Nghiên cứu đặc điểm sinh học và một số điều kiện lên men sinh tổng hợp Validamycin A của xạ khuẩn Streptomyces hygroscopicus 11405

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN THỊ HUYỀN









NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ MỘT SỐ
ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SINH TỔNG HỢP VALIDAMYCIN A
CỦA XẠ KHUẨN Streptomyces hygroscopicus 11405








LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2013







Số hóa bởi Trung tâm Học liệu



ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC







NGUYỄN THỊ HUYỀN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ MỘT SỐ
ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SINH TỔNG HỢP VALIDAMYCIN A
CỦA XẠ KHUẨN Streptomyces hygroscopicus 11405



Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã Số: 60 42 02 01


LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC



NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. PHÍ QUYẾT TIẾN







Thái Nguyên - 2013

i

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan: Luận văn này là công trình nghiên cứu thực sự của
cá nhân, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Phí Quyết
Tiến. Các số liệu, những kết luận nghiên cứu được trình bày trong luận văn
này là trung thực.

Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình.

Thái Nguyên, tháng 8 năm 2013
Học viên



Nguyễn Thị Huyền

ii

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo
trường Đại học Khoa học- Đại học Thái Nguyên đã truyền đạt cho tôi những
kiến thức quý giá trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Phí Quyết Tiến đã tạo mọi điều
kiện thuận lợi, dìu dắt tận tình, động viên, chỉ bảo trong suốt quá trình tôi học
tập, nghiên cứu và hoàn thành Luận văn tại Phòng Công nghệ lên men, Viện
Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Đồng thời tôi cũng cảm ơn TS. Phan Thị Hồng Thảo, ThS. Nguyễn Thị
Hồng Liên cùng các cán bộ phòng công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh
học, những người đã động viên, giúp đỡ, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện cho tôi
trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình, bạn bè,
đồng nghiệp những người đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi cả về vật chất lẫn tinh
thần để tôi có thể hoàn thành bản Luận văn này.
Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quí
báu đó!
Thái Nguyên, tháng 08 năm 2013
Học viên

Nguyễn Thị Huyền
iii

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM ƠN ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi
DANH MỤC CÁC BẢNG vii
DANH MỤC CÁC HÌNH viii
MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Tổng quan về chất kháng sinh và validamycin A 3
1.1.1. Khái niệm chất kháng sinh 3
1.1.2. Một số cơ chế tác động của chất kháng sinh đối với vi sinh vật 5
1.1.3. Kháng sinh bảo vệ thực vật 8
1.1.4. Validamycin A 9
1.2. Xạ khuẩn sinh validamycin A 13
1.2.1. Đặc điểm của xạ khuẩn 13
1.2.2. Thời điểm sinh kháng sinh của xạ khuẩn 19
1.2.3. Một số đặc trưng cơ bản của xạ khuẩn có khả năng sinh validamycin
A 20
1.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng lên men sinh validamycin A của xạ
khuẩn 21
1.3.1. Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men 21
1.3.2. Ảnh hưởng của điều kiện lên men 23
1.4. Tình hình nghiên cứu sinh tổng hợp validamycin A trong và ngoài
nước…………………………………………………………………….24

1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 24
1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 25
CHƢƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29
iv

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

2.1. Vật liệu 29
29
2.1.2. Hóa chất sử dụng 29
29
2.1.4. Thành phần môi trường nuôi cấy 30
2.2. Phương pháp nghiên cứu 30
2.2.1. Phương pháp giữ giống 30
2.2.2. Nhân giống xạ khuẩn 30
2.2.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của xạ khuẩn 31
2.2.4. Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa 32
2.2.5. Phương pháp thu hồi dịch validamycin A thô 34
2.2.6. Xác định hoạt tính validamycin A 34
2.2.7. Lựa chọn môi trường lên men thích hợp cho sinh tổng hợp validamycin
A 35
2.2.8. Xác định điều kiện lên men sinh validamycin A của xạ khuẩn trong
bình tam giác 35
2.2.9. Xác định ảnh hưởng của thời gian lên men sinh tổng hợp validamycin
A 35
2.2.10. Nghiên cứu đặc tính và độ bền của validamycin A 36
2.2.11. Xác định khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của dịch validamycin
A thô 36
2.2.12. Phương pháp xử lý số liệu 36
CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

3.1. Nghiên cứu lựa chọn chủng xạ khuẩn thích hợp cho sinh tổng hợp val-A37
3.1.1. Đặc điểm sinh học sơ bộ của hai chủng xạ khuẩn sử dụng trong nghiên
cứu 37
3.1.2. Khả năng sinh enzyme protease, cellulase và amylase của hai chủng xạ
khuẩn 39
3.1.3. Khả năng sinh tổng hợp validamycin A của hai chủng xạ khuẩn 40
v

