tìm hiểu sự biến đổi của vùng lặp lại thuộc orf94, orf125 của virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú (penaeus monodon) tại cà mau

TÔ VŨ AN
TÌM HIỂU SỰ BIÉN ĐỔI CỦA VÙNG LẶP LẠI THUỘC
ORF94, ORF125 CỦA VIRUS GÂY BỆNH ĐÓM TRẮNG TRÊN
TÔM SÚ (Penaeus monodon)
TẠI CÀ MAU
LUÃN VĂN TÓT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌc ThỦY sẢn
TÔ VŨ AN
TÌM HIỂU SỰ BIÉN ĐỔI CỦA VÙNG LẶP LẠI THUỘC
ORF94, ORF125 CỦA VIRUS GÂY BỆNH ĐÓM TRẮNG TRÊN
TÔM SÚ (Penaeus monodon) TẠI CÀ MAU
LUÃN VĂN TÓT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌc ThỦY sẢn
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN
2008
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Th.s TRẦN THỊ TUYÉT HOA
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN
2008
MỤC LỤC
DANH SÁCH HÌNH
DANH SÁCH BẢNG
4
LỜI CẢM TẠ
Xin chân thành cảm ơn cô Trần Thị Tuyết Hoa đã tận tình chỉ dẫn trong suốt quá
trình thực hiện đề tài này.
Chân thành cảm ơn thầy cô Khoa Thủy Sản, các bạn lớp BHTS và NTTS K30 đã
tận tình giúp đở trong suốt quá trình học tập và làm luận văn này.
Xin cảm ơn cha, mẹ, chị, em là một chổ dựa vững chắc cho sự nghiệp và tương lai
của bản thân.
Tác giả
Tô Vũ

An
TÓM TẮT
Cà Mau là tỉnh có diện tích và sản lượng tôm nuôi cao nhất cả
nước. Nhưng trong những năm gần đây thì tình hình dịch bệnh
bùng phát ở nhiều nơi nó gây trở ngại đối với người nuôi tôm
nhất là bệnh đốm trắng do tác nhân White Spot Syndrome Virus
(WSSV). Theo những nghiên cứu gần đây cho thấy WSSV đã có
nhiều biến đổi về mặt cấu trúc di truyền. Nghiên cứu được
thực hiện để tìm hiểu về đặc điểm gen của virut gây bệnh đốm
trắng trên tôm sú nuôi tại Cà Mau và khả năng ứng dụng của
vùng lặp lại thuộc ORF94 và ORF125 trong nghiên cứu dịch tể
học của Virut gây bệnh đốm trắng. Kết quả phân tích 60 mẫu
tôm dương tính với WSSV của 12 ao trong tổng số 24 ao thu tại
Cà Mau sử dụng phương pháp PCR- genotyping khuyếch đại vùng
lặp lại thuộc ORF94 và ORF125 cho thấy có sự biến động về cấu
trúc di truyền của WSSV trên tôm sú tại Cà Mau. Kết quả cho
thấy số vùng lặp lại trên bộ gen của WSSV giữa các ao thì
khác nhau. Trong cùng một ao nhiễm WSSV thì số vùng lặp lại
thường giống nhau 9/12 ao đối với ORF94 và 10/12 ao đối với
ORF125. Đối với ORF94 đã xác định được 7 nhóm vùng lặp lại (4
đến 10 vùng lặp lại) trong đó kiểu gen có 6, 8 vùng lặp lại
chiếm tỉ lệ cao nhất 24,6%. Còn ORF125 thì có 5 nhóm vùng lặp
lại (từ 4 đến 8 vùng lặp lại) trong đó kiểu gen có 6 vùng lặp
lại chiếm tỉ lệ cao nhất 47%. Sự khác biệt giữa các vùng lặp
lại thuộc ORF94, và ORF125 trên bộ gen WSSV trong các ao tôm
bệnh đốm trắng cho thấy đang tồn tại nhiều kiểu gen WSSV khác
nhau có khả năng gây bệnh đốm trắng trên tôm. Kết quả nghiên
cứu có thể ứng dụng trong nghiên cứu về sự lan truyền và phân
bố WSSV, làm cơ sở cho việc phòng ngừa và kiểm soát sự bùng
phát của bệnh đốm trắng do WSSV gây ra.

PHẦN I GIỚI THIỆU
Cà Mau là tỉnh nằm ở tận cùng cực nam của tổ quốc có ba mặt giáp biển và hệ thống
sông ngòi chằng chịt nên rất thuận lợi cho nghề nuôi trồng thủy sản phát triển. Từ
những đầu thập niên 80 nghề nuôi trồng thủy sản ở Cà Mau (đặc biệt là nghề nuôi tôm
sú) đã dần dần phát triển với hình thức nuôi quãng canh truyền thống nhưng năng suất
nuôi thấp. Để tăng năng suất thì việc chuyển đổi từ hình thức nuôi quãng canh truyền
thống sang bán thâm canh và thâm canh là rất cần thiết. Do hiệu quả kinh tế mà nghề
nuôi tôm đem lại nên diện tích và sản lượng tôm nuôi ở Cà Mau không ngừng tăng
trong những năm gần đây. Xuất khẩu thủy sản được xem là một trong những ngành
kinh tế mũi nhọn của tỉnh và trong khu vực.
Việc thâm canh hóa trong nuôi tôm sú không những tăng năng suất mà còn làm tăng
nguy cơ bùng phát dịch bệnh. Theo thống kê của Bộ Thủy sản mỗi năm có hàng nghìn
hecta ao nuôi tôm thương phẩm phải thu hoạch sớm do bệnh trong đó 80% là bệnh đốm
trắng. Đây là bệnh nguy hiểm chúng có khả năng lây lan nhanh trong ao và gây thiệt hại
lớn (có thể gây chết đến 100% sau 3 - 10 ngày nhiễm bệnh) mà còn có khả năng lây lan
qua các khu vực lân cận qua nguồn nước hay các loài giáp xác. Nhưng mức độ gây hại
của chúng rất khác nhau ở các vùng và các vụ trong năm (có những ao tôm bị nhiễm
đốm trắng thì tôm chết rất nhanh nhưng cũng có ao nuôi bị nhiễm đốm trắng tôm vẫn
phát triển bình thường đến khi thu hoạch). Vấn đề này cũng có nhiều giả thiết được đặt
ra như: điều kiện môi trường, quản lý và chăm sóc sức khỏe tôm nuôi, tác nhân gây
bệnh: sự biến đổi kiểu gen WSSV. Do vậy,
Đề tài: "Tìm hiểu sự biến đổi của vùng lặp lại thuộc ORF94, ORF125 của virus
gây bệnh đốm trắng trên tôm sú (Penaeus monodon) tại Cà Mau" được thực hiện.
Mục tiêu của đề tài
Tìm hiểu về đặc điểm gen của virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú nuôi tại Cà Mau và
khả năng ứng dụng của vùng lặp lại thuộc ORF94, ORF125 trong nghiên cứu dịch tể
học của virus gây bệnh đốm trắng.
7
Nội dung nghiên cứu
* Xác định sự hiện diện của WSSV trong các mẫu tôm sú thu được tại Cà Mau

