCACCAC
BT098957 TTCCTCTCCATTCTCTTCGCTCTTCGATCCTCGTCCGGGGGCTGCTCCGAATACCACCAC
D31700 TTCCTCTCCATTCTCTTCGCTCTTCGATCCTCGTCCGGGGGCTGCTCCGAATACCACCAC
D64115 TTCCTCTCCATTCTCTTCGCTCTTCGATCCTCGTCCGGGGGCTGCTCCGAATACCACCAC
Thái Nguyên TTCCTCTCCATTCTCTTCGCTCTTCGATCCTCGTCCGGGGGCTGCTCCTAATACCACCAC
130 140 150 160 170 180

| | | | | | | | | | | |
AK246065 CACCACGCGCCGATGGCCACGATAGGAGGCTTACGCGACTCCCAAGGCTCTCAGAACAGC
BT098957 CACCACACGCCGATGGCCACGATAGGAGGCTTACGCGACTCCCAAGGCTCTCAGAACAGC
D31700 CACCACGCGCCGATGGCCACGATAGGAGGCTTACGCGACTCCCAAGGCTCTCAGAACAGC

D64115 CACCACGCGCCGATGGCCACGATAGGAGGCTTACGCGACTCCCAAGGCTCTCAGAACAGC
Thái Nguyên CACCACGCGCCGATGGCCACGATAGGAGGCTTACGCGACTCCCAAGGCTCTCAGAACAGC
190 200 210 220 230 240

| | | | | | | | | | | |
AK246065 GTCCAAACCGAGGCCCTCGCTCGATTCGCCGTCGATGAACACAACAAGAAGCAGAATTCA
BT098957 GTCCAAACCGAGGCCCTCGCTCGATTCGCCGTCGATGAACACAACAAGAAGCAGAATTCA
D31700 GTCCAAACCGAGGCCCTCGCTCGATTCGCCGTCGATGAACACAACAAGAAGCAGAATTCA
D64115 GTCCAAACCGAGGCCCTCGCTCGATTCGCCGTCGATGAACACAACAAGAAGCAGAATTCA
Thái Nguyên GTCCAAACCGAGGCCCTCGCTCGATTCGCCGTCGATGAACACAACAAGAAGCAGAATTCA
kÕt qu¶ VA THAO LUÂǸ ̉ ̣
Bảng: Hệ số tương đồng và hệ số khác nhau của trình tự
gen cystatin Thái Nguyên với trình tự gen cystatin của 9
giống đậu tương công bố trên GenBank.
kÕt qu¶ VA THAO LUÂǸ ̉ ̣
Biểu đồ hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền của
10 giống đậu tương
kÕt qu¶ VA THAO LUÂǸ ̉ ̣

So với gen cystatin mã số D31700; AK246065;
D64115: khác 1 nucleotide (ở vị trí nu 109) dẫn tới sự
thay đổi 1 axit amin
SO SÁNH TRÌNH TỰ AXIT AMIN DO GEN CYSTATIN
MÃ HÓA CỦA GIỐNG ĐẬU TƯƠNG THÁI NGUYÊN VỚI
4 GIỐNG ĐẬU TƯƠNG TRÊN GENBANK

So với gen cystatin mã số BT098957 : khác 2 nucleotide ở
2 vị trí nucleotide 109 và 207) dẫn tới sai khác 2 axit amin.
Bộ ba GAA
(mã hóa aa

Glutamic)

Ở vị trí nucleotide số 109: G thay bằng T. Do đó:
Bộ ba TAA
(kết thúc
dịch mã)
1. Trong quá trình tổng hợp cDNA từ mRNA, hay nhân gen PCR có sự
lắp ghép sai một nucleotide, ở vị trí nu 109 G thay bằng T;
3. Gen cystatin phân lập từ ADN (4 exon và 3 intron). Trình tự gen
cystatin giống nghiên cứu tách từ mRNA tương đồng với trình tự nu ở
4 exon. Khi phiên mã tổng hợp mRNA, các đoạn không mã hóa và mã
hóa đều được sao thành phân tử tiền mRNA. Qua giai đoạn cắt bỏ các
đoạn intron và nối các exon lại với nhau của phân tử tiền mRNA tạo
ARN hoàn chỉnh có thể dẫn tới sự sai sót trên.
2. Trong quá trình tái bản hoặc phiên mã gen bị đột biến thay thế một
nucleotide;
4. Ở khả năng do đột biến thay thế thì đoạn polypeptide được dịch mã là
36 axit amin; vì chuỗi polypeptide được suy từ trình tự nucleotide của
cADN ( phiên mã từ mARN) nên rất có thể xảy ra:

Cystatin hoàn chỉnh không được tổng hợp nên cysteine
proteinase không bị ức chế.

Đoạn polypeptide gồm 36 axit amin có thể tham gia trong các
hoạt động sinh lý, hóa sinh của tế bào
SỰ THAY THẾ G BỞI T CÓ THỂ XẢY RA MỘT SỐ KHẢ NĂNG:
KẾT LUẬN
5. So với 9 trình tự nu của gen cystatin đậu tương trên
genbank thấy trình tự nu của gen cystatin giống đậu tương TN
có độ tương đồng dao động từ 94,5% - 99,8%.

2. Ở giai đoạn cây non ba lá, 5 giống nghiên cứu phản ứng
khác nhau với hạn. Chỉ số chịu hạn tương đối (215,07 -
3595,77). Khả năng chịu hạn: BD> BH > TN> CT> DT84.
3. Đã thiết kế cặp mồi và khuếch đại thành công gen cystatin
từ mARN tách chiết ở hạt non của giống đậu tương TN
4. Gen cystatin của giống đậu tương TN(738 bp), xuất hiện đột
biến thay thế ở vị trí nu thứ 109 làm bộ ba GAA thay bằng
TAA (mã kết thúc) và chuỗi polypeptit tổng hợp chỉ có 36 aa.
1. Các giống đậu tương nghiên cứu đa dạng về hình thái
hạt, số quả và số hạt. Khối lượng 1000 hạt của 5 giống:
DT84> BH> BD> CT = TN.
ĐỀ NGHỊ

Tiếp tục nghiên cứu cấu trúc của gen cystatin
ở các giống đậu tương khác.


Đặc biệt so sánh cấu trúc gen cystatin của
giống đậu tương thuộc nhóm chịu hạn tốt với
giống đậu tương chịu hạn kém, để xác định mối
liên quan giữa sự thay đổi cấu trúc gen với đặc
tính chịu hạn của cây đậu tương.