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

3.1.4. Biến động tự nhiên về hoạt tính kháng sinh của hai chủng xạ khuẩn 43
3.2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng S. hygroscopicus 11405 46
3.2.1. Đặc điểm nuôi cấy và hình thái của xạ khuẩn S. hygroscopicus
11405 46
3.2.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của xạ khuẩn S. hygroscopicus 11405 48
3.3. Nghiên cứu thành phần môi trường và điều kiện lên men của chủng S.
hygroscopicus 11405 50
3.3.1 Lựa chọn môi trường lên men 50
3.3.2. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng sinh validamycin A của
chủng S. hygroscopicus 11405 51
3.3.3. Lựa chọn tỷ lệ tiếp giống cho lên men sinh tổng hợp validamycin A 52
3.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp
validamycin A 52
3.3.5. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp validamycin
A…… 53
3.4. Đặc điểm của dịch validamycin A thô 54
3.4.1. Khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh 54
3.4.2. Độ bền nhiệt và bền pH của dịch validamycin A thô 55
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59
PHỤ LỤC 65

vi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Tên viết tắt
Tên đầy đủ
ADN
Acide deoxyribonucleic
ARN
Acide ribonucleic
BVTV
Bảo vệ thực vật
CKS
Chất kháng sinh
Đ
VVK

Đường kính vòng vô khuẩn
HTKS
Hoạt tính kháng sinh
IU
International Unit
KTCC
Khuẩn ty cơ chất
KTKS

Khuẩn ty khí sinh
MT
Môi trường
Val-A
Validamycin A







vii

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Đặc điểm nuôi cấy của hai chủng xạ khuẩn sử dụng trong nghiên
cứu 37
Bảng 3.2. Khả năng ức chế nấm R. solani của hai chủng S. hygroscopicus
11405 và S. hygroscopicus CNLM 41
Bảng 3.3. Bảng so màu khuẩn lạc của chủng S. hygroscopicus 11405 trên các
môi trường nuôi cấy tại các thời điểm khác nhau 47
Bảng 3.4. Khả năng đồng hoá nguồn carbon của chủng S. hygroscopicus
11405 49
Bảng 3.5. Khả năng chịu muối, chịu nhiệt độ và khoảng pH thích hợp cho
sinh trưởng của xạ khuẩn 50
Bảng 3.6. Phổ kháng VSV của chủng S. hygroscopicus 11405 55
viii

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của val-A 9
Hình 1.2. Cơ chế tác động của val-A đến quá trình chuyển hóa năng lượng ở
vi nấm 11
Hình 1.3. Hình ảnh minh họa sự nảy mầm và phát triển của xạ khuẩn. 17
Hình 1.4. Mối quan hệ giữa các pha sinh trưởng của xạ khuẩn 18
Hình 3.1. Hình ảnh khuẩn lạc của hai chủng xạ khuẩn S. hygroscopicus 11405
và S. hygroscopicus CNLM khi nuôi cấy trên môi trường thạch ISP2 38
Hình 3.2. Khả năng sinh tổng hợp ba loại enzyme ngoại bào của chủng S.
hygroscopicus 11405 (A) và S. hygroscopicus CNLM (B) 40
Hình 3.3. Phổ sắc ký lỏng cao áp (HPLC) của val-A chuẩn (A) và val-A có
trong dịch lên men của chủng S. hygroscopicus 11405 (B) và chủng S.
hygroscopicus CNLM (C) 42
Hình 3.4. Hình ảnh minh họa kết quả sàng lọc tự nhiên về hoạt tính kháng
nấm chủng S. hygroscopicus 11405 (A) và S. hygroscopicus CNLM (B) 43
Hình 3.5. Biến động tự nhiên về hoạt tính kháng sinh kháng nấm R. solani của
chủng S. hygroscopicus 11405 44
Hình 3.6. Biến động tự nhiên về hoạt tính kháng sinh kháng nấm R. solani của
chủng S. hygroscopicus CNLM 45
Hình 3.7. Hình ảnh minh họa hình dạng khuẩn lạc chủng S. hygroscopicus
11405 trên các môi trường nuôi cấy khác nhau 47
Hình 3.8. Cuống sinh bào tử của chủng S. hygroscopicus 11405 chụp bằng
kính hiển vi điện tử quét (độ phóng đại 10.000 lần) 48
Hình 3.9. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng và sinh tổng
hợp val-A 50
Hình 3.10. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh trưởng và sinh tổng
hợp val-A 51
Hình 3.11. Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống đến khả năng sinh val-A 52

ix

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Hình 3.12. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng
hợp val-A 53
Hình 3.13. Ảnh hưởng pH môi trường đến khả năng sinh tổng hợp val-A 54
Hình 3.14. Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt tính của dịch val-A thô 56



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

1
MỞ ĐẦU
Theo thống kê hàng năm trên thế giới, các vi nấm gây các bệnh trên
thực vật như đạo ôn, khô vằn, thối cổ rễ, mốc sương, vàng lụa ở lúa… chiếm
83% trong số các bệnh ở cây trồng [8], [9]. Ở nước ta, diện tích đất canh tác
là 10,13 triệu ha và điều kiện địa lý nằm trong khu vực nhiệt đới nóng ẩm nên
tạo điều kiện thuận lợi cho nhiều vi sinh vật (VSV) phát triển, đặc biệt là các
VSV gây bệnh thực vật. Vì vậy, việc sử dụng phân bón, thuốc trừ sâu hóa học
nhằm tăng năng suất, sản lượng đã dẫn tới thoái hóa đất, tồn dư hóa chất bảo
vệ thực vật, mất cân bằng hệ sinh thái trong đất…
Năm 2003, Việt Nam phải nhập tới 166 triệu USD thuốc bảo vệ thực
vật, trong đó các chất chống nấm chiếm tỷ lệ 28,0% và chủ yếu là thuốc hóa
học. Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, trong danh mục các loại
thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) có nguồn gốc sinh học, đến 6 tháng đầu năm
2007 có 193 sản phẩm được cấp giấy phép đăng ký, nâng tổng số có 479 sản
phẩm sinh học được phép lưu hành, trong đó có 300 loại thuốc trừ sâu và 98
sản phẩm thuốc trừ bệnh. Các sản phẩm này đã góp phần không nhỏ vào công