bằng phương pháp Nested-PCR.
Phân tích các dòng WSSV thu được với phương pháp PCR-
genotyping khuếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94, ORF125.
PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1Tình hình nuôi tôm biển
2.1.1 Trên thế giới
Trên thế giới nghề nuôi trồng thủy sản đặc biệt là nghề nuôi tôm biển đã xuất hiện rất
lâu nhưng nuôi tôm công nghiệp chỉ mới xuất hiện ở những năm 30 của thế kỷ XX
( Nguyễn Văn Hảo, 2003). Nuôi tôm công nghiệp cung cấp hơn 1/3 sản lượng tôm
nuôi, nhưng diện tích chỉ chiếm khoảng 5% tổng diện tích. Từ đó, nuôi tôm công
nghiệp phát triển mạnh và mang lại hiệu quả kinh tế cao cho nhiều nước. Nghề nuôi
tôm thương phẩm đã nổi lên như một trong các hệ thống sản xuất thực phẩm có tốc độ
phát triển nhanh nhất trên Thế giới và các nước Đông Nam Á và là nguồn thu ngoại tệ
chủ yếu. Đến năm 1980 qui mô và diện tích nuôi tôm biển gia tăng và phát triển theo
hướng ngày càng thâm canh hóa. Thái Lan là nước có sản lượng tôm đứng đầu thế giới
kế đến là Indonesia, Trung Quốc, Ân Độ, Bangladesh, Việt Nam (Nguyễn Văn Hảo,
2003).
Nuôi trồng thủy sản trên Thế giới tăng nhanh trong những năm qua với tốc độ 7,6%, đạt
37,5 triệu tấn vào năm 2001, chiếm 29,1% tổng sản lượng thủy sản (Lê Xuân Sinh,
2005), đến năm 2003 sản lượng nuôi trồng thủy sản ước đạt 41,9 triệu tấn. Sản lượng
tôm biển tăng rất nhanh, năm 2000 thì sản lượng tôm biển đạt được 1.087.900 tấn (Lê
Xuân Sinh, 2003), đến năm 2002 sản lượng này tăng lên
1.292.1 tấn. Nhưng trước đó sản lượng nuôi tôm trên Thế giới có xu hướng
giảm. Cụ thể, năm 1994 sản lượng tôm biển trên thế giới là 733.000 đến năm 1995
giảm còn 712.000 và tiếp tục giảm còn 693.000 tấn vào năm 1996 đến năm 1997 còn
660.000 tấn (World Shrimp Farming,1997 trích dẫn bởi Lê Xuân Sinh, 2003). Sản
8
lượng tôm giảm trong những năm này là do dịch bệnh bùng phát và gây thiệt hại ở
nhiều nước như Thái lan, Việt Nam (1994- 1996), Peru (1997), các quốc gia dọc bờ
biển Đông và Tây Ấn Độ (1994-1995), Indonesia, Philippines (1996).

2.1.2 Việt Nam
Việt Nam với bờ biển trải dài 3.260 km từ Quảng Ninh đến Cà Mau vòng qua Kiên
Giang nên rất có tiềm năng cho nuôi trồng thủy sản nước lợ phát triển. Diện tích nuôi
tôm gia tăng nhanh chóng từ 50.000 ha (1985) lên đến 295.000 ha (1998) với 30 tỉnh
nuôi tôm sú và tăng lên 449.275 ha (2001). Đến năm 2004 diện tích nuôi tôm nước lợ
cảnướckhoảng 600.000 ha, với mô hình nuôi quãng canh cải
tiến là chủ yếu, ngoài ra còn có các mô hình bán thâm canh, thâm canh chiếm diện tích
nhỏ trong đó nuôi thâm canh đạt được năng suất cao khoảng 5 -7 tấn/ ha. Đồng bằng
sông Cửu Long là vùng có diện tích nuôi lớn nhất cả nước có khoảng
680.1 ha (2005). Sản lượng tôm cùng tăng theo từ 65.282 tấn (1999), tăng lên
103.845 (2000) đến năm 2001 sản lượng tôm nuôi là 162.713 tấn (Lê Xuân Sinh,
2003) , và sản lượng tiếp tục tăng đến 210.000 tấn (2003) (Nguyễn Văn Hảo,
2004) . Kim ngạch xuất khẩu các mặt hàng thủy sản năm 2005 là 2,65 tỷ
USD (Tạp chí khuyến ngư Việt Nam số 45), Năm 2007, xuất khẩu thủy sản của
cả nước đã đạt khoảng 925 nghìn tấn trị giá 3,756 tỷ USD, tăng 12,2% về khối
lượng và 14% về giá trị so với cùng kỳ năm ngoái. Tuy nhiên, trị giá xuất khẩu
trên khi được bổ sung đầy đủ số liệu luỹ kế của cả năm, rất có thể đạt đến mức
3,8 tỷ USD. (Báo thương mại, 2008). Việc xuất khẩu thủy sản được xem là một
trong các ngành kinh tế mũi nhọn ở Việt Nam.
2.1.3 Đồng bằng sông Cửu Long
Đồng bằng sông Cửu long là vùng nuôi trồng thủy sản lớn nhất cả nước và cũng là một
trong các ngành kinh tế mũi nhọn của vùng. Tổng diện tích nuôi tôm của khu vực ở
năm 2003 chiếm 88% diện tích nuôi tôm của cả nước, sản lượng 146.000 tấn, chiếm
69.5% sản lượng tôm của cả nước, với hình thức nuôi quãng canh cải tiến là chủ yếu
9
như tôm rừng tập trung chủ yếu ở Cà Mau, Bạc Liêu, Trà Vinh, tôm lúa ở Cà Mau,
Kiên Giang, Sóc Trăng, bán thâm canh ở Sóc Trăng, Thâm
Canh ở Sóc Trăng, Bạc Liêu. Sóc Trăng là tỉnh có nghề nuôi tôm với tốc độ thâm canh
hóa cao, năng suất bình quân cao nhất vùng. Năm 2005, tổng diện tích nuôi tôm của
Sóc Trăng là 43.211 ha, sản lượng 42.817 tấn, trong đó diện tích nuôi thâm canh và bán