tác phòng trừ dịch hại, góp phần thay thế và hạn chế dần nguy cơ độc hại do
sử dụng thuốc BVTV nguồn gốc hóa học ảnh hưởng đến sức khỏe con người
và gây ô nhiễm môi trường.
Tại Việt Nam, một trong các loại thuốc bảo vệ thực vật an toàn, có
nguồn gốc sinh học được sử dụng hiệu quả để phòng trừ các loại nấm gây
bệnh cho cây trồng là validamycin, trong đó hiệu quả nhất là validamycin
dạng đồng phân A. Validamycin A (val-A) là một kháng sinh nhóm
aminoglycoside có hoạt tính kháng nấm được sinh tổng hợp chủ yếu bởi
Streptomyces hygroscopicus var. limoneus [25] và S. hygroscopicus subsp.
jinggangensis 5008 [39]. Nhờ hiệu quả phòng trừ nấm cao cũng như an toàn
cho con người và động vật, val-A trở thành một trong những kháng sinh quan
trọng nhất và được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp để trừ bệnh đốm vằn


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

2
hại lúa, bệnh thối nụ, thối rễ ở cây khoai tây, bông, cà chua, nấm hồng trên
cây cao su,… do nấm Rhizoctonia solani, R. oryzae và Sclerotium oryzae-
sativa gây nên. Val-A đang sử dụng ở nước ta chủ yếu được nhập khẩu từ
Trung Quốc dưới các tên thương mại Anlicin, Damycine, Duo xiao meisu,
Haifangmeisu, Iing gang meisu, Romycin, Vacinmeisu, Vacocin, Validacin,
Valitigi, Varison, Vida, Vigangmycin Trong khi việc nghiên cứu và sản
xuất validamycin đã diễn ra ở rất nhiều nước trên thế giới như Trung Quốc,
Nhật Bản, Hàn Quốc… thì ở Việt Nam vấn đề này mới chỉ được quan tâm
nghiên cứu ở khả năng ứng dụng của validamycin.
Xuất phát từ tính cấp thiết và nhu cầu thực tiễn của việc sử dụng val-A,
chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm sinh học và một số điều
kiện lên men sinh tổng hợp validamycin A của xạ khuẩn Streptomyces
hygroscopicus 11045“.

Mục tiêu nghiên cứu: Lựa chọn một chủng xạ khuẩn có khả năng sinh
tổng hợp val-A và nghiên cứu đặc điểm sinh học, một số điều kiện lên men
sinh kháng sinh val-A của xạ khuẩn được lựa chọn.
Nội dung chính của đề tài bao gồm 4 phần:
- Nghiên cứu lựa chọn chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp val-
A cao.
- Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng S. hygroscopicus 11405
được tuyển chọn.
- Nghiên cứu lựa chọn môi trường và điều kiện lên men sinh val-A của
chủng S. hygroscopicus 11405
- Bước đầu nghiên cứu đặc điểm của dịch val-A thô sinh tổng hợp bởi
chủng S. hygroscopicus 11405
Đề tài được thực hiện tại Phòng Công nghệ lên men - Viện Công nghệ
sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

3
CHƢƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về chất kháng sinh và validamycin A
1.1.1. Khái niệm chất kháng sinh
Kháng sinh đầu tiên được nhà bác học người Anh A. Fleming phát hiện
ra vào năm 1929 từ một loài nấm mốc (thuộc chi Penicillium) có khả năng ức
chế sự phát triển tụ cầu khuẩn vàng (Staphylococcus aureus). Loại kháng sinh
này được Fleming gọi là penicillin. Đến năm 1938, H. Florey và E. B. Chain
đã tinh sạch thành công dạng bền vững của penicillin. Cho đến năm 1943,
penicillin được sử dụng trong chiến tranh thế giới thứ hai và đã cứu sống
được rất nhiều người [1], [14]. Tiếp theo penicillin, hàng loạt các chất kháng

sinh khác đã được phát hiện như gramicidin, tyrocidine, streptomycin,
cloramphenicol, cephalosporin, chlortetracyline
Thuật ngữ “antibiotic” được A. Waskman đưa ra năm 1940 (anti- theo
tiếng Hi lạp là kháng lại, bios là sự sống) [42]. Antibiotic (chất kháng sinh-
CKS) là sản phẩm trao đổi chất bậc hai của một loại VSV hoặc một cơ thể bậc
cao có tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt tế bào sinh vật khác (vi khuẩn, protozoa,
tế bào ung thư ) một cách chọn lọc, ngay cả ở nồng độ thấp. Một chất được
xem là CKS nếu:
- Là sản phẩm của quá trình trao đổi chất
- Là các sản phẩm có cấu trúc tương tự như các CKS tự nhiên
- Ức chế sinh trưởng hoặc tiêu diệt một hoặc vài VSV
- Có hiệu lực ở nồng độ thấp
Ngày nay, thuật ngữ kháng sinh được hiểu theo nghĩa rộng hơn:
“Kháng sinh là các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp có tác dụng