thâm canh là 17.481 ha, sản lượng tôm nuôi thâm canh là 13.400 tấn, bán thâm canh là
17.850 tấn, quãng canh cải tiến là 11.567 tấn (Sở Thủy Sản Sóc Trăng, 2005). Năm
2005, Bạc Liêu có diện tích nuôi tôm là 116.473 ha, trong đó có 10.929 ha nuôi thâm
canh và bán thâm canh, sản lượng đạt 63.616 tấn (Sở Thủy Sản Bạc Liêu, 2005)
2.1.4 Cà Mau
Cà Mau là tỉnh có diện tích và sản lượng nuôi trồng thủy sản lớn nhất cả nước mà chủ
yếu là thủy sản nước lợ. Do Cà Mau có ba mặt giáp biển, hệ thống sông ngòi chằng
chịt, nguồn tài nguyên và nguồn lao động dồi dào nên rất thuận lợi cho thủy sản phát
triển. Diện tích và sản lượng nuôi tôm trong những năm 1981 có 14.000 ha đạt 4.500
tấn, năm 1991 tăng lên 60.000 ha, 28.600 tấn, và năm 2000 có tới 153.373 ha với
35.700 tấn (Phùng Văn, 2005)
Năm 2001 có 217.898 ha; năm 2002 có 239.398 ha; năm 2003 có 245.338 ha; năm
2004 có 248.174 ha. Trong diện tích nuôi năm 2004 có các loại hình nuôi chủ yếu là:
tôm-rừng 46.300 ha, tôm-lúa 43.600 ha, tôm-vườn 22.000 ha, nuôi tôm công nghiệp
580 ha, còn lại là nuôi tôm dạng sinh thái (Phùng Văn, 2005)
Năm 2008, Cà Mau có diện tích nuôi tôm 249.000 ha, gồm 35.000 ha rừng - tôm,
40.1ha lúa - tôm, 1.000 ha tôm - vườn, 900 ha tôm công nghiệp, còn lại là diện tích
chuyên tôm dạng sinh thái (Nguyễn Tiến Hưng, 2008).
1
0
2.2Tình hình dịch bệnh trong nuôi tôm
2.2.1 Trên thế giới
Phong trào nuôi trồng thủy sản trên thế giới ngày càng phát triển mạnh mẽ nhất là nghề
nuôi tôm châu Á - Thái Bình Dương vào những năm của thập kỷ 80 và lịch sử bệnh
tôm cũng gắn liền với phong trào nuôi đó. Công nghệ nuôi tôm ở các
nước châu Á tuy phát triển mạnh nhưng phải đối phó với vấn đề dịch bệnh và sự suy
thoái của môi trường, đã gây ra nhiều thiệt hại cho người nuôi. Ở Trung Quốc sản
lượng tôm nuôi giảm mạnh khoảng 120.000 tấn trong năm 1993, trong khi đó ở Đài
Loan sản lượng liên tụcgiảm từ đỉnh cao 88.000 tấn vào năm 1987 xuống
còn 12.000 tấn ở năm 1993. Trong khoảng thời gian từ 1993 - 1995 sản lượng tôm ở

Indonesia và philippines giảm tương ứng 48% và 58% (Nguyễn Văn Hảo, 2003). Ở
nhiều quốc gia do phát triển quá mức nghề nuôi nên phải chịu những hậu quả: tài
nguyên môi trường bị cạn kiệt, sử dụng nhiều nông dược, hóa chất, phá rừng, lấn đất
nông nghiệp làm cho đất bị nhiễm mặn, nguồn nước bị ô nhiễm. Việc thâm canh hóa
ngày càng cao làm bệnh bùng phát khắp nơi như Trung Quốc, Ecuador, Indonesia
(1992), Việt Nam, Thái Lan (1994 - 1996), Đài Loan, Philippines (1993), Với các tác
nhân gây bệnh chủ yếu là vi khuẩn, virus, ký sinh trùng, nấm. Nhưng bệnh do virus gây
tác hại nghiêm trọng nhất như MBV (Monodon Baculovirus), WSSV (White Spot
Syndrome Virus), YHV (Yellow Head Virus) Dịch bệnh đã làm giảm sản lượng tôm
trên thế giới từ 733.000 tấn năm 1994 còn 712.000 tấn năm 1995, còn 693.000 tấn
1996 đến năm 1997 còn 660.000 tấn (Nguyễn Văn Hảo, 2003). Như vậy dịch bệnh là
một trở ngại rất lớn cho sự phát triển nuôi trồng thủy sản trên Thế giới.
2.2.2 Trong nước và khu vực Đồng bằng sông Cửu Long
Theo thống kê của Bộ Thủy sản năm 1995, từ năm 1993 - 1995 dịch bệnh đã báo động
trên toàn quốc nó đã gây thiệt hại hàng ngàn tỷ đồng. Trong năm 1994, có 84.558 ha bị
dịch bệnh, sản lượng bị thiệt hại 5.225 tấn trị giá 294 tỷ đồng (Nguyễn Văn Hảo,
2003). Đến năm 2001 dịch bệnh bùng phát ở miền Nam gồm các tỉnh Cà Mau, Bạc
1
1
Liêu, Sóc Trăng, Tiền Giang. Trong đó Bạc Liêu có diện tích thiệt hại cao nhất là
47.333 ha, Sóc Trăng là 10.000 ha (Nguyễn Văn Hảo,
2004) . Năm 2002 Cà Mau có 137.000 ha, Sóc Trăng Có 16.702 ha, Bạc Liêu
có 89.841 ha bị thiệt hại do bệnh, trong đó có 18.890 ha bị thiệt hại hoàn toàn
(Nguyễn Minh Niên, 2004). Ở Sóc Trăng đến tháng 10/2007 thì trong năm số hộ
nuôi lỗ là 3.908 chiếm 14.68%, diện tích thiệt hại 4.110 ha do bệnh phân trắng
( Sở Thủy sản Sóc Trăng, 2007).
Từ đầu năm 2008 đến nay, Cà Mau có hơn 39.000 ha diện tích tôm nuôi bị chết, với
mức độ thiệt hại bình quân từ 25 đến 30%. Trong tháng 6/2008, hiện tượng tôm chết
xảy ra trên diện rộng ở các huyện như Ngọc Hiển: hơn 10.000 ha, Đầm Dơi: 4.300 ha
và Năm Căn trên 800 ha. Nguyên nhân là do thời tiết diễn biến bất thường, nhiệt độ