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

4
ức chế hoặc tiêu diệt chọn lọc đối với các VSV gây bệnh, đồng thời không có
tác dụng hoặc tác dụng yếu lên người, động vật hoặc thực vật [2].
Trong nghiên cứu, kiểm nghiệm và thu hồi kháng sinh người ta thường
dùng đơn vị kháng sinh (IU, International Unit) để biểu thị hoạt lực tác dụng
của kháng sinh. Một đơn vị kháng sinh là lượng kháng sinh tối thiểu (chế
phẩm tinh khiết ở dạng axit, kiềm hoặc muối tương ứng) có khả năng ức chế
sự phát triển hoặc kìm hãm sự sinh trưởng của một chủng VSV kiểm định
chuẩn trong môi trường lỏng. Ví dụ 1 đơn vị kháng sinh penicilin bằng 0,6
mg benzyl penicillin tinh khiết là lượng kháng sinh tối thiểu kìm hãm sự phát
triển của chủng Staphylococcus aureus 209 trong 50 ml môi trường nước thịt.
Đa số các kháng sinh có 1,0 đơn vị tác dụng bằng 1 mg chế phẩm tinh khiết ở

dạng axit, kiềm hoặc muối tương ứng.
CKS được tạo thành không có một chức năng rõ ràng trong quá trình trao
đổi chất của vi sinh vật vì tế bào vẫn có thể tồn tại và phát triển bình thường
khi không có những hợp chất này. Tuy vậy, trong điều kiện tự nhiên, sự tạo
thành các CKS hoàn toàn có ý nghĩa đối với sự sống còn và sự phát triển của
các VSV. Có quan niệm cho rằng CKS giúp cho bản thân vi sinh vật loại trừ
một số sản phẩm trao đổi trung gian dư thừa [3], [4].
CKS được sinh ra và tiết vào môi trường xung quanh, nhưng cũng có khi
CKS đó lại liên kết chặt chẽ với bào tương của VSV và chỉ được tiết ra khi tế
bào bị phá vỡ hoặc tế bào tự tan (gramicidin, prodigiosin, piocianase, urocidin
và một số kháng sinh từ Aspergillus). Hoạt động sinh tổng hợp CKS bị hạn
chế bởi cơ chế điều hòa ngược. Ngoài ra khả năng sinh kháng sinh của các
chủng VSV khác nhau phụ thuộc vào mức độ bền vững của chủng với CKS
đó [14], [13].
Hiện nay, kháng sinh không chỉ dùng trong y học (chữa bệnh nhiễm
trùng, ung thư, ức chế các loại virut gây bệnh…) mà còn được sử dụng trong
nông nghiệp (phòng chống bệnh, kích thích tăng trưởng cho cây trồng và


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

5
động vật nuôi), trong công nghiệp chế biến và bảo quản lương thực, thực
phẩm. Chính vì những tác dụng to lớn ấy mà từ năm 1928, khi CKS đầu tiên
được tìm ra đến nay, số lượng các CKS mới phát hiện tăng lên trên 8.000 loại
[6], [13].
Cho đến nay, các nhà khoa học công bố đã phát hiện được hơn 10.000
CKS tự nhiên, trong số này khoảng 100 chất do thực vật tạo ra, còn khoảng
hơn 7000 chất do các loài VSV tổng hợp, trong số này khoảng 100 chất đã
được ứng dụng trong y học và một số lĩnh vực khác. Mặt khác, từ những

kháng sinh đã biết các nhà nghiên cứu đã điều chế được hàng ngàn dẫn chất
mới là các kháng sinh bán tổng hợp và trong số này khoảng 50 chất cũng đã
được đưa vào sử dụng. Đồng thời có hai kháng sinh được sản xuất hoàn toàn
bằng tổng hợp hóa học là cloramphenicol và pyrrolnitrin [10], [13], [41].
1.1.2. Một số cơ chế tác động của chất kháng sinh đối với vi sinh vật
Cơ chế tác dụng của CKS là những cách thức mà CKS tác động lên
những vị trí đích khác nhau trong tế bào, qua đó ảnh hưởng đến sự sinh
trưởng của VSV. Cơ chế này phụ thuộc vào bản chất hoá học, nồng độ chất
kháng sinh và cấu trúc của tế bào. Các CKS có bản chất hóa học khác nhau thì
thường có cơ chế tác dụng khác nhau, còn các chất có bản chất hoá học gần
giống nhau thì có phổ kháng VSV tương tự như nhau.
1.1.2.1. Ức chế quá trình tổng hợp thành tế bào của vi sinh vật
Các nhóm CKS có tác dụng ức chế quá trình sinh tổng hợp thành tế bào
của VSV gồm có: penicillin, bacitracin, vancomycin.
Quá trình tổng hợp thành tế bào của VSV là một chuỗi các phản ứng
sinh hóa trải qua khá nhiều giai đoạn với sự tham gia của nhiều loại enzyme
khác nhau. Các enzyme này chính là mục tiêu tấn công của các nhóm CKS
trên. Ví dụ: CKS penicillin và cephalosporin tác động đồng thời cả hai loại
enzyme transpeptidase và cacboxipeptidase. Do cấu hình không gian của CKS