dao động ngày đêm chênh lệch nhau, các đầm nuôi bị khô cạn do nắng nóng kéo dài
làm tôm suy yếu, phát sinh dịch bệnh (Tuyết Anh, 2008).
2.3Ảnh hưởng của bệnh đốm trắng đến nghề nuôi tôm
Năm 1960 đã phát hiện virus gây bệnh trên trên giáp xác, đến năm 1990 xác định bệnh
do virut là trở ngại lớn cho nghề nuôi tôm, đặc biệt là bệnh do virut đốm trắng. Năm
1992, các ao nuôi thâm canh đã gặp trở ngại về bệnh đốm trắng có hơn 80% số trại bị
thất bại tại Indonesia. Năm 1994, bệnh đốm trắng gây tỷ lệ chết cao và làm tổn thất lớn
đến nghề nuôi tôm công nghiệp ở Trung Quốc, Nhật Bản, Indonesia, Ân Độ, Đài Loan.
Năm 1996 ở Thái Lan dịch bệnh đốm trắng bùng phát làm thiệt hại khoảng 40% tổng
sản lượng, thiệt hại khoảng 500 triệu USD. Virus gây bệnh đốm trắng WSSV lần đầu
tiên được báo cáo ở Nhật vào năm 1993, nhưng trước đó năm 1989 ở đã có báo cáo sự
xuất hiện bệnh đỏ thân trên tôm sú đây là dấu hiệu đi kèm với đốm trắng. Bệnh này đã
làm giảm sản lượng tôm trên thế giới từ 733.000 tấn năm 1994 còn 712.000 tấn năm
1995, còn 693.000 tấn 1996 đến năm 1997 còn 660.000 tấn (Nguyễn Văn Hảo, 2003).
Theo thống kê của Bộ Thủy Sản mỗi năm có hàng ngàn hecta ao nuôi tôm thương
phẩm phải thu hoạch sớm do bệnh trong đó 80% là bệnh đốm trắng. Năm 2003 Sóc
1
2
Trăng có 16.346 ha bị thiệt hại hoàn toàn chiếm 40% diện tích, cuối năm 2004 diện
tích tôm nuôi bị mất trắng là 18.231 ha.
2.4 Đặc điểm của tác nhân gây bệnh đốm trắng
2.4.1 Tác nhân gây bệnh
Bệnh đốm trắng do virus gây hội chứng đốm trắng WSSV gây ra trên tôm he (Penaeid).
WSSV được tìm thấy ở nhóm tôm he và các loài giáp xác khác: tôm nước ngọt, cua,
tôm hùm, chân chèo và ấu trùng côn trùng. Bệnh được báo cáo đầu tiên ở Nhật Bản vào
năm 1993 trên tôm nhập từ Trung Quốc về nuôi (Trần Thị Tuyết Hoa, 2004). Trước
năm 2002, có 3 chủng Baculovirus gây bệnh đốm trắng hoặc còn gọi là virus Trung
Quốc. Tuỳ từng nước nghiên cứu chúng có tên gọi và kích thước khác nhau. Đến hội
nghị virus học quốc tế lần thứ 12 (Paris,
2002) các tác giả: Just M. Vlak, Jean-Robert Bonami, Tim W. Flegel, Guang-

Hsiung Kou, Donald V. Lightner, Chu-Fang Lo, Philip C. Loh, Peter J. Walker
đã phân loại virus gây hội chứng đốm trắng là một giống mới Whispovirus thuộc
họ mới Nimaviridae (Vlak et al., 2002). Virus được tìm thấy ở nhiều cơ quan
khác nhau như: chân bơi, mang, dạ dày, cơ bụng, huyết tương, ruột giữa, tim,
chân bò, lympho, màng bao bọc, mô thần kinh, gan, tinh hoàn, buồng trứng, tinh
dịch, cuống mắt (Lo et al, 1997).
2.4.2 Triệu chứng
Đặc trưng của bệnh này là tôm bơi lội lờ đờ, yếu ớt, bỏ ăn, di chuyển chậm chạp, cơ thể
có thể chuyển sang màu hồng hoặc hơi đỏ, phía dưới giáp đầu ngực có những đốm
trắng từ 1mm đến vài mm. Bệnh thường xuất hiện ở thời điểm 1 - 2 tháng sau khi nuôi,
khi môi trường nuôi bắt đầu xấu đi (Bùi Quang Tề, 2003). Khi tôm bị bệnh đốm trắng
có thể chết 100% trong 3 - 10 ngày (Lightner, 1996).
2.4.3 Phương thức lây nhiễm và loài cảm nhiễm
Theo Trần Thị Tuyết Hoa, 2004 hiện nay bệnh đốm trắng ảnh hưởng lớn đến các loài
tôm có giá trị kinh tế thuộc họ Penaeid Một số loài tôm bị nhiễm WSSV như P.
1
3
monodon, P. japonicus, P. chinens, P. indicus Bên cạnh đó WSSV được phát hiện
cảm nhiễm trên 40 loài giáp xác: tôm, cua, còng, copepod, thậm chí là ấu trùng côn
trùng. Theo Bùi Quang Tề, (2003) thì bệnh đốm trắng lây theo chiều ngang là chính.
Virus lây từ các giáp xác khác (tôm, cua, chân chèo) nhiễm bệnh đốm trắng từ môi
trường bên ngoài ao hay ngay trong ao nuôi tôm. Khi các loài tôm nhiễm đốm trắng
trong ao sức khoẻ của chúng yếu hoặc chết các con khoẻ ăn chúng dẫn đến bệnh lây lan
càng nhanh hơn. Có thể một số loài chim nước đã ăn tôm bị bệnh đốm trắng từ ao khác
và bay đến ao nuôi đã mang theo các mẫu thừa và rơi vào ao.
2.4.4 Chẩn đoán
Lightner, (1996) đã đưa ra phương pháp mô học để chẩn đoán bệnh đốm trắng. Với
phương pháp này ta có thể quan sát được thể vùi WSSV phì đại trong nhân của tế bào bị
nhiễm nó bắt màu của thuốc nhuộm Hematoxylin và Eosin.
Dựa trên dấu hiệu đặc trưng là xuất hiện các đốm trắng dưới vỏ. Kết hợp với chẩn đoán

bằng phương pháp mô học: Quan sát nhân của tế bào biểu bì dưới vỏ, tế bào biểu bì
tuyến anten, tế bào cơ quan Lympho, tổ chức liên kết của vỏ, mang, tế bào biểu bì dạ
dày, .Khi nhuộm Hematoxylin và eosin các nhân tế bào có thể vùi lớn bắt màu đỏ
đồng đều. Và sử dụng kỹ thuật PCR và enzyme miễn dịch (Bùi Quang Tề, 2003).
2.4.5 Phòng ngừa và xử lý bệnh
Hiện nay bệnh đốm trắng chưa có phương pháp nào chữa trị có hiệu quả, do đó để nuôi
tôm có hiệu quả thì việc phòng bệnh phải được quan tâm hàng đầu. Để phòng bệnh đốm
trắng có hiệu quả thì chúng ta phải phòng bệnh tổng hợp (Trần Thị Tuyết Hoa, 2004),
tức là phải làm tốt các khâu từ việc vệ sinh trại, lựa chọn tôm bố mẹ, chọn giống tốt, cải
tạo ao nuôi, xử lý nước, nuôi với mật độ vừa phải, cho ăn thức ăn có chất lượng tốt,
chăm sóc và quản lý sức khoẻ ao nuôi.
2.5 Một số nghiên cứu bệnh đốm trắng
Bệnh đốm trắng được báo cáo đầu tiên ở Nhật Bản vào năm 1993 trên tôm nhập từ
Trung Quốc về nuôi (Trần Thị Tuyết Hoa, 2004), cho đến nay bệnh đã xuất hiện trên
1
4
khắp thế giới và gây thiệt hại hàng trăm triệu USD/năm chỉ tính riêng ở Châu Á
(Wongteerasupaya et al. 2003). Vì thế có nhiều nghiên cứu được tiến hành nhằm xác
định sự hiện diện của WSSV nhằm đưa ra phương pháp chẩn đoán chính xác để có cách
phòng ngừa hiệu quả như các nghiên cứu của: Lightner, (1996) đã đưa ra phương pháp
mô học để chẩn đoán bệnh đốm trắng. Với phương pháp này ta có thể quan sát được thể
vùi WSSV phì đại trong nhân của tế bào bị nhiễm nó bắt màu của thuốc nhuộm
Hematoxylin và Eosin. Nguyễn Minh Hậu, (2002) sử dụng phương pháp PCR để xác
định tỷ lệ cảm nhiễm đốm trắng. Kết quả có 23% tôm giống đến tay người nuôi bị
nhiễm WSSV. Phạm Trần Nguyên Thảo, (2003) đã ứng dụng phương pháp mô học để
chẩn đoán bệnh đốm trắng và so sánh với kết quả PCR. Kết quả cho thấy phương pháp
mô học chỉ có thể phát hiện virus khi đã xâm nhập và gây tổn thương tế bào, do đó
không thể phát hiên giai đoạn sớm. Vaseeharan et al., (2003) sử dụng phương pháp
PCR đã nghiên cứu về sự xuất hiện và phân bố WSSV ở tôm nuôi, tôm tự nhiên và giáp
xác. Phương pháp thực hiện với 630 mẫu tôm trong đó có 280 mẫu tôm post thu từ 9