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

6
và một tiền chất cần thiết cho tổng hợp thành tế bào rất giống nhau nên CKS
ức chế cạnh tranh đối với enzyme xúc tác chuyển hóa tiền chất; kết quả là các
enzyme bị mất hoạt tính, các tiền chất tích lũy ngày càng nhiều ở bào tương
tạo ra áp suất thẩm thấu lớn làm vỡ tế bào vi khuẩn.
1.1.2.2. Ức chế các chức năng của màng tế bào vi sinh vật
Các nhóm CKS có tác dụng ức chế các chức năng của thành tế bào

VSV gồm có: colistin, polymyxin, gentamicin, amphoterricin.
Cơ chế tác dụng: Các CKS bám vào và phá vỡ các tổ chức thành tế bào
khiến cho các phân tử có khối lượng lớn và các ion thoát ra ngoài, dẫn đến
VSV không thể thực hiện được quá trình trao đổi chất với môi trường. Các
CKS nhóm polypeptide (gramicidin, colistin, polymixin…) có thể phá hủy
phospholipid của thành tế bào, làm cho các chất rò rỉ ra khỏi tế bào dẫn đến tế
bào bị chết. Các CKS nhóm polyene (nystain, amphotericin, philipin…) tác
dụng lên thành phần sterol của màng nguyên sinh chất của tế bào nấm và tế
bào động vật; màng nguyên sinh chất của tế bào vi khuẩn không chứa steroid
nên không bị KS nhóm này tác động [7].
1.1.2.3. Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein
Nhóm aminoglycosid gắn với thụ thể (receptor) trên tiểu phần 30S của
ribosome làm cho quá trình dịch mã không chính xác, kết quả là sẽ tổng hợp
nên những protein không đúng chức năng. Nhóm chloramphenicol gắn với
tiểu phần 50S của ribosome, ức chế enzyme peptidyltranferase, ngăn cản việc
gắn các acid amin mới vào chuỗi polypeptide. Ngoài ra nó còn có một tác
dụng nữa là làm tích lũy ARN trong tế bào.
Nhóm macrolides và lincosamides gắn với tiểu phần 50S của ribosome,
chống lại tác dụng của enzyme đảm nhiệm chức năng giúp mạch polypeptide
chuyển vị nhằm ngăn cản quá trình dịch mã của các acid amin đầu tiên của


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

7
chuỗi polypeptide, khiến cho quá trình dịch mã có thể bị dừng lại ở ngay
những acid amin đầu tiên.
Nhóm tetracilin: ngăn cản quá trình kéo dài của chuỗi polypeptide bằng
cách ngăn cản sự xâm nhập của aminoaxyl- tARN vào vị trí A của ribosome;
ngăn cản quá trình oxy hóa và cung cấp năng lượng, bằng cách tạo phức với

các ion Mg
2+
cần cho sự hoạt động của các enzyme [38].
1.1.2.4. Ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic
Một số CKS cản trở quá trình sao chép và phiên mã ở VSV. Các CKS
này có thể ảnh hưởng đến quá trình sao chép của acid nucleic bằng cách ức
chế tổng hợp các nucleotide, ức chế sao chép hoặc làm ngừng phiên mã. Do
không tổng hợp được vật chất di truyền nên kết quả là các VSV gây bệnh
không thể sinh sản và duy trì nòi giống được. Hiện nay người ta đã biết rõ
khoảng 20 chất ức chế trao đổi hoặc tổng hợp ADN:
- Nhóm refampin gắn với ARN polymerase ngăn cản quá trình sao mã tạo
thành ARN thông tin (mARN).
- Nhóm quinolone ức chế tác dụng của DNA gyrase làm cho hai mạch đơn
của ADN không thể duỗi xoắn, ngăn cản quá trình tự sao chép của ADN.
- Nhóm sulfamide có cấu trúc giống p-aminobenzonic acid (PABA) có tác
dụng cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp nucleotide.
- Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác cho quá trình tạo nhân
purin làm ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic.
1.1.2.5. Ức chế cạnh tranh
Một số CKS có cấu trúc khá giống với cơ chất của các loại enzyme và
do đó chúng sẽ tranh chấp trung tâm hoạt động của enzyme với các chất trao
đổi bình thường. Điều này khiến cho sinh trưởng và phát triển của VSV bị ức
chế hoặc hạn chế hoàn toàn.