trại giống và 350 mẫu tôm nuôi ( 40 - 60 ngày tuổi) từ 18 ao khác nhau. Kết quả 53%
mẫu dương tính với WSSV khi thực hiện PCR một bước. Okumura et al., (2004) đã
dùng kỹ thuật RPLA (Reversed passive latex agglutination) để phát hiện WSSV từ mô
dạ dày trên tôm he Nhật bản (Penaeus japonicus). Kỹ thuật này sử dụng hạt tổng hợp
có tỷ trọng cao và kháng thể đa dòng đặc hiệu, WSSV được phát hiện sau 12 giờ ủ độ
chính xác tương đương PCR.
Những nghiên cứu về dịch tể học nhằm tìm hiểu đặc điểm gen của virus gây bệnh đốm
trắng để ứng dụng trong việc xác định con đường lây truyền của WSSV như:
Wongteerasupaya et al., (2003) đã nghiên cứu về dịch bệnh đốm trắng trên 65 mẫu tôm
bệnh từ 55 ao tôm nuôi đã bùng phát bệnh đốm trắng ở Thái Lan bằng phương pháp
PCR-genotyping sử dụng đoạn mồi khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94 để tìm số
vùng lặp lại có kích thước 54 bp. Kết quả cho thấy số lần lặp lại từ 6 đến 20 lần, trong
đó 8 lần lặp lại chiếm nhiều nhất 32%. Bui Thi Minh Dieu et al., (2004) phân tích mẫu
tôm sú nhiễm WSSV từ 8 ao khác nhau ở 7 tỉnh thuộc khu vực Miền Trung và Miền
1
5
Nam Việt Nam để so sánh các dòng WSSV ở Việt Nam với dòng WSSV ở Thái Lan
(WSSV - TH), Đài Loan (WSSV - TW) và Trung Quốc (WSSV - CN). Sử dụng các cặp
mồi được thiết kế dựa trên đoạn gen của WSSV thuộc ORF14/15, ORF24/25, ORF75,
ORF94, ORF125. Kết quả chứng minh các dòng WSSV ở việt Nam có cùng nguồn gốc
với WSSV - TW (Đài Loan) và WSSV - TH (Thái Lan) khi sử dụng 2 cặp mồi
ORF23/24 và ORF14/15, và kết quả này cho thấy ORF75 và ORF125 có ý nghĩa quan
trọng trong việc nghiên cứu dịch tể học của bệnh đốm trắng sau này ở Việt Nam. Tran
Thi Tuyet Hoa et al., (2005) sử dụng phương pháp PCR-genotyping khuyếch đại vùng
lặp lại thuộc ORF94 trên các mẫu tôm nuôi và tôm giống ở Việt Nam. Kết quả nghiên
cứu đã xác định được số vùng lặp lại thuộc ORF94 của WSSV trên tôm giống từ 4 đến
8 và trên tôm nuôi là 4 đến 9 trong đó kiểu gen của WSSV có 7 vùng lặp lại chiếm tỷ lệ
cao nhất. Lê Vân Hải Yến, (2006) sử dụng phương pháp PCR- genotyping khuếch đại
vùng lặp lại thuộc ORF94 để xác định số vùng lặp lại của virus gây bệnh đốm trắng trên
130 mẫu tôm sú thu tại Sóc Trăng, Trà Vinh. Kết quả nghiên cứu cho thấy WSSV có 5,

7, 8, 9, 12 vùng lặp lại thuộc ORF94 trong đó kiểu gen có 8 vùng lặp lại chiếm tỷ lệ cao
nhất trên 50%. Triệu Thanh Tuấn, (2006) cũng sử dụng phương pháp PCR-genotyping
khuếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94 để xác định số vùng lặp lại của virus gây bệnh
đốm trắng trên 169 mẫu tôm sú có dấu hiệu đốm trắng thu ở Cà Mau, Bạc Liêu. Kết quả
nghiên cứu đã nghi nhận được vùng lặp lại thuộc ORF94 của WSSV có từ 4 đến 16
vùng lặp lại, trong đó kiểu gen có 5 vùng lặp lại chiếm tỷ lệ cao nhất (48,8% ở Bạc liêu,
68,4% ở Cà Mau). Pradeep et al., (2007), đã sử dụng ADN ly trích từ tôm hậu ấu trùng,
tôm nuôi có nhiễm WSSV, đồng thời sử dụng cả tôm tự nhiên và cua của Ấn Độ.
Nghiên cứu tìm hiểu sự thay đổi trên các vùng lặp lại của WSSV đã tìm ra trước đây,
bao gồm ORF94, ORF125 và ORF75. Đối với ORF94, có 13 kiểu gen được tìm thấy
với số lần lặp lại từ 2 đến 16. Trong đó lặp lại 7 lần chiếm 11,3%, không có mẫu nào có
số lần lặp lại 11 lần hoặc 15 lần được tìm thấy. Đối với ORF125, có 11 kiểu gen khác
nhau được tìm thấy với số lần lặp lại từ 2 đến 14. Số lần lặp lại được tìm thấy nhiều
nhất là 7 lần chiếm 47,1%, không tìm thấy mẫu nào có số lần lặp lại 6 lần hoặc 13 lần.
1
6
Đối với ORF75 tìm thấy 6 kiểu gen khác nhau của vùng lặp lại. Trong đó các mẫu có
cùng số lần lặp lại trên một ORF thì có số lần lặp lại không giống nhau trên một hoặc cả
hai ORF khác. Từ những kết quả trên cho thấy cả 3 ORF có thể sử dụng để phân tích sự
khác nhau và các dòng đặc trưng của WSSV. Về dịch tể học, ORF94 có vai trò lớn
nhất, sau đó đến ORF125 và ORF75.
Để xác định sự ảnh hưởng của bệnh đốm trắng, và tác hại của WSSV đối với tôm nuôi
thì độc lực của WSSV là điều cần quan tâm. Marks et al., (2005) đã sử dụng kỹ thuật
PCR dựa trên các mồi ORF 14/15 và ORF 23/24 để tiến hành phân lập định danh các
dòng WSSV ở Thái Lan. Kết quả cho thấy dòng WSSV được phân lập vào năm 2005
(WSSV - TH) giống với dòng WSSV được phân lập từ năm 1996 (TH - 96 - II). Đồng
thời, khi tiến hành gây cảm nhiễm trên tôm sú để so sánh độc lực của hai dòng virút
này, cho thấy rằng đối với dòng TH - 96 - II gây chết 50% khoảng 14 ngày còn đối với
dòng WSSV - TH chỉ mất 3,5 ngày. Và nghiên cứu đã khẳng định rằng độc lực của
dòng WSSV - TH cao hơn độc lực của dòng WSSV TH - 96 - II thông qua thí nghiệm