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

8
Ngoài các cơ chế chủ yếu trên thì CKS còn có thể tác động đến tế bào
VSV qua một số cơ chế khác như: tác động lên tính thấm của tế bào, tác động

gây ức chế enzyme… CKS validamycin A (val-A) thuộc nhóm này với cơ chế
tác động lên enzyme trehalase có vai trò trong việc điều hòa và cung cấp năng
lượng. Ngoài ra val-A còn ức chế quá trình tổng hợp myo- inositol và làm
giảm độc tính của nấm mốc.
1.1.3. Kháng sinh bảo vệ thực vật
Hiện nay việc dùng thuốc hóa học trong bảo vệ thực vật vẫn là phổ biến
nhất. Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học lâu dài lại gây ra những
tác hại không nhỏ đến môi trường và sức khỏe con người. Để khắc phục
những nhược điểm trên thì việc sử dụng các CKS trong bảo vệ thực vật vừa
có tác dụng nhanh, dễ phân hủy, có tính đặc hiệu cao, chỉ tiêu diệt một hoặc
một số sâu bệnh nhất định mà không ảnh hưởng đến những loài có ích khác
và đặc biệt CKS còn có khả năng ức chế cả các VSV đã kháng thuốc hóa học.
Các kháng sinh được ứng dụng để tiêu diệt các nấm và vi khuẩn gây bệnh cho
cây trồng như các bệnh khô vằn, vàng lụa ở lúa (validamycin, blasticidin S,
kasugamycin), bệnh thối cổ rễ ở các cây có củ. Ngoài ra CKS còn được sử
dụng làm chất kích thích tăng trưởng ở những nồng độ nhất định như kích
thích nảy mầm ở hạt. Việc sử dụng các CKS trong bảo vệ thực vật ngày càng
được phổ biến rộng rãi trên thế giới nhất là ở các nước Nga, Nhật Bản, Trung
Quốc, Ấn Độ. Năm 1950, Trung Quốc đã tuyển chọn được chủng
Streptomyces sp. 5406 có khả năng ức chế Rhizoctonia solani và Verticillium
albo – atrum gây thối rễ ở bông non. Năm 2002, ở Ấn Độ đã phân lập được
chủng Streptomyces sp. 201 có khả năng sinh chất kháng sinh mới là z-
methylheptyl iso-nicotinate, chất kháng sinh này có khả năng kháng lại nhiều
loại nấm gây bệnh như Fusarium oxysporum, F. solani, F. semitectum, F.
moniliforme. Năm 2002, Trung tâm công nghệ sinh học – Đại học Quốc gia
Hà Nội đã phân lập được chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. LD30 có khả năng


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

9
ức chế được vi khuẩn Pseudomonas solanacearum gây bệnh héo lá ở cây
trồng [8].
Việt Nam cũng sử dụng nhiều chế phẩm kháng sinh trong bảo vệ thực
nhập khẩu từ Trung Quốc hay Nhật Bản và đã phân lập được một số chủng xạ
khuẩn có khả năng chống Pyricularia oryae gây bệnh đạo ôn và F. oxysporum
gây bệnh thối rễ ở thực vật. Tuy nhiên việc sử dụng CKS trong lĩnh vực bảo
vệ thực vật ở nước ta còn ở mức độ thấp bởi tập quán canh tác chỉ quen dùng
một số hóa chất bảo vệ thực vật nhất định.
Ngoài ra, các chế phẩm sinh học chưa phù hợp với điều kiện sản xuất
các chế phẩm sinh học của người nông dân. Do đó, cần có sự phối hợp thống
nhất trong việc nghiên cứu, sản xuất các chế phẩm phòng trị sinh học với việc
truyền thông, xây dựng phương pháp canh tác mới nhằm thu được hiệu quả
cao trong phòng chống dịch bệnh, nâng cao năng suất cây trồng và hiệu quả
kinh tế đồng thời bảo vệ môi trường, sức khỏe con người.
1.1.4. Validamycin A
1.1.4.1. Cấu trúc hóa học của validamycin A
Cấu trúc hóa học của val-A được Horii và Kameda và cộng sự xác
định: 1L-(1,3,4/2,6)-2,3-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(1S,4R,5S,6S)-
4,5,6-trihydroxy methylcyclohex-2-enylamino] cyclohexyl -D-
glucopyranoside. Hình ảnh val-A [32].

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của val-A


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

10
Công thức phân tử: C
20

H
35
NO
13
; trọng lượng phân tử : 497.5.
Validamycin A có thể được chia thành hai nhánh hydroxyl methyl
cyclitol trong phân tử và các phân tử cyclitol này khác các aminocyclitol đã
biết khác như streptamine, 2-deoxystreptamine, actinamine. Do đó, val-A là
kháng sinh aminoglycoside duy nhất và là một ví dụ điển hình về hợp chất có
cấu trúc pseudosugar [32].
Các validamycin A, C, D, E và F đều có phân tử validoxylamine A
trong phân tử nhưng chúng khác nhau ở ít nhất một trong các đặc tính sau:
cấu hình của phân tử có liên kết glucoside trong tâm anomeric; vị trí của liên
kết glucosid và số lượng phân tử D-glucose. Validamycin B có chứa
validoxylamine trong phân tử, khi thủy phân bằng acid tạo ra
hdroxylvalidamine giống như val-A thủy phân thành validamine [18], [19].
Kameda đã nghiên cứu sự chuyển hóa của validamycin nhờ VSV và
nhận thấy liên kết glucoside của validamycin bị cắt có chọn lọc khi VSV
thủy phân, đặc biệt validamycin C chuyển hóa thành val-A nhờ Endomycosis
spp. hay Candida spp. có ý nghĩa quan trọng vì validamycin C có hoạt tính
kháng Pellicularia sasakii thấp hơn 1000 lần so với val-A [30], [31], [32].
1.1.4.2. Đặc tính hóa lý của validamycin A
Validamycin A tan nhanh trong nước, methanol, dimethylsulfoxide và
dimethylformamide; tan kém trong acetone và ethanol và không tan trong
ethylacetate và ethyleter. Val-A tan nóng chảy ở 100°C và bị phân hủy ở
135°C. Khả năng quay cực của val-A: [α]
D
24
= +110 15 (c = 1 trong nước),
pKa = 6.0.