LD50.
Khi xác định được tác nhân gây bệnh, phương thức lây truyền, và những ảnh hưởng của
WSSV thì có nhiều nghiên cứu nhằm khống chế sự phát triển và khả năng gây hại của
WSSV như: Witteveldt et al., (2003) đã sử dụng vacxin chứa vỏ của WSSV để phòng
WSSV. Thí nghiệm đã chỉ ra rằng những tôm sống sót sau khi bị nhiễm WSSV sẽ có tỉ
lệ sống cao hơn khi tái cảm nhiễm. Chúng tôi nghiên cứu khả năng của vacxin cho tôm
thông phương pháp cho ăn, vacxin này chứa protein vỏ của WSSV. Tôm sú (Penaeus
monodon) được cho ăn thức ăn viên áo bên ngòai 1 lớp vi khuẩn không họat động biểu
hiện 2 lọai protein vỏ của WSSV là VP19 và VP28. Vacxin chứa VP28 cho thấy tỉ lệ
chết của tôm thấp hơn có ý nghĩa khi so sánh với lô đối chứng (vi khuẩn chỉ chứa
vector rổng) thông qua phương pháp ngâm (tỉ lệ sống 61%), trong khi đó vacxin chứa
VP19 không thể hiện sự bảo vệ nào. Để xác định sự tấn công và thời gian bảo vệ của
vacxin, thí nghiệm cảm nhiễm được thực hiện sau khi sử dụng vacxin 3, 7 và 21 ngày.
Tỉ lệ sống cao hơn có ý nghĩa được quan sát sau khi tôm sử dụng vacxin 3, 7 ngày
1
7
(64% và 77%), nhưng sự bảo vệ đã giảm sau 21 ngày (tỉ lệ sống 29%). Trái với những
hiểu biết hiện tại, động vật không xương sống không có hệ thống đáp ứng miễn dịch
nhưng kết quả này cho thấy đáp ứng miễn dịch đặc hiệu và khả năng bảo vệ có thể tạo
ra ở P. monodon. Các thí nghiệm trên mở ra con đường mới phòng WSSV mang lợi ích
cho công nghiệp nuôi tôm. Hứa Quyết Chiến, (2004) đã nghiên cứu và sử dụng thành
công việc sử dụng chế phẩm SH'99 trong việc phòng bệnh virut đốm trắng trên tôm sú.
Khi cho tôm ăn liên tiếp chế phẩm SH'99 ngay sau khi thả có thể giúp tôm phòng bệnh
đốm trắng. Sarathi et al., (2007) đã sử dụng vi khuẩn có chứa VP28dsRNA vào trong
thức ăn viên cho tôm ăn để làm giảm khả năng gây hại của WSSV. Có hai phương pháp
được thử nghiệm. Phương pháp thứ nhất là trộn vi khuẩn có chứa VP28dsRNA vào
trong thức ăn viên cho tôm ăn. Phương pháp hai trộn phức hợp mảnh nhỏ VP28dsRNA-
chitosan vào trong thức ăn viên cho tôm ăn. Tôm khoẻ được gây cảm nhiễm bệnh đốm
trắng bằng cách cho ăn tôm bị bệnh đốm trắng. Thí nghiệm được thực hiện trong 30
ngày. Kết quả cho thấy ở những lô tôm nhiễm WSSV có cho ăn dsRNA thì tỉ lệ sống

cao hơn tôm ở lô đối chứng (vi khuẩn chứa véc tơ LITMUS38i không mang đoạn gen
VP28). Tỉ lệ sống của tôm ở nghiệm thức sử dụnh vi khuẩn bất hoạt có chứa WSSV
VP28dsRNA là 68%. Trong khi chỉ có 37% tôm sống sót ở nghiệm thức sử dụng phức
hợp mảnh nhỏ VP28dsRNA-chitosan và 100% tôm chết được ghi nhận ở nghiệm thức
đối chứng. Tôm còn sống cho kết quả xét nghiệm cho âm tính với WSSV bằng phương
pháp PCR và Westnern Blot. Dựa trên kết quả đạt được và những lợi thế của dsRNA
cho thấy có thể ngăn chặn sự nhiễm WSSV ở tôm sú bằng cách cho tôm ăn vi khuẩn
bất hoạt có chứa VP28dsRNA.
2.6Kỹ thuật PCR và các ứng dụng
Kỹ thuật nhân DNA đặc hiệu PCR (Polymerase Chain Reaction) do Kary Mullis phát
minh 1985 đã mở ra cuộc cách mạng trong di truyền học phân tử. Kỹ thuật này là kỹ
thuật hoàn toàn mới trong nghiên cứu và phân tích gen, PCR cho phép tạo ra một số
lượng lớn đoạn DNA cần lựa chọn mà không cần tách và nhân dòng (http://vi.
wikipedia.org/wiki/PCR)
1
8
2.6.1 Quy trình
Quy trình PCR gồm 20 đến 30 chu kỳ. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước:
Bước 1: Nhiệt độ tăng lên 94-96°C để tách hai sợi DNA ra. Bước này gọi là biến tính,
nó phá vỡ cầu nối hydrogen nối 2 sợi DNA. Trước chu kỳ 1, DNA thường được biến
tính đến thời gian mở chuỗi để đảm bảo mẫu DNA và mồi được phân tách hoàn toàn và
chỉ còn dạng sợi đơn. Thời gian: 1-2 phút
Bước 2: Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ thấp xuống để mồi có thể gắn vào
sợi DNA đơn. Bước này gọi là gắn mồi. Nhiệt độ giai đoạn này phụ thuộc vào đoạn
mồi và thường thấp hơn nhiệt độ biến tính 50°C (45-60°C). Sử dụng sai nhiệt độ trong
giai đoạn này dẫn đến việc đoạn mồi không gắn hoàn toàn vào DNA mẫu, hay gắn một
cách tùy tiện. Thời gian: 1-2 phút.
Bước 3: DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống. Nó bắt đầu bám vào và hoạt động dọc
theo sợi DNA. Bước này gọi là kéo dài. Nhiệt độ kéo dài phụ thuộc DNA- polymerase.
Thời gian của bước này phụ thuộc vào cả DNA-polymerase và chiều dài mảnh DNA