Độ bền: Val-A bền trong môi trường kiềm hay acid và bền dưới ánh
sáng mặt trời nhưng bị VSV đất phân hủy nhanh, thời gian bán hủy < 2 giờ.
P. denitrificans phân hủy val-A thành D-glucose và validoxylamine,


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

11
validoxylamine tiếp tục bị phân hủy để tạo ra valienamine, validamine và các
hợp chất khác [25], [26].
1.1.4.3. Hoạt tính sinh học của val-A
Theo Nioh và Mizushima, val-A không gây ức chế sự sinh trưởng của
nấm và không làm thay đổi hàm lượng protein, nucleic acid và thành phần của
thành tế bào nhưng gây thay đổi hình thái của nấm R. solani bằng cách ức chế
quá trình sinh tổng hợp myo-inositol và làm giảm độc tính của nấm [32].
Validamycin A cũng ức chế trehalase của R. solani cũng như ở nhiều
loài sinh vật khác như chuột, thỏ, lợn, nấm men và côn trùng với IC
50
= 10
-8
-
10
-6
M. Trehalase được phân bố rộng rãi ở nhiều loài sinh vật, đóng vai trò
quan trọng trong việc điều hòa, cung cấp năng lượng (D-glucose) cho hệ cơ ở
cánh của côn trùng, cho quá trình nảy mầm của bào tử…Trong tế bào nấm
bệnh, trehalase xúc tác chuyển hóa trehalose thành đường glucose - nguồn
năng lượng cho nấm phát triển. Do đó, dưới tác động của val-A, tế bào nấm
sẽ tạo nhánh bất thường, bị khô dần và chết do không có khả năng tổng hợp
glucose để sinh trưởng [16], [34], [35].

Hình 1.2. Cơ chế tác động của val-A đến quá trình chuyển hóa năng lượng ở
vi nấm


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

12
Val-A là chất kìm hãm yếu (IC
50
= 10
-3
M) các enzyme thủy phân
đường khác như maltase, isomaltase và sucrase trong ruột lợn. Trong R.
solani, kháng sinh được vận chuyển nhanh đến sợi nấm và được glycosidase
thủy phân thành validoxylamine A, đây là chất kìm hãm trehalase của nấm
mạnh hơn ở in vitro và in vivo [33], [47].
Validamycin có độc tính rất thấp đối với động vật có vú. Các liều LD
50

khi uống và tiêm dưới da đối với loài gặm nhấm nói chung và chuột nói riêng
là 20000 và 15000 mg/kg thể trọng. Val-A không gây kích ứng dưới da thỏ ở
nồng độ 10 mg/cm
2
và giác mạc là 10 mg/1 mắt. Bổ sung val-A với nồng độ
10.000 ppm vào khẩu phần dinh dưỡng của chuột không gây ảnh hưởng gì
trong vòng 23 ngày. Val-A ở 40 và 10.000 ppm không gây ảnh hưởng đối với
cá chép và cá ăn thịt trong 72 giờ [32].
1.1.4.4. Ứng dụng của validamycin A
Val-A được sử dụng để trừ bệnh đốm vằn hại lúa, bắp, bệnh đốm lá và

thân lúa, bắp do R. solani, R. oryzae và Sclerotium oryzae-sativa gây nên.
Ngoài ra val-A còn trừ bệnh thối củ, thối rễ khoai tây, bông, cà chua và nhiều
loại rau do nấm R. solani gây nên [20], [43], [44]. Có thể phun dung dịch val-
A lên cây hay nhúng rễ cây, xử lý cây con và củ (khoai tây, cây giống rau).
Đối với lúa, phun khi lúa có đòng vào lúc 5-10 ngày trước khi trổ bông để trừ
bệnh khô vằn cổ bông, hoặc phun thuốc sau khi lúa trổ bông 5-7 ngày. Val-A
cũng có ảnh hưởng tới một số hoạt tính enzyme trong đất, ví dụ với hàm
lượng 240 mg/ml validamycin sẽ làm giảm 14% hoạt tính của catalase, gây ức
chế 67,3 % hoạt tính của urease và làm tăng hoạt tính của enzym axit
phosphatase 29,7%. Tuy nhiên, validamycin dễ dàng được các VSV đất sử
dụng làm nguồn carbon và năng lượng cho sinh trưởng. Vì vậy, sử dụng
validamycin sẽ không gây ảnh hưởng đến môi trường đất [46]. Voglibose,
một dẫn xuất valiolamine từ validamycin cũng được sử dụng rộng rãi để điều
trị bệnh tiểu đường [17], [48].


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

13
Trên thế giới, một số nước như Nhật, Hàn Quốc, Trung Quốc đã sản
xuất validamycin ở qui mô công nghiệp bằng con đường sinh tổng hợp từ
VSV. Ngày nay, để sản xuất validamycin công nghiệp, người ta vẫn sử dụng
quá trình lên men bằng các chủng S. hygroscopicus subsp. jinggangensis [40],
[43]. Ngoài việc lựa chọn môi trường và điều kiện lên men thích hợp, người
ta còn sử dụng các phương pháp gây đột biến nhằm tạo chủng có hoạt tính
cao [16], [45], [46]. Hầu hết các chủng được tuyển chọn bằng đột biến có
định hướng có thể làm tăng lượng validamycin thu được lên 54,4% so với
chủng gốc [45]; xử lý đột biến chủng xạ khuẩn S. hygroscopicus subsp.
jinggangensis Yen KN-16 bằng UV có thể làm tăng 33,5% hiệu suất thu hồi
val-A so với chủng gốc [46]. Bên cạnh đó, bằng công nghệ đột biến bằng

sóng viba, sóng siêu âm, bức xạ ion tế bào, hoặc công nghệ đột biến tế bào
trần có thể cải thiện khả năng sinh tổng hợp của các kháng sinh trong công
nghiệp và giảm giá thành sản xuất [46]. Đột biến bằng sóng viba có thể tăng
đến trên 21% hiệu suất thu validamycin và sản xuất ổn định trong bốn lần lên
men liên tục sau thời gian bảo quản 10 tháng [16]. Như vậy, việc cải tạo
chủng giống VSV và nghiên cứu tối ưu quá trình lên men là một trong những
hướng đi đầy triển vọng trong công nghiệp sản xuất validamycin, đặc biệt là
làm giảm giá thành trong sản xuất công nghiệp.
1.2. Xạ khuẩn sinh validamycin A
1.2.1. Đặc điểm của xạ khuẩn
1.2.1.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn
Hình thái của khuẩn lạc xạ khuẩn rất khác nhau, kích thước và hình
dạng của chúng thay đổi phụ thuộc vào môi trường và điều kiện nuôi cấy
(nhiệt độ, độ ẩm…). Trên môi trường đặc, xạ khuẩn phát triển thành những
khuẩn lạc khô, kích thước thay đổi. Mặt khuẩn lạc xạ khuẩn thường chắc, xù
xì, có dạng đá vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo, có các nếp tỏa ra theo
hình phóng xạ và bám sâu vào thạch với nhiều màu sắc: đỏ, da cam, vàng,


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

14
trắng, xanh tùy thuộc vào điều kiện dinh dưỡng môi trường [1], [11]. Xạ
khuẩn thuộc loài dị dưỡng, chúng sử dụng nguồn cacbon là tinh bột, các loại
đường (glucose, maltose, saccarose ) và các hợp chất polysacaride. Nguồn
nitơ vô cơ thường là: nitrate, muối amon , nitơ hữu cơ thường là: pepton, cao
ngô, cao nấm men. Khả năng đồng hóa các chất này ở các chủng xạ khuẩn
khác nhau là không giống nhau. Phần lớn chúng là các VSV hiếu khí và ưa
ấm; xạ khuẩn ưa nhiệt thường ít gặp. Phần lớn xạ khuẩn phát triển tốt ở môi
trường có pH trung tính và hơi kiềm; ở môi trường pH thấp hoặc quá kiềm xạ

khuẩn không phát triển hoặc phát triển kém. Các chủng xạ khuẩn phát triển
được ở nồng độ muối 3-5% (w/v), còn ở nồng độ cao hơn có thể bị ức chế
hoặc bị tiêu diệt [8], [9], [11]. Xạ khuẩn (actinomycet) là nhóm VSV đơn bào
hay vi khuẩn thật, phân bố rộng rãi trong tự nhiên: trong đất, trong nước ao
hồ, nước biển, một phần trong bùn, lớp trầm tích và trong các chất hữu cơ
khác [25]. Một vài loài có thể gây bệnh cho động thực vật. Phần lớn xạ khuẩn
là các tế bào Gram (+), hoại sinh, có cấu tạo sợi phân nhánh. Xạ khuẩn được
nghiên cứu sâu vì chúng có ý nghĩa quan trọng trong tự nhiên: tích cực tham
gia vào các quá trình chuyển hóa nhiều hợp chất trong đất, trong nước, xạ
khuẩn có vai trò quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất của tự nhiên.
Chúng sản sinh ra nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng khác nên đã được
dùng để sản xuất nhiều loại enzyme như: protease, amylase, cellulase,
glucoizomerase, vitamin và các axit hữu cơ. Tuy nhiên đặc điểm quan trọng
nhất của xạ khuẩn là khả năng sinh chất kháng sinh, trong đó 60 - 70% xạ
khuẩn phân lập được từ đất có khả năng này [29]. Trong khoảng 8000 chất
kháng sinh hiện đã được biết đến trên thế giới thì trên 80% là do xạ khuẩn
sinh tổng hợp. Đây là kết quả của quá trình đối kháng giữa các VSV và thúc
đẩy quá trình tiến hóa của xạ khuẩn.
Xạ khuẩn giống nấm mốc ở chỗ có thể tạo thành hệ sợi, nhưng lại là cơ
thể đơn bào, không có nhân thực và có kích thước giống vi khuẩn. Khuẩn lạc
xạ khuẩn thường có 3 lớp: lớp vỏ ngoài có các sợi bện chặt, lớp trong tương