cần khuếch đại. ( />2.6.2 Những ứng dụng của PCR
Kỹ thuật PCR được áp dụng cho nhiều lĩnh vực khác nhau. Theo Trần Thị Tuyết Hoa
(2004), kỹ thuật PCR được ứng dụng vào các lĩnh vực sau
Trong thủy sản: (i) Phát hiện nhanh các tác nhân gây bệnh ở dạng tiềm ẩn giúp cho quá
trình chọn lọc cá thể thủy sản có chất lượng tốt trong chọn giống và ương nuôi; (ii)
Chẩn đoán bệnh: điều tra nguyên nhân bùng nổ bệnh và cách giải quyết khi dịch bệnh
xảy ra, đồng thời đề ra hướng ngăn chặn sự xuất hiện của dịch bệnh; (iii) Phòng bệnh
và kiểm soát bệnh: kiểm tra tôm giống và tôm bố mẹ ở các trại giống, kiểm tra tôm
nhập khẩu trước khi cho thả nuôi ở các địa phương.
Trong các lĩnh vực khác: (i) Nghiên cứu khoa học: xác định trình tự đoạn ADN cần
nghiên cứu, phát hiện đột biến, nghiên cứu quá trình tiến hóa phân tử, phục hồi gen tồn
tại hàng triệu năm; (ii) Chọn giống vật nuôi và cây trồng từ đó lựa chọn được những cá
1
9
thể bố mẹ thuần chủng, sạch bệnh trong thời gian ngắn; (iii) Y học và khoa học hình sự:
áp dụng để chẩn đoán chính xác các bệnh nhiễm trùng từ vi rút, vi khuẩn, nấm, chẩn
đoán sớm ung thư và các bệnh do di truyền, xác định huyết thống, truy tìm dấu vết tội
phạm.
2.6.3 Hạn chế
Theo Đặng Thị Hoàng Oanh (2007) phương pháp PCR có những hạn chế sau.
Phương pháp PCR thừơng không hoạt động với những đoạn DNA lớn hơn 3 kb, điều
kiện tối ưu cho phản ứng phải qua thực nghiệm.
Sự ngoại nhiễm là vấn đề cực kỳ quan trọng, nguồn ngoại nhiễm lớn nhất thường là các
sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trước.
Sự sai sót do Taq polymerase, cứ 10.000 nucleic thì enzyme gắn sai 1 nucleic.
PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 01 đến tháng 07 năm 2008.
Các mẫu tôm có dấu hiệu đốm trắng đã được thu từ các huyện Đầm Dơi (2 ao), Phú
Tân (1 ao), Thới Bình (2 ao), Trần Văn Thời (3 ao), và Thành Phố Cà Mau (14 ao),

tỉnh Cà Mau.
Quá trình phân tích mẫu được thực hiện tại phòng thí nghiệm thuộc Bộ môn sinh học
và bệnh học Thủy sản, Khoa Thủy sản, Trường Đại Học Cần Thơ.
2
0
3.2Vật liệu nghiên cứu
3.2.1 Mẫu vật
Tổng số 24 ao tôm sú (20 con/ ao) có dấu hiệu đốm trắng hoặc đỏ thân đã được thu.
Ghi nhận đầy đủ các thông tin như (tên chủ hộ, địa chỉ, ngày thu mẫu, mô hình, ngày
thả giống, nguồn giống, dấu hiệu bệnh lý, tỷ lệ chết, thức ăn, cách thay nước, cải tạo ao
nuôi ) vào phiếu thu mẫu.
Mẫu được trữ trong nitơ lỏng hay trữ lạnh (vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm) và
được trữ trong tủ âm 80
0
C.
3.2.2 Dụng cụ
3.2.2.1 Dụng cụ thu mẫu
Thùng trữ mẫu, bọc nilon, dây thun, viết chì, giấy bóng mờ.
2
1
Bảng đồ hành chính tỉnh Cà Mau
3.2.2.2 Dụng cụ phân tích PCR
Máy vortex, tủ âm 80
0
C, lò vi sóng, máy luân nhiệt, máy ủ, máy li tâm, bộ điện di, máy
chụp hình gel.
Pipet tự động, hộp đựng đầu col, đầu col, ống eppendorf, giá đựng ống eppendorf, ống
đong 100 ml, chai nút mài 250 ml, cốc 250 ml.
3.2.3 Hóa chất
3.2.3.1 Phân tích PCR

Kit IQ 2000-WSSV, TE buffer, Ethanol, Ethidium Bromide, dung dịch diện di TAE
0.5X, Agarose, dNTPs, MgCl
2
, dung dịch đệm, mồi, Taq ADN polymerase, Primer
3.4 Phương pháp Nested-PCR (Theo tài liệu hướng dẫn sử dụng của bộ kit IQ-
2000 WSSV của công ty Farming Intelligene Technology Coperation, Đài Loan)
gồm các bước: ly trích DNA, khuyếch đại DNA, điện di, đọc kết quả.
3.4.1 Qui trình ly trích DNA
ADN được ly trích từ mang tôm sú với bộ chiết tách DTAB - CTAB.
Mang tôm được cho vào ống eppendorf 1,5 ml có chứa 600 ^l DTAB. Sử dụng que
nghiền tiệt trùng để nghiền mẫu mang tôm. Ủ mẫu sau khi nghiền ở 75
0
C khoảng 10
phút, để nguội đến nhiệt độ phòng. Trộn đều bằng máy vortex, ly tâm nhẹ. Sau đó thêm
700 ^l Chloroform, lắc đều 20 giây và ly tâm 12.000 vòng trong 5 phút. Cẩn thật
chuyển phần nước trong ở bên trên sang ống eppendorf 1,5 ml mới, thêm vào 100 ^l
CTAB và 900 ^l nước cất, lắc đều, ủ 75
0
C khoảng 10 phút. Để nguội ở nhiệt độ phòng,
sau đó ly tâm 12.000 vòng trong 10 phút. Bỏ phần nước trên, thêm 150 ^l Dissolve
Solution, ủ ở 75
0
C khoảng 10 phút. Để nguội đến nhiệt độ phòng. Ly tâm 12.000 vòng
trong 5 phút. Chuyển phần dịch trong sang ống eppendorf 1,5 ml mới có chứa 300 ^l
ethanol 95%. Sau đó lắc đều, ly tâm
12.1 vòng trong 5 phút. Rửa ADN bằng 200 ^l ethanol 70%, làm khô ADN trước
khi hoà tan trong 120 ^l TE buffer. Trữ mẫu ADN ly trích ở -20
0
C cho đến khi
phân tích.

2
2
3.4.2 Qui trình khuếch đại
Thành phần hóa chất
Phản ứng PCR bước 1: 8 ^l/phản ứng
Điều kiện phản ứng
Phản ứng PCR được thực hiện 2 bước:
PCR bước 1: Nhiệt độ 94
0
C trong 30 giây, nhiệt độ 62
0
C trong 30 giây, nhiệt độ 72
0
C
trong 30 giây, lặp lại chu kỳ này 5 lần. Tiếp theo, nhiệt độ 94
0
C trong 15 giây, nhiệt độ
62
0
C trong 15 giây, nhiệt độ 72
0
C trong 20 giây, lặp lại chu kỳ này 15 lần. Cuối cùng,
nhiệt độ 72
0
C trong 30 giây, nhiệt độ 20
0
C trong 30 giây.
PCR bước 2: Nhiệt độ 94
0
C trong 20 giây, nhiệt độ 62

0
C trong 20 giây, nhiệt độ 72
0
C
trong 30 giây, lặp lại chu kỳ này 25 lần. Tiếp theo, nhiệt độ 72
0
C trong 30 giây. Cuối
cùng, nhiệt độ 20
0
C trong 30 giây.
3.4.3 Cách chuẩn bị phản ứng
Việc chuẩn bị hỗn hợp cho phản ứng Nested-PCR bước 1 và bước 2 được thực hiện dựa
theo số lượng mẫu cần phân tích. Mỗi lần chuẩn bị mẫu cần có 1 đối chứng dương và 1
đối chứng âm (nước cất)
Bước 1 Cho 8 ^l hỗn hợp thứ nhất cho vào ống eppendorf 0,2 ml đã được làm dấu,
thêm 2 ^l ADN chiết tách hoặc đối chứng. Thực hiện qui trình khuếch đại PCR bước 1.
Bước 2 Sau khi qui trình khuếch đại thứ nhất kết thúc thêm 15 ^l hỗn hợp thứ hai
vào mỗi ống eppendorf chứa sản phẩm của bước 1. Thực hiện qui trình khuếch đại PCR
bước2.
3.4.4 Chạy điện di
Quá trình điện di được thực hiện với dung dịch TAE 0.5X và bản thạch (gel) chứa
1. 5% agarose.
2
3
Chuẩn bị gel: Cân 1.5g agarose vào chai 250 ml thêm vào 100 ml TAE 0.5X, lắc đều và
đun nóng dung dịch bằng lò vi sóng cho tới khi agarose tan hoàn toàn, để dung dịch
nguội khoảng 50 - 60
o
C cho 4^l Ethidium Bromide lắc đều và đổ gel vào khay đã được
gắn lược và dán băng keo ở hai đầu. Khi gel đặc lại, cẩn thận gỡ lược và keo dán ra

khỏi khay đựng gel.
Điện di: Cho gel vào bồn điện di, thêm dung dịch TAE 0.5X vào cho vừa bao phủ gel.
Dùng pipet hút 10^l mẫu phân tích, đối chứng dương, đối chứng âm trộn với một giọt
6X loading Dye cho vào từng giếng, đồng thời ta cho thang DNA để kiểm tra kích
thước sản phẩm. Sử dụng dòng diện một chiều 90V để điện di. Thời gian điện di
khoảng 45 đến 60 phút. Đọc và ghi nhận kết quả với thiết bị chụp ảnh gel (Vilber
Loumart).
3.4.5 Đọc kết quả
Mẫu hiện lên vạch tương ứng 550 bp và 296 bp thì mẫu dương tính với WSSV.
Mẫu chỉ hiện vạch tương ứng 848 bp thì mẫu âm tính với WSSV, đó là DNA của tôm.
3.5PCR-genotyping
3.5.1 PCR-genotyping khuếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94.
(Wongteerasupaya et al., 2003 được tối ưu hoá bởi Trần thị Mỹ Duyên, 2006).
3.5.1.1 Điều kiện phản ứng
Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR-genotyping khuếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94
được thực hiện qua các bước. Trước tiên làm nóng ở 85
o
C trong 15 giây. Ở 94
o
C trong
20 giây, ở 60
o
C trong 20 giây, ở 72
o
C trong 1 phút, lặp lại 40 chu kỳ. Ở 72
o
C trong 10
phút và bước tổng hợp cuối cùng 20
o
C trong 1 phút.

3.5.1.2 Thành phần hóa chất tham gia phản ứng PCR-genotyping (ORF94)
Tổng thể tích cho phản ứng là 50 ^l với các thành phần hoá chất có nồng độ được liệt
kê ở bảng 3.1
Bảng 3.1: thành phần và nồng độ hoá chất thực hiện phản ứng PCR-genotyping
(ORF94)
2
4
Hóa chất Nồng độ phản ứng
PCR Buffer 1 X
MgCl2 1,5 mM
dNTP mix 200 ^M
ORF94-F 25 pmol
ORF94-R 25 pmol
Taq polymerase 2,5 U
AND 1 ^l
Trình tự cặp mồi ORF94
Tên mồi Trình tự mồi
ORF94-F
ORF94-R
5'-TCT-ACT-CGA-GGA-GGT-GAC-GAC-3'
5'-AGC-AGG-TGT-GTA-CAC-ATT-TCA-TG-3
3.5.1.3 Đọc kết quả
Kết quả điện di được ghi nhận bằng thiết bị chụp ảnh gel (Vilber Loumart).
Căn cứ vào thang ADN (1 kb plus ladder) để xác định số lần lặp lại của mẫu phân
tích. Công thức tính số lần lặp lại của trình tự 54 bp: X = x + (54* n)
Trong đó: X là chiều dài sản phẩm
x là số nuceotide từ vị trí gắn mồi đến vùng lặp lại n
là số lần lặp lại của trình tự 54 bp
3.5.2 PCR-genotyping khuếch đại vùng lặp lại thuộc ORF125 (ứng dụng qui
trình được thực hiện trong đề tài của Nguyễn Thị Thúy Hằng, 2008)

3.5.2.1 Điều kiện phản ứng
Đầu tiên ở giai đoạn làm nóng, nhiệt độ 94
0
C trong 3phút, tiếp theo nhiệt độ 94
0
C
trong 30 giây, nhiệt độ 52
0
C trong 30 giây, nhiệt độ 72
0
C trong 1 phút, lặp lại chu kỳ
này 35 lần. Cuối cùng, 72
0
C trong 7 phút.
3.5.2.2 Thành phần hoá chất tham gia phản ứng PCR-genotyping (ORF125)
Tổng thể tích cho phản ứng là 25 ^l với các thành phần hoá chất có nồng độ được liệt
kê ở bảng 3.2.
Bảng 3.2: thành phần và nồng độ hoá chất thực hiện phản ứng PCR-genotyping
(ORF125)
Hóa chất Nồng độ phản ứng
2